Current Issue

식물병 방제제로 사용할 혼합제형물은 B. amyloliquefaciens PPL 배양상등액과 식물추출 농자재들을 이용하여 제조하였다(Kang et al., 2019). MBP 배지(5% peptone, 5% casamino acid, 1% mung bean extract, 0.1% yeast extract, 0.3% vegetable oil, 0.1% NaCl, 0.1% egg yolk, w/v)에서 28^oC, 120 rpm으로 5일 진탕 배양한 B. amyloliquefaciens PPL (1 × 10⁷ cfu/ml)은 0.2 μm membrane filter (Millipore Filter Corp., Bedford, MA, USA)로 여과하여 균을 제거하고 사용하였다. 식물추출물은 님(azadirachtin 0.75%) 오일, 데리스(rotenone 0.05%), 담배 잎 추출물(nicotine 2.2%)의 원재를 구입(그린포커스, 화성, 경기) 사용하였다. 미생물 상등액과 님:데리스 혼합물(NR) 또는 담배 잎 추출 혼합물(TB) 2종을 이용하여 생물 검정에 사용하였다. 각 제형물의 혼합 농도와 살포농도는 미생물 상등액 10~30% (v/v)를 기본함유량으로 사용하면서 님과 데리스 2% (v/v)를 혼합한 NR과 담배 잎 추출물(nicotine) 2% (v/v)를 혼합한 TB를 각각 혼합한 제형을 각 농도별로 희석하여 살포하였다.

각 혼합제형물의 항균활성을 측정하기 위해서 Potato Dextrose Agar (PDA, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany; Potato, Infusion from (solids) 4 g, Dextrose 20 g, Agar 15 g per liter)에서 5일간 배양한 공시 병원균의 균사선단에서 직경 5mm의 균사 조각을 떼어내어 각 제형 함유별로 조제된 PDA 혼합 배지 위에 치상 3일 후 균사 생육을 관찰하였다. 각 처리는 독립적으로 3회 수행하였고, 3반복으로 진행하였다. 본 연구에 사용된 토마토 시들음병균 F. oxysporum f. sp. lycopersici KACC 40043 (FOL43)과 F. oxysporum f. sp. lycopersici KACC 40046 (FOL46)은 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural Culture Collection (KACC), National Agrobiodiversity Center, Jeon-ju, Korea)에서 분양 받아 사용하였다.

각 혼합제형물에 대한 토마토 시들음병원균의 포자발아억제 조사를 위한 시험은 병원성 곰팡이균 FOL을 PDA 배지에 접종하여 25^oC에서 7일간 배양한 후 20ml 멸균수를 넣어 포자를 수집하고, 멸균된 cheese cloths를 이용하여 포자현탁액을 회수하였다. 포자는 hemacytometer (Paul Marienfield GmbH & Co., Lauda-Konigshofen, Germany)에서 포자 현탁액 농도를 조절하여 사용하였다. 포자발아억제능력 조사는 12 well plate (SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)에 각 혼합제형물 1%와 PDB (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany) 10%를 혼합하고 200 μl의 포자현탁액(1 × 10⁴ spores/ml)을 제조하여 25^oC에서 20시간 동안 120 rpm으로 배양하면서 포자발아억제율을 조사하였다. 광학현미경하에서 발아관의 길이가 포자 장경의 1/2 이상인 것을 발아한 것으로 계산하여 각 반복별 100개의 포자에 대한 발아 유무를 관찰하였으며 3반복으로 조사하였다. 대조구는 멸균된 10% PDB 배지를 사용하였다.

