Current Issue

Chlorpyrifos (99%)는 technical grade로 (주)한국삼공(Seoul, Korea)에서 제공 받아 사용 하였으며, TCP (99.8%), HCl (37%), N-methyl-N-(tert.-butyldimethylsilyl) trifluoroacetamide (MTBSTFA, 97%), 2,6-dibromophenol (99%) 등 모든 시약은 sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

시험에 사용된 동물은 7주령의 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐를 Koatech (Gyeonggi-Do, Korea)로 부터 구입하여 사용하였다. 시험 전 일주일간 순화기간을 거쳤으며, 온도 23 ± 2 ^oC, 습도 50-60 %의 조건에서 사육하였다. 처리군별로 11마리의 실험동물을 사용하였으며, 전 시험기간 동안 자유급식 하였다.

시험 농약의 노출 수준은 우리나라 농작업자가 사과작물에 CPF 유제 20%를 살포할 때 실제 노출되는 수준으로 선정하고자, 우리나라 농작업자 농약 노출량 산출모델인 KoPOEM을 통해 계산하였다. 시험에서는 실제 노출량을 저농도군 (1.005 mg/kg bw)으로 하고 공비 10을 두어 중간농도군 (10.05 mg/kg bw)과 고농도군 (100.05 mg/kg bw)를 선정하였다. 노출 횟수는 사과 작물의 CPF 유제 20% 안전사용기준에 따라 7일간격 3회를 선정하였고, 노출 시간은 KoPOEM에서 적용하는 1일 노출시간에 따라 6시간 노출하였다.

시험물질은 corn oil에 녹여서 사용하였으며 노출농도 및 투여용량은 노출 직전 흰쥐의 체중으로 환산하여 적용하였다. 경피 투여를 위해 4×4 cm의 거즈에 시험물질을 균일하게 처리하여 비자극성 테이프로 고정하였으며, 노출시간 종료 후 멸균증류수로 피부에 남아있는 시험물질을 제거하였다. 매 노출 직후, 그리고 마지막 노출 7일 후 24시간 동안의 뇨 시료를 채취하고, 분석 전까지 -70^oC에서 냉동 보관하였다.

뇨 중 TCP 분석은 Chuang 등(2004)의 방법에 따라 다음과 같이 처리하였다. 뇨 시료 1 mL에 내부표준물질(2,6-Dibromophenol) 50 μL (0.5 μg/mL)와 HCl (12 N) 100 μL를 각각 첨가 한 뒤 80^oC에서 1시간 동안 가수분해 하였으며, 20% NaCl 1 mL와 chlorobutane 1 mL를 각각 첨가하고 20분간 진탕 추출하였다. 추출액을 원심분리 후 상층액을 질소가스로 완전히 건조 한 후, Acetonitrile 30 μL과 MTBSTFA 10 μL 첨가한 뒤 70^oC에서 45분 동안 유도체화시켰다.

분석기기는 6890 Gas chromatography에 5973 Mass spectrometry (Agilent, Santa Clara, USA)울 연결한 GC/MSD를 사용하였으며, 분석시료 1 μL를 splitless mode로 주입하였다. 컬럼은 DB-5 (30 m × 0.32 mm × 0.5 μm)을 사용하였으며 운반기체로는 He을 유속 2 mL/min으로 설정하였다. 주입기 온도는 280^oC로 하였으며, 오븐 온도는 초기 60^oC 이후 1단계 1분 유지 후 분당 30^oC씩 180^oC까지, 2단계 분당 10^oC씩 220^oC까지, 3단계 분당 60^oC로 최종 280^oC까지 상승시킨 후 1분 동안 유지하였다.

정량분석을 위해 selected ion-monitoring (SIM) mode을 이용하였으며, TCP와 IS의 머무름 시간(retention time)은 각각 8.02, 9.06 분에서 관찰되었다. 기기분석의 유효성을 확인하기 위해 무처리된 뇨 시료에 TCP를 9.38 μg/mL이 되게 첨가하여 분석법의 정확성(accuracy, %)과 정밀성(precision, %)을 확인하였다.

뇨 중 대사체의 정량을 위해서는 creatinine으로 보정하는 방법이 사용되고 있으며(Kim et al., 2015), 뇨 중 creatinine 분석은 Jaffe Method를 근거로 Kim 등(2017)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. Creatinine 표준용액, blank 및 희석된 뇨 시료를 96 well plate에 각각 50 μL/well씩 첨가한 후, 0.3 N NaOH과 1% picric acid을 1:1의 비율로 혼합한 반응 용액을 100 μL/well씩 첨가하였다. 15분동안 상온에 방치한 후, 480 nm 파장 조건에서 Multiskan microplate reader (Thermo Scientific, Vantaa, Finland)로 흡광도를 측정하였다. 시험은 3반복 수행하였다

CPF의 반복 노출에 따른 흡수율(%)을 산출하고자 실제 농업현장의 노출농도인 저농도 처리군에 대해서 매 노출 후 24시간 동안의 TCP 배설량에 뇨 부피를 적용하여 누적 TCP량(μg)을 구하고, 이를 CPF/TCP의 분자량 비율을 적용하여 CPF로 환산하였으며, 실제 처리된 양과의 비율을 구하여 흡수율로 하였다(Meuling et al., 2005).

