Streptomyces globisporus SP6C4 미생물 제형의 딸기 흰가루병과 꽃곰팡이병의 방제효과 검증

서 론

딸기(Fragaria x ananassa Duch.)는 전세계적으로 널리 재배되는 작물이며 국내 재배면적은 6,462 ha, 생산량은 234,225톤, 생산액이 1조 5,090억 원으로 과채류 생산액의 28.9%로 1위를 차지하여 농가 소득의 매우 중요한 작물이다(KOSIS, 2019). 현재 국내에 지배되고 있는 딸기 주요 품종으로는 설향, 매향, 죽향, 싼타로 전체 국내 딸기 재배의 96%를 차지하고 있으며, 그 중 설향 품종이 87.7%로 가장 많은 비중을 차지하고 있다. 시설재배 딸기의 주요 지상부 병해로서는 탄저병(Collectotrichum gloesporioides), 흰가루병(Sphaerotheca aphanis), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 꽃곰팡이병(Cladosporium cladosporioides) (Kim et al., 2015; Kahramanoğlu et al., 2022; Jacobs et al., 2019; Nam et al., 2015a) 등이 있으며, 지하부의 주요 병해로서는 Phytophthora fragariae에 의해서 발생하는 역병, Fusarium oxysporum f. sp. fragariae에 의해 발생하는 시들음병(위황병) 등이 딸기 생산에 큰 피해를 끼치고 있다(Kim et al., 2015; Kwon et al., 2020).

딸기 꽃곰팡이병은 미국 캘리포니아에서 처음 보고되었으며(Gubler et al., 1999), 한국에서는 2015년에 보고가 되었다(Nam et al., 2015b). 꽃곰팡이병은 병의 확산이 빨라 방제가 어려우며, 꽃의 수정 불량을 야기하여 기형과 발생의 한 원인으로 알려져 있다(Nam et al., 2015b). 꽃곰팡이병은 주로 암술과 꽃받침에서 발생하며 암술머리 부분에 회색 곰팡이가 발생하고 감염이 심한 경우 꽃 전체가 검게 마르면서 썩게 된다(Santos et al., 2020). 꽃곰팡이병을 방제하기 위해 흰가루병과 탄저병에 등록된 약제를 예방차원 살포하여 대체하는 경우가 대부분이다(Nam et al., 2015b). 딸기꽃곰팡이병에 대하여서는 뚜렷한 방제법이 확립되어 있지 않아, 딸기 생산에 어려움을 겪고 있는 실정이다.

딸기 품종 중 ‘설향’은 다른 품종에 비해 비교적 내병성으로 알려져 있지만 육묘 초기와 수확 후기에 잎과 과실에서 흰가루병의 발생이 지속적으로 증가하고 있다(Nam et al., 2009). 흰가루병은 활물기생균으로 다양한 작물에 발생하며, 잎과 과실에서 주로 발병한다(Shin et al., 2020). 과실에서는 표면에 하얀 이슬 같은 균총을 형성하며, 미숙과에서 발생하였을 때 균총이 있는 부위에서는 생육을 저하시키며 과실 모양이 비뚤어져 상품가치를 현저하게 저하시킨다(Pertot et al., 2008). 딸기 흰가루병은 주로 화학농약으로 방제하고 있지만 약제에 대한 내성병원균의 출현으로 방제에 어려움을 겪고 있다(Shin et al., 2020). 화학적 방제의 경우 재배환경에 따라 약해가 발생하기도 하며, 농약 잔류 문제로 인해 소비자들의 친환경 농산물에 대한 선호도가 증가하면서 인축 독성이 낮고 잔류 문제가 적은 생물농약의 개발이 요구되고 있다(Sharma and Singhvi, 2017). 이러한 문제점을 해결하기 최근 자연계에 존재하는 미생물을 이용한 미생물제 제 개발 및 연구가 이루어지고 있다(Park et al., 2018).