유묘검정은 각 혼합제형물을 200배로 희석하여 4엽기 토마토(Solanum lycopersicum L. cv. TenTen) 유묘에 3일 간격으로 2회 20ml씩 관주한 후 3일 후에 병원균을 접종한 후 생육실 및 온실(25 ± 3^oC, 16L : 8D, RH 50~60%)에서 실시하였다. 병원균 접종은 토마토 유묘에 지제부에서 1 cm 떨어진 곳에서 45°로 2 cm 깊이의 뿌리에 상처를 주고 FOL 포자 현탁액(1 × 10⁶ conidia/ml)을 관주한 후 4주 후에 병조사를 하였으며, 처리당 5주씩 4반복 수행하였다. 토마토 시들음병 병조사는 발병지수에 의해 도관부의 갈변 여부와 생육 상태로 발병 정도를 조사하였다. 발병 지수는 0 = 건전, 1 = 도관이 갈변되나 지상부의 생육은 정상인 것, 2 = 도관이 갈변되고 지상부의 생육이 약간 억제된 것, 3 = 도관이 갈변되고 지상부는 생육이 억제되고 약간 황화한 것, 4 = 생육이 심하게 억제 되고 황화하여 시들고 낙엽된 것, 5 = 고사 등 6단계로 하였다.

온실포장검정은 전남대학교 농생물관리단의 비닐하우스에서 공시된 토마토 품종(텐텐)을 파종하여 6주된 유묘를 40 × 35 cm 간격으로 두 줄로 토경재배 하였다. 혼합제형물은 각 처리구역(200 × 40 cm)에 정식 후 30일차에 농도별, 살포회수별로 처리하였고, 각 처리구는 10주씩 3반복 난괴법으로 실시하였다. 시들음 병원균접종은 혼합제형물을 처리하기 5일 전에 이병토(FOL 2.1 × 10⁵ conidia/g of soil)를 지면에서 5 cm 깊이에 100 g씩 접종하였다. 처리농도별 처리는 7일 간격으로 100, 250, 500, 750, 1000배로 희석하여 5회 처리하였고, 살포회수별 처리는 250배 희석된 각 혼합제형물을 7일 간격으로 1, 3, 5회 처리한 후 병 발생율을 조사하였다. 병 발생조사는 제형 혼합물 최종 처리 30일 후에 발병 지수를 기준으로 발병율((Σ (발병지수 × 평가된 식물 수) / 총 식물수 × 5) × 100)을 조사하였다. 본 연구에서 사용한 모든 방제가(%)는 발병지수에 따른 무처리 대비 발병율로 도출하였다.

혼합제형물에 혼합된 PPL 균주가 생성한 주요 유효성분을 분석하기 위해 n-butanol을 이용하여 유기용매 층을 분리하였다. 부탄올에 의해 추출된 유기용매 분획층은 진공농축장치로 완전 농축하여 메탄올로 녹인 후 0.2 μm syringe filter (Whatman, PTFE, Florham Park, NJ, USA)로 여과한 후 얇은막 크로마토그래피(TLC, 27.0 cm × 26.5 cm× 7.0 cm, Sigma-Aldrich) 및 LC-MS/MS (API-3200, AB SCIEX, Framingham, MA, USA) 분석을 위해 사용하였다. MBP 배지에서 28^oC, 5일 배양한 상등액에서 추출한 농축액을 TLC plate (silica gel 60, Merck, Germany)에 전개시킨 후(mobile phase; chloroform – methanol – H₂O = 65 : 25 : 4, v/v/v) 물로 발색시켜 나타난 각 부분을 표준물질의 R_f값과 비교하면서 획득하였다(Kang et al., 2019). 회수된 각 5곳의 (T1~T5) 부탄올추출물(10 μg/ml)은 FOL43 (1 × 10⁶ conidia/ml) 포자현탁액이 포함된 PDA 배지 위의 paper disc에 10 μl를 떨어뜨린 후 포자생육억제율을 측정하였다. 또한 FOL에 대한 균사생육억제 및 유묘검정 조사는 위의 재료 및 방법에서 언급한 방법으로 수행하였다. 각 부탄올추출물의 LC-MS/MS 분석에 사용된 컬럼은 Capcell Core C₁₈(2.1 mm I.D × 150 mm, 2.7 μm)이며, 분리용매는 A (0.1% formic acid in distilled water)와 B (0.1% formic acid in methanol)를 사용하였다. 모든 화합물은 ESI (electro spray ionization) 및 positive mode에서 이온화 하였고 MRM (Multiple Reaction Monitoring) mode로 분석하였다(Table 1). 각 표준액을 농도별로 희석하여 LC-MS/MS로 측정한 후 얻어진 크로마토그램상의 peak 면적을 검량선과 비교하여 정량하였다. 분석을 위한 각 표준용액 fengycin (CAS Number 102577-03-7), surfactin (CAS Number 24730-31-2), iturin A (CAS Number 52229-90-0)는 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)에서 구입하였다:

각 처리 평균간의 차이에 의한 유의성 검정은 통계분석은 SPSS 23.0 software (IBM Corporation, Somers, New York, USA)를 사용하여 일원배치 분산분석을 한 후 Duncan의 다중검정방법(Duncan's multiple range test)으로 유의수준 0.05에서 통계적 유의성을 검정하였다.