매 노출에 따른 CPF의 일일흡수용량(Absorbed daily dose, ADD)을 구하기 위하여 아래와 같이 Phung et al. (2012)의 산출식을 적용하였다. CF는 CPF의 70%가 뇨 중 TCP로 배설된다는 선행연구 결과에 근거하여 10/7에 해당하는 1.4를 적용하였다(Nolan et al., 1984).

ADD (μg/kg/day)=C×Cn×CF×RmwBW

C : 일일 TCP 배설량(μg/g creatinine), Cn : 일일 creatinine 배설량(g/day), CF : 보정 계수(correction factor 1.4), R_mw : CPF/TCP 분자량 비, BW : 체중(Body weight)

ADD 값에 대해 확률적 분포를 적용하기 위하여 Crystal ball software ver.11.1.2.4l (Oracle, Vallejo, US)를 이용하였으며, 24시간 동안의 검출치에 대한 누적 확률로 CP (cumulative probability, %)를 구하였다. 위해성평가에 적용하기 위하여 ADD의 중앙값과 극단값 산출을 위하여 분포의 중앙값(median)과 상위 5% 값(95%tile)을 채택하였다.

CPF 노출량에 따른 위해지수(hazard quotient, HQ)는 농작업자에 대한 급성 독성기준치를 근거로 하여 독성기준치 대비 노출량으로 산출하였으며, 위해도의 중앙값(median)인 HQ₅₀와 극단노출값(95%tile)인 HQ₉₅으로 나누어 계산하였다. 최종적으로 HQ가 1.0 이상인 경우 노출에 따른 영향이 있는 것으로 판단하였다(Atabila et al., 2018a)

통계 처리는 SPSS ver. 20 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 이용하였으며, 시험군 간 차이 검증을 위해 one-way ANOVA (analysis of variance)를 실시하였다. 사후 검증으로 Duncan’s test를 수행하였으며 유의수준 0.05에서 유의성을 검증하였다. CPF 노출 수준과 뇨 중 3-PBA 배설량 변화의 상관성은 회귀분석(regression analysis)을 통해 확인하였다.

무처리된 뇨 시료를 이용하여 TCP를 분석하여 얻은 검정곡선 y = 9.76x − 0.24(r² = 0.9962)을 통하여 CPF를 반복 노출한 흰쥐의 뇨 중 TCP 배설량을 계산하였다. GC/MSD를 통한 본 분석법의 유효성을 확인하기 위해 TCP 농도가 9.38 μg/mL가 되도록 제조하여 시험법의 정확성과 정밀도를 확인하였다.

시험결과 본 시험의 정확성(%)을 나타내는 회수율(recovery, %)은 93.4-111.9%의 범위였으며, 정밀성(%)인 coefficient of variation (CV)는 3.8-6.8로 나타나, EU 가이드라인(2011)에 따른 기준인 정확성(70-120%)과 정밀성(≤ 20%)을 충족하였다.

CPF는 7일간격으로 저(1.01 mg/kg), 중(10.05 mg/kg), 고농도(100.50 mm/kg)로 경피를 통해 3회 반복 노출한 시험군의 매 노출 후 24시간 동안, 그리고 최종 노출 1주일 후의 24시간 동안 뇨를 통해 배설된 TCP 양을 creatinine으로 보정한 결과는 Table 1과 같다.

실제 농업현장의 CPF의 노출수준인 저농도군의 뇨 중 TCP 배설량은 1회 노출후 24시간 동안 190.12 ± 70.67 μg/g creatinine이었으며, 2회 노출 후에도 110.94 ± 28.43 μg/g creatinine으로 유의적인 차이가 없었다. 그러나, 이는 3회 노출 후 24시간 동안 48.88 ± 13.01 μg/g creatinine으로 유의 적으로 감소하였으며, 최종 노출인 3회 노출 후 7일째에 24시간동안 채취한 뇨 시료에서 2.81 ± 0.64 μg/g creatinine으로 3회 노출 직후에 비해 보다 유의적으로 감소하여 대조군과 유사한 수준에 도달하였다(p<0.01). 저농도군의 10배로 노출된 중농도 시험군의 뇨 중 TCP 배설량은 저농도 시험군의 배설량 변화와 유사한 경향을 보였다. TCP는 체내의 소실 반감기가 27시간이라는 선행연구(Nolan et al., 1984)의 보고에 근거했을 때, CPF의 노출에 따른 뇨 중 TCP가 매 노출 후 24시간동안 대부분 배출된 결과로 생각된다.