유용 미생물은 작물의 생장 촉진, 품질향상 및 병해충 방제 등과 같은 다양한 목적으로 활용이 시도되고 있으며, 농업현장에서 사용될 수 있도록 실용화 기술 개발이 진행되고 있다(Naik et al., 2020). 미생물제제로 활용되는 주요 균주는 고초균(Bacillus spp.), 녹농균(Pseudomonas spp.), 방선균(Streptomyces spp.) 등이 있으며, 최근 다양한 2차 대사산물을 생산하는 것으로 알려져 있는 방선균의 농업적 활용연구가 활발히 이루어지고 있다(Ramakrishnan et al., 2011; Zamoum et al., 2017). 방선균은 다양한 항균 물질생산, 분비를 통해 병원균의 성장 억제 및 살균 작용을 나타내며 기주의 병해에 대한 피해를 경감시키는 효능이 알려져 있다(Horinouchi and Beppu, 1992).

본 연구는 선행연구를 통해 딸기 꽃곰팡이병에 대해 우수한 항진균력을 가지는 S. globisporus SP6C4(Kim et al., 2021)의 제형화를 통해 딸기 꽃곰팡이병과 흰가루병을 대상으로 딸기 재배 현장에서의 방제 효과를 평가하기 위해 수행되었다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

배지별 SP6C4 제제의 항균 활성 검증

72종의 배양 배지별 시료 모두 B. cinerea, C. gloeosporioides, F. oxysporum, P. cactorum에 대하여 일정 수준이상의 항균활성 효과를 보였다(data not shown). 또한 S. globisporus SP6C4는 선행 연구된 결과와 유사한 항균활성을 띄는 것을 확인하였다. SP6C4 균주는 F. oxysporum과 B. cinerea에 대해 강력한 항진균력을 가진 것으로 보고가 되어 있기에(Cha et al., 2016; Kim et al., 2019), F. oxysporum에서 가장 높은 항진균력을 가진 시료를 선발하여 그 중 상위 10개의 시료는 J5-1, J5-2, J6-2, M1-2, M3-2, P2-1, S2-1, T1-1, T2-1, T3-2으로 선발하였다(Table 1).

Table 1.

Top 10 antifungal activity rate for 72 different medium formulations

SP6C4미생물 제형 형태에 따른 항균활성 검증

액상과 분말 형태로 제작된 미생물의 항균활성 능력을 검증하고자 4종의 식물 진균성 병원균과 대치 배양을 진행하였다(Fig. 1). 액상제형의 SP6C4는 각 병원균에 대하여 다음과 같은 항진균력을 나타내었다: B. cinerea (44.5%), C. gloeosporioides (66.6%), F. oxysporum (56.6%), P. cactorum (72.7%). 분말제형은 B. cinerea (55.1%), C. gloeosporioides (69.2%), F. oxysporum (54.9%), P. cactorum (78.45%) 병원균의 생장을 효과적으로 억제하였다. 이를 통하여 두 가지 제형으로 제작된 S. globisporus SP6C4 미생물은 4종의 식물 병원균에 대하여 생장 억제 효과를 보였으며 액상 형태와 분말 형태 간에 유의미한 차이는 보이지 않음을 확인하였다. 두 가지 제형에서 뚜렷한 항균활성이 확인되었기에 S. globisporus SP6C4의 액상 제형과 분말 제형은 미생물 제제 연구개발에 활용 가능성을 확인하였다.

Fig. 1.

Antifungal activity test of Type A (AS, liquid) and Type B (SM, powder) S. globisporus SP6C4 formulations against the B. cinerea, C. gloeosporioides, F. oxysporum, and P. cactorum by disk diffusion assay. Formulations (106 cfu/mL) were pre-inoculated with 20 μL of PDK media and incubated for 5 days at 28 ºC. After 10 days, a pathogen (0.4-cm diam.) was inoculated at the center of the plate and incubated at 28ºC for 10 days (n = 3).