혼합제형물의 토마토 시들음병원균에 대한 균사생육 및 포자발아 억제 능력을 조사한 결과, PDB 배지 대조구와 미생물 및 식물추출물 단독 처리보다 억제효과가 높았다(Fig. 1A, 1B). 특히, NR 처리는 TB 처리보다 병원균의 포자발아를 27.3% 더 억제하였으며, 미생물(PPL)과 식물추출물(To, Ro:Ne) 단독 처리보다 33~77.1% 높았다. 단독 처리된 각식물추출물들은 FOL의 포자발아억제에 영향을 미치지 못했으며, 균주 PPL은 대조구보다 유의적으로 39.6% 더 억제하였다. 혼합제형물의 토마토 유묘에서 시들음병에 대한 방제효과를 검정한 결과, 병원균 포자억제능력과 유사한 경향의 결과를 나타냈다(Fig. 1C, 1D). 두 혼합제형물 모두 PPL 균주 처리를 제외하고 유의적 차이가 있었으며, NR은 미생물 및 식물추출물 단독 처리구와도 통계적으로 유의하였다. 200배 농도로 3일 간격, 2회 처리한 혼합제형물 중 NR 처리구의 토마토 유묘는 도관부가 일부 갈변되는 현상이 나타났지만, 지상부의 생육은 전체적으로 정상적이었다. TB 처리구도 일부 도관부에서 갈변현상이 나타나면서 아랫잎이 황화현상이 나타났다. 그러나 식물추출물 단독처리구에서는 물 처리구(대조구)와 같이 생육이 심하게 억제되고 황화되어 시들고 낙엽지는 현상이 나타났다. 토마토 유묘검정 결과에서도 식물추출물은 병원균의 식물체 도관부 침입 저지에서 큰 역할을 하지 못하였다. B. amyloliquefaciens는 합성배지 TSB에서 배양된 상등액에서 F. oxysporum, R. solani와 C. gloeosporioides에 대한 항균활성이 75.3~89.7%로 높은 억제능력을 나타낸 것으로 보고 되었다(Kang et al., 2019). 균주가 생산하는 biosurfactant들과 식물추출물의 항균활성작용은 상승작용을 나타내는 결과를 가져왔으며, 토마토 시들음병에 대해서 TB보다는 NR 혼합제형물에서 그 길항능력이 더 우수하였다. 혼합제형물의 상승작용이 해충에 대한 방제능력면에서는 52.6~21.5% 더 우수한 기존 결과가 있다(Kang et al., 2019). 구성성분이 유사한 혼합제형물간에서 나타난 식물병원균과 해충에 대한 상승효과의 차이는 님, 로테논과 니코틴 등 식물추출물 성분은 주로 해충에 대한 섭식 저해, 탈피 억제, 접촉 독성 및 기피제로 잘 알려진 물질들이기 때문에 방제효과면에서 식물병원균보다는 해충에서 효과가 더 높았다(Dayan et al., 2009; Kim and Kim, 2009). 또한 님 추출물의 경우 Bt와 혼용할 경우 파밤나방 유충에 대한 살충율이 50~37% 이상 증가한 보고도 식물추출물의 해충에 대한 직접적인 저해 특성으로 상승효과를 나타냈다(Han et al., 2015). 또한 식물추출물은 대부분 약제특성상 직접 접촉에 의한 독성효과가 높지만 잔효성이 낮아 살포 후 새로운 개체수 증가 시 살충효과가 낮아지기 때문에 다른 화합물 또는 미생물과 혼용하여 사용할 경우 효과가 극대화되는 것으로 나타났다(Han et al., 2015). 특히, 미생물 Bt 독소단백질은 곤충 장내 수용체로의 접근과 결합에 관여하여 살충효과를 극대화시키기 때문에 Bt 균주들과 주로 혼합하여 사용하였다(Moar and Trumble, 1987; Singh et al., 2007). 그러나 식물병원균에 대한 식물추출물과 Bt 또는 미생물과의 혼용살포효과는 뚜렷한 보고가 없으며, 그 방제효과도 살균제 및 살충제의 효과만큼 높지 않았다. 본 결과에서도 유사한 경향을 나타냈으며, 병원균에 대한 항균활성효과는 식물추출물의 유효성분보다는 미생물의 대사산물에 의한 효과임을 확인하는 결과를 얻었다.