저농도군의 100배로 노출된 고농도 시험군에서는 CPF의 1회 노출 후 24시간 동안 뇨를 통한 TCP가 12,037.67 ± 6,060.38 μg/g creatinine 수준으로 배설되었으나, 2회 노출 후 5,242.18 ± 3,196.75 μg/g creatinine으로 유의적으로 감소하였다. 따라서, 노출농도가 증가할수록 노출횟수가 반복되면 뇨 중 TCP 배설량의 감소폭이 상대적으로 빨리 나타나는 것을 알 수 있다.

Table 1의 뇨 중 TCP 배설량의 변화를 매 노출에 따른 시간 추이로 도식화 한 결과(Fig. 1)에서도 CPF의 노출농도가 증가할수록 상대적인 뇨 중 TCP의 감소폭은 증가하였으며, 본 시험의 최종 노출인 3회 노출 7일 이후 뇨를 통한 TCP의 배설이 저농도군과 중농도군 모두 대조군 수준으로 감소한 것을 알 수 있다. 고농도군은 실제 농업현장의 노출농도의 100배에 해당하는 매우 높은 수준의 노출농도이며, 반복횟수를 보다 늘릴 경우 뇨 중 TCP의 배설은 대조군 수준으로 감소할 것으로 예상된다.

Fig. 1. 
Time courses of urinary TCP excretion in rats following the repeated dermal exposure to chrorpyrifos ; Each plot represents the mean ± S.D of 11 animals.

CPF의 경피 노출농도와 뇨 중 TCP의 배설량과의 상관관계를 CPF 노출농도군별로 살펴본 결과는 Fig. 2와 같다. 저농도, 중농도 및 고농처리군에서 농도의존적 상관성(r²)이 각각 0.7627, 0.6774 및 0.8618로 높은 상관성을 보였다. 이는 뇨 중 TCP 검출결과를 이용해 CPF의 피부노출량에 대한 예측능이 높을 수 있음을 의미하는 것으로 생각된다.

Fig. 2. 
Correlation between dermal exposure to chlorpyrifos and urinary 3-PBA excretion in rats ; 1^st (A), 2^nd (B) and 3^rd (C) exposure to chlorpyrifos.

한편, 국외 농작업자에 대한 선행연구 결과 살포 후 24시간 동안 뇨 중 TCP 배설량이 베트남(N=18)에서 평균 47.5 μg/g creatinine, 미국(N=34) 10.5 μg/g creatinine로 보고되었다(Alexander et al., 2006; Phung et al., 2012). 본 연구결과에서 국내 농작업자 노출수준인 저농도군에서 3회 노출직후 뇨를 통한 TCP 배설량이 48.88 ± 13.01 μg/g creatinine으로 감소하였으며, 10배 높게 노출된 중동도군에서도 3회 노출 7일 후 8.72 ± 6.34 μg/g creatinine으로 감소하여, 베트남 및 미국의 농작업자의 수준과 유사함을 알 수 있다.

CPF는 체내 흡수된 후 대부분 뇨로 배설된다는 선행연구(Tanvir et al., 2016)에 근거해 실제 농업현장의 노출농도인 저농도 처리군에 대해서 노출된 CPF의 흡수량을 환산한 결과는 Table 2와 같다. 저농도 처리군의 매 반복 노출에 따른 뇨 중 TCP의 배설량에 근거한 CPF의 흡수율이 1회 18.81%, 2회 10.10%, 3회 4.20%로 노출 횟수가 증가할수록 감소하는 것을 알 수 있다.

선행연구 결과, 인체의 뇨 중 TCP 분석을 통한 CPF 피부흡수에 관한 연구에 따르면, 50 μg/cm² CPF를 피부에 4시간 처리시 4.3%의 흡수율을 나타내었으며(Meuling et al., 2005), 인체를 대상으로 한 CPF 피부 흡수 시험에서도 노출량의 1-1.3%가 흡수되는 것으로 보고(Nolan et al., 1984; Griffin et al., 1999)하여, 본 연구의 흡수율과 유사한 수준임을 알 수 있다.