SP6C4미생물 제제의 온도별 경시 변화 조사

제형 형태에 따라 S. globisporus SP6C4의 경시 변화 조사하기 위해 저온(0 ± 2^oC), 상온(24 ± 2^oC), 고온(54 ± 2^oC)를 보관 온도로 하여 4주간 보존율을 확인하였다. 액상 제형은 저온(0 ± 2^oC) 보관에서 평균 10⁹ cfu/g으로 유지가 되었으며, 상온(24 ± 2^oC)에서는 1주차 까지 생균수가 평균 10⁹ cfu/g 유지되었다. 액상 제형의 보관은 저온(0 ± 2^oC)에서 4주 경과 후에도 90%이상의 보존율을 확인하였다(Fig. 2). 하지만 2주차부터 SP6C4의 밀도가 급격히 저하되었다. 또한 고온(54 ± 2^oC)에서는 1주차부터 생균수가 유지되지 않았다(Fig. 2).

Fig. 2.

Stability and conservativeness of Streptomyces globisporus SP6C4 liquid (Type A) and powder (Type B) formulations under different storage conditions. The formulations were incubated at different temperatures for 4 weeks. Low temperature, 4 ± 2ºC; Middle temperature, 24 ± 2ºC; High temperature, 52 ± 2ºC. Welch’s t-Test and bar graph were calculated with the ggplot2 package of the R (4.0.3).

분말 제형은 액상 제형과 동일한 온도에서 미생물제형의 안정성 평가를 진행하였다. 저온(0 ± 2^oC), 상온(24 ± 2^oC), 고온(54 ± 2^oC)에서 각각 평균 10⁹ cfu/g의 생균수가 조사되었으며, 초기 분말 제형은 4주 경과 후에도 모든 온도에서 90%이상의 보존율을 나타냈다(Fig. 2). 분말 제형은 모든 온도에서 90% 이상 보존율을 확인하였지만 액상 제형은 상온과 고온에서 생균수가 유지되지 않는 것을 확인하였다. 두가지 제형 형태의 온도에 따른 차이를 확인하기 위해 Welch’s t-Test를 통해 분석하였을 때, 상온과 고온에서 제형의 형태별 생균수의 차이가 유의한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 액상 제형이 고온에서 제형의 색상의 변화로 인해 발생한 결과라고 여길 수 있으며, 본 결과를 통해 분말 제형이 이후 실험에 사용이 적합하다고 판단하였다(Fig. 3).

Fig. 3.

Effect of temperature on the storage stability of two microbial formulations. (A): Condition of before application, (B): Condition of after application, (C): Concentration of after application, colony-forming units in PDK media. The formulations were incubated at different temperatures for 4 weeks. Low temperature, 4 ± 2ºC; Middle temperature, 24 ± 2ºC; High temperature, 52 ± 2ºC.

분말 제형을 이용한 작물의 약해 시험

제작된 S. globisporus SP6C4의 분말 제형의 경엽 살포에 따른 딸기에 대한 약해 유무를 확인하였다. 경엽 살포 후 7일 경과 뒤 작물의 경엽의 외관상 약해 유무를 조사한 결과, 옆의 붉은색 반점 여부, 경엽의 고사여부 및 기타 발육 생육상태 불량과 같은 약해 증상은 나타나지 않았다(Fig. 4). 또한 처리를 하지 않은 무처리구와 비교를 하였을 때 차이가 나지 않음을 확인하였다. 이를 통해 미생물 제형을 현장적용 하는데 있어 작물에 대한 약해가 발생하지 않음을 확인하였다.

Fig. 4.

Evaluation of phytotoxicity of Type A (AS-liquid) and Type B (MS-powder) formulations on strawberries. (A): Control treated, which was non-treated the microbial formulations. (B): Type A (AS) treatment. (C): Type B (MS) treatment.