Fig. 1. 
Effects of the TB (B. amyloliquefaciens PPL 30% + Nicotine 2%) and NR (B. amyloliquefaciens PPL 30% + Azadirachtin & Rotenone 2%) formulations on the growth of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) and on the control of tomato Fusarium wilt on tomato plants (A-D). (A). Suppression of spores against F. oxysporum f. sp. lycopersici KACC 40043, (B). Inhibition of fungal mycelia growth, (C). Disease control efficacy of against tomato Fusarium wilt. (D). Photo taken 4 weeks post inoculation. To, Tobacco leaf extract (Nicotine 2.2%); Ro:Ne, Mixtures of neem and rotenone 0.75% + 0.05%); PPL, Cell free supernatant of B. amyloliquefaciens PPL; TB, B. amyloliquefaciens PPL 30% + Nicotine 2%; NR, B. amyloliquefaciens PPL 30% + Azadirachtin & Rotenone 2%. Data are means ± SD with three replicates. The values followed by a different letter in a column were significantly different at P < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

앞선 결과에서 혼합제형물의 식물병원균에 대한 항균활성을 나타내는 주요 유효성분은 B. amyloliquefaciens PPL가 생산하는 biosurfactant가 주요 물질임을 확인하였다(Kang et al., 2019). 균주 PPL이 생산하는 항균활성 물질은 iturin A, surfactin, fengycin 등이 있으며, 이 물질 중에 토마토 시들음병에 대한 효과가 있는 특정한 surfactant를 조사하기 위해 각각의 분획된 CLPs의 항균활성 분석을 수행하였다(Fig. 2). 부탄올 용매에 의해 추출된 CLPs는 TLC에 전개한 후 각 분획물을 얻었다. TLC상의 분리된 분획은 표준물질의 R_f 값과 비교하여 총 5개 부분(T1~T5)을 얻었으며, 각 CLPs 정량분석은 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 분리된 T1~T5 물질들의 FOL에 대한 항진균활성을 조사한 결과, T1 분획물에서 포자 생육과 균사생장을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 2A). LC-MS/MS 분석에서 표준물질 피크에 의한 T1 분획물의 크로마토그램 피크면적 함량을 비교 분석한 결과 유효성분 fengycin CLPs가 81.1 mg/L으로 가장 높게 검출되었고, iturin A (0.1 mg/L), surfactin (미검출) 순으로 검출되었다(Fig. 2B). T3과 T5는 각각 iturin A (62.5 mg/L)과 surfactin (306.6 mg/L)으로 가장 높게 검출되었으며, T2와 T4에서 CLPs 함량은 대부분 극히 소량 검출되거나 검출되지 않았다. 5엽기의 토마토 유묘(품종: 텐텐)에 각분획물(60 mg/ml)과 FOL43 포자 현탁액(1 × 10⁵ conidia/ml)을 접종한 후 14일 후에 발병지수에 의해 토마토 시들음병 방제효과를 검정하였다(Fig. 2C, 2D). Fengycin 함량이 가장 높았던 T1 처리구는 1.3의 발병지수로 대조구 대비 68.8%의 방제효과가 있었으며, T2 처리구는 2.8의 발병지수을 나타냈다. 