Phung et al. (2012)의 산출식을 이용하여 CPF의 노출에 따른 일일흡수용량(Absorbed daily dose, ADD)을 산출한 결과, 1회 노출 직후 22.51 ± 8.65 μg/kg/day에서 2회 노출 직후 11.87 ± 3.1 μg/kg/day, 3회 노출직후 5.64 ± 1.63 μg/kg/day로 점차 감소하였다(Table 3). 또한, ADD 값들에 대해 확률적 분포를 적용하여 중앙값(CP₅₀)과 상위5%인 극단값(CP₉₅)을 선정한 결과, CP₅₀ 및 CP₉₅가 각각 5.31~18.08 μg/kg/day 및 8.20~35.32 μg/kg/day의 범위를 보였다.

본 연구에서 실제 농업현장에서 농작업자 노출되는 수준인 저농도군의 ADD를 선행연구(Alexander et al., 2006; Phung et al., 2012; Atabila et al., 2018b)와 비교한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 베트남, 가나 및 미국 농민의 뇨를 통한 TCP 배설량을 이용해 예측된 CPF의 ADD 중간값이 각각 9 μg/kg/day (rang : 0.4-94.2 μg/kg/day), 6 μg/kg/day (range : 0.7-74 μg/kg/day), 2.5 μg/kg/day(range : 0.7-26 μg/kg/day)이었으며, In vitro 쥐 피부모델 연구(Kim et al., 2016)에서 우리나라 농작업자 노출수준으로 CPF를 처리한 경우 노출양은 12 μg/kg/day이라고 보고하였다.

Fig. 3. 
Comparison of chlorpyrifos Absorbed daily dose (ADD) among applicators in various countries and this study, adapted from Phung et al. (2012).

본 연구에서 흰쥐를 이용한 CPF에 대한 경피 노출 직후 ADD가 5.64~22.51 ug/kg/day의 범위를 보임에 따라, 개인보호장구 미착용 비율이 높아 농약 노출량이 많은 것으로 보고된 바 있는 이집트를 제외하고(Farahat et al., 2010), 베트남, 가나 및 미국 농민에 대한 결과와 유사한 수준으로 나타났다. 따라서, 본 연구에서 흰쥐를 이용한 뇨 중 TCP 검출결과를 통한 CPF 노출의 예측이 실제 인체의 생체시료를 이용한 바이오 모니터링 결과를 이용한 예측과 유사한 결과를 보임을 확인할 수 있었다.

뇨 중 TCP 검출결과를 이용한 CPF의 위해성평가를 위해 ADD를 WHO (100 μg/kg/day) 및 호주의 APVMA (10 μg/kg/day)에서 설정한 CPF의 급성 농작업자노출허용량 기준으로 나눈 중앙값(HQ₅₀) 및 극단값(HQ₉₅)은 Table 4와 같다. WHO 독성기준치(WHO, 2009)에 근거한 HQ₅₀ 및 HQ₉₅는 0.05-0.35의 범위로 모두 1 이하로 나타나나, 중간노출수준과 상위 5% 노출수준에서도 건강에 유해한 영향을 주지 않는 것으로 판단되었다. 농작업자들을 대상으로 한 선행연구결과에서도 가나는 HQ₅₀ (0.08) 및 HQ₉₅ (0.8) (Atabila et al., 2018b), 베트남은 HQ_mean (0.2) 및 HQ_max (0.9) (Phung et al., 2012)으로 본 연구의 결과와 유사한 수준을 보였다.

반면 APVMA (2009)은 WHO (2009)보다 10배 낮은 기준으로 권고되어 1회 노출 시 HQ₅₀ (18.08), HQ₉₅ (3.53)으로 기준치 이상으로 나타났으나, 노출 횟수가 증가할수록 위해도가 감소하여 3회 노출 후 HQ₅₀ 0.53, HQ₉₅ 0.82로 기준치 이하로 감소하였다. 이상의 결과를 토대로, 농약을 반복적으로 사용하게 되는 농가현실을 고려할 때 우리나라 CPF의 노출은 안전한 수준임을 확인할 수 있었다.

Kim 등(2016)에 따르면 피부에 처리된 CPF는 표피에 그대로 남으며, 각질층(stratum corneum)과 표피/진피층(epidermis/dermis)에 축적되는 것으로 보고되었다(Moore et al., 2014). 피부를 통한 농약의 노출은 주된 농작업자의 노출경로로 농작업자가 실제 농업현장에서 노출될 수 있는 저농도의 농약에 반복 노출되는 경우 인체의 생체시료의 대사체 분석을 통해 신속히 농약의 노출량을 예측함으로써 농약을 사용하는 농작업자에 따른 안전성을 확보할 수 있을 것이다. 본 연구의 결과는 농업현장의 농작업자에 대한 생체시료를 이용하여 대사체인 TCP 배설량 분석값을 통해 급성적인 농약 노출량을 예측하기 위한 기초자료가 될 것으로 생각된다.