분말 제형의 딸기 흰가루병, 꽃곰팡이병 약효 검증을 위한 포장실험

딸기에서 발생되는 흰가루병은 기주식물을 고사시키지 않지만, 생장의 불균일, 양분 탈취 등을 통해 품질 및 생산량을 감소시키는 것으로 여겨진다(Lee et al., 2018). 그리고 꽃곰팡이병은 발생된 꽃의 80% 이상의 기형과 발생율을 보이는 것으로 알려져 있다(Nam et al., 2015a). 이에 S. globisporus SP6C4균주의 분말 제형을 이용한 흰가루병과 꽃곰팡이병 방제 효과 시험을 통해 딸기의 주요 병해에 대한 미생물제제로서 가능성을 확인하고자 하였다. 먼저, 흰가루병의 병징이 확인된 딸기에 처리하였을 때, 3일차에서는 두 처리구 모두 대조구 대비 유사하게 보였지만, 7일차, 10일차에서는 1회 처리구와 3회 처리구 모두에서 처리를 하지 않은 대조구에 비해 높은 효과를 나타내었다(Fig. 5. A - C). 3회 처리구에서 10일차에 약제처리구에서는 발병도가 1 이하였으나, 무처리구에서는 발병도 4가 관찰되었다. 꽃곰팡이병 또한 처리구에서 대조구 보다 높은 방제 효과를 보였다(Fig 5. D - F). 3회 처리구에서 10일후 꽃곰팡이병의 발병도는 무처리구에서 50% 이상 발병하였으나, 처리구에서는 7% 미만으로 발병되었다. 각 처리구별 유의성을 확인하기 위해 Kruskal-Wallis Rank Sum Test를 진행하였고, 결과 값으로 P 값이 두 병해에서 0으로 0.05보다 낮은 값을 나타내 처리구별 차이를 가진다고 확인하였다. 그리고 사후 분석으로 Tukey HSD (Tukey’s honestly significant difference test)를 통해 분석하였을 때 미생물 제제를 처리 유무에서 P 값이 0.001보다 낮은 것으로 확인하여 미생물 제제를 사용한 처리구와 처리하지 않은 처리구가 차이가 유의미한 것을 확인하였다(Fig. 5. C and F). 이를 통해 S. globisporus SP6C4 미생물 제제의 적용대상 작물병의 확장 가능성을 넓힐 가능성을 확립하였다.

Fig. 5.

Biological control effect by Type B (MS) formulations against Powdery mildew and Blossom blight in the field. (A): Powdery mildew on leaves, (B): Powdery mildew symptom on the stem, (C): Effect of formulations on powdery mildew, (D): Blossom blight on flower, (E): Blossom blight symptom on fruit, (F): Effect of formulations on blossom blight (n = 30 in each block, three randomly designed). The low incidence of blossom blight was < 20%, and the high incidence was 21 to 30%. And Powdery mildew disease was translated into disease index levels from 0 to 5 as follows: 0 for 0%, 1 for 2-10%, 2 for 11-25%, 3 for 26-50%, 4 for 51-75% and 5 for up to 76%. Boxplot with Kruskal-Wallis Rank Sum Test and Tukey’s honestly significant difference test were calculated with the ggplot2 package of the R (4.0.3).

첫 번째 포장실험을 통해 미생물 제제 무처리구 보다 처리구에서 두 병에 대해 억제하는 효과를 확인하였다. 이러한 효과를 재검증하기 위해 재진행하였고, 꽃곰팡이병에서 첫 번째 실험과 유사한 결과값을 확인하였지만(Fig. 6), 재검증 기간동안 흰가루병에 대해서는 병 발생 시기와 맞지 않아 흰가루병의 병징을 포장에서 확인하지 못하였다. 이로인해 흰가루병에 대한 재검증은 불가능하였지만 Fig. 5의 A - C의 흰가루병에 대한 in vivo 실험을 통해 친환경적인 농업 미생물제제로의 가능성을 확립하였고, 향후 지속적인 연구개발 및 농가 현장 적용을 통해 친환경 미생물 농약으로 가치를 구축할 예정이다.

Fig. 6.

Biological control effect by Type B (MS) formulation against blossom blight in the fields. (A): Result of blossom blight one time treated, (B): Result of blossom blight triple times treated (n = 30 in each block, three randomly designed). The low incidence of blossom blight was < 20%, and the high incidence was 21 to 30%. Boxplot with Student’s t-test and Tukey’s honestly significant difference test were calculated with the ggplot2 package of the R (4.0.3).

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청의 연구과제(PJ016437)의 지원으로 수행되었습니다.

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