그 외 처리구는 대조구 대비 방제가 16.6% 이하의 방제효과를 나타냈다. Fig. 2B의 각 분획구 CLPs 함량 분석결과를 근거로 fengycin 함량이 높을수록 토마토 시들음병에 대한 방제효과가 높았으며, 특히 T1 처리구는 FOL 포자 및 균사생육 억제 결과처럼 토마토 유묘에서도 방제효과가 높았다. T1 분획물 다음으로 fengycin 함량이 높은 T2(0.6 mg/L)는 포자와 균사생육 억제에서 직접적인 효과는 미비하였지만, 토마토 유묘검정 결과 대조구 대비 31.3%의 방제효과를 나타냈다. Fengycin은 매우 낮은 수 uM 범위에서 특정 곰팡이에 대한 최소억제농도의 항균활성을 나타낸다(Zihalirwa Kulimushi et al., 2017). Fengycin이 낮은 농도로 일부 식물 진균성 병원균에 대해 항진균활성으로 작용하지만 이에 대한 분자 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않고 병원균의 종류에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우에, fengycin은 포자의 막 투과성에 의해 발아를 억제하며, 낮은 농도에서 DNA 합성을 억제하여 균사 세포 생합성을 교란시켜 억제하는 것으로 알려져 있다(Wise et al., 2014). Fengycin과 iturin A를 생산하는 균주에서 대부분 강력한 항진균 활성이 관찰되었으며, 이는 이전의 보고와 일치한다(Cho et al., 2003; Hu et al., 2007; Romero et al., 2007; Medeot et al., 2017; Yánez-Mendizábal and Falconí, 2018). 그러나 surfactin은 세포 표면 소수성이 더 높고 surface tension의 활성이 높아 biofilm 형성에 중요한 역할을 하며 (Aleti et al., 2016; Al-Ali et al., 2018; Liu et al., 2019), 일부 항미생물 활성을 나타내지만, 단독으로 항진균 활성은 다른 CLPs에 비해 약한 편이다. 또한 최근에 surfactin은 iturin A (Souto et al., 2004; Joshi et al., 2008) 또는 fengycin (Koumoutsi et al., 2004; Ongena et al., 2007; Romero et al., 2007)과 일부 시너지 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 토마토 시들음병에 대한 PPL 균주의 fengycin의 효과 이외에 다른 리포펩타이드들의 직접적인 효과는 미비하였지만, surfactin 등 과의 시너지 효과로서 식물체 면역반응 유도 등의 간접적인 효과에 의한 방제효과도 있을 수 있을 것으로 사료된다(Ongena et al., 2007).

Fig. 2. 
Effect of butanolic extracts of cell-free culture filtrates of B. amyloliquefaciens PPL on tomato Fusarium wilt. (A). Inhibition of sporulation and mycelia growth of butanolic extracts, (B). Lipopeptides quantification (mg/L) obtained from butanolic extracts. (C). Disease control efficacy of butanolic extracts (60 mg/ml) on tomato Fusarium wilt. (D). Photo taken 4 weeks post inoculation. The butanolic extract of MBP culture was separated by preparative TLC (Prep TLC; 20 × 20 cm, 0.5 mm, Merck) and 5 regions (T1, T2, T3, T4 and T5) were scraped from the prep TLC and then fractioned with methanol. Data are means ± SD with three replicates. The values followed by a different letter in a column were significantly different at P < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

균주 PPL의 CLPs 유효성분과 식물추출물 혼합물을 이용한 토마토 시들음병 방제를 위한 제형물과 그 제어조건을 설정하기 위하여 유효성분이 있는 미생물의 함량에 따른 혼합비율별 방제효과를 검정하였다(Fig. 3). NR 혼합제에 함유된 미생물 상등추출물을 10~30% 비율로 혼합한 결과 30%로 혼합할 경우 77.2%로 FOL43에 대한 포자발아를 억제하였다(Fig. 3A). 또한 미생물 함유량에 따라 NR 혼합제의 토마토 시들음 유묘검정 결과에서도 200배 희석하여 3일 간격으로 2회 관주한 결과, 대조구 대비 모든 처리구는 78.4~37.8%의 방제가를 나타냈으며, 30~15% 함유량별 처리구에서 통계적으로 유의하게 나타났다(Fig. 3C, 3D). FOL 포자 발아억제효과 결과와 같이 PPL 균주 배양 상등추출액의 함량이 높을수록 그 방제효과는 높은 정의 상관관계를 나타냈다. 대조구 대비 30% 함유 혼합물의 처리구에서는 시들음병 병징이 거의 나타나지 않았으며, 그 발병도도 0.8로 정상적인 생육을 보였다. 15% 처리구에서는 도관부는 약간 갈변되면서 아랫잎에서 황화현상이 일부 나타나기는 하였지만 1.3 발병도로 65%의 방제가를 나타냈다. 하지만 10%의 처리구는 FOL 포자발아억제 결과와 같이 38% 이하의 방제가로 토마토 유묘에서는 대부분 아랫잎의 황화현상과 도관부 갈변현상이 나타나 지상부 생육이 억제되는 병징을 나타냈다. 따라서 균주 배양상등추출액의 최소함유비율은 전체 함량 대비 15% 함유비율의 결과를 얻었다. 이와 같이 토마토 시들음병에 대한 PPL 균주의 최소함유비율 설정으로 향후 다른 혼합물과 제형할 경우 방제할 수 있는 비율을 설정함으로써 방제효율을 높일 수 있는 근거를 제시할 수 있을 것이다. 또한 그 유효성분인 fengycin의 최소억제농도 설정시 본 연구결과가 기초자료로 사용될 것으로 사료된다.

Fig. 3. 
Effect of the mixing ratio of B. amyloliquefaciens PPL on the NR (B. amyloliquefaciens PPL 30% + Azadirachtin & Rotenone 2%) formulations. (A). Spores germination suppression of F. oxysporum f. sp. lycopersici KACC 40043, (B). Disease control efficacy on tomato Fusarium wilt. (C). Photo taken 4 weeks post inoculation. The microbial equivalent extract contained in the NR mixture was mixed at a ratio of 10 to 30%. 30%, B. amyloliquefaciens PPL 30% + Ro:Ne (Azadirachtin & Rotenone 2%); 15%, B. amyloliquefaciens PPL 15% + Ro:Ne; 10%, B. amyloliquefaciens PPL 10% + Ro:Ne; CON, water treatment. Data are means ± SD with three replicates. The values followed by a different letter in a column were significantly different at P < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

혼합제형물 2종을 대상으로 살포농도별 및 살포회수별로 처리한 후 토마토 시들음병 발병율을 조사하였다(Fig. 4). 온실포장에서 토마토 생육상태는 최종 약제처리 후 10일까지는 모든 처리구에서 시들음병 증상의 발병도 편차가 크지 않았으나, 20일후부터는 무처리 대비 일부 처리구에서는 병발생이 심해지면서 시들음 증상의 발병도가 높아졌다.

Fig. 4. 
Effect of the TB (B. amyloliquefaciens PPL 30% + Nicotine 2%) and NR (B. amyloliquefaciens PPL 30% + Azadirachtin & Rotenone 2%) formulations at application methods under the greenhouse. (A). Disease control efficacy at the different folds on tomato Fusarium wilt. The formulation was applied five times with seven-day interval in the plastic house, where tomato plants were cultivated. (B). Disease control efficacy at the different application times on tomato Fusarium wilt. The formulation was applied 250-folds dilution with seven-day interval. (C). Photo taken 4 weeks post inoculation. Data are means ± SD with three replicates. The values followed by a different letter in a column were significantly different at P < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

처리농도별로 최종약제 처리 30일 후에 병 발생율을 조사한 결과 NR 처리구는 250배까지 뿌리 일부가 갈변되는 현상은 있었으나, 생육은 정상으로 16~20%의 발병율로 80~75% 이상의 방제가를 나타났고, 그 이상의 희석농도에서는 50% 이하의 방제효과가 있었다. TB 처리구에서는 100배처리구에서만 60% 이상의 방제를 나타났고, 그 이상의 희석농도에서는 도관부가 갈변되면서 지상부까지 시들음현상이 나타나 50% 이하의 방제효과가 있었다. 액상 혼합제형에서 250배 희석된 처리구에서 높은 방제효과를 나타낸 것은 B. amyloliquefaciens PPL 균주가 fengycin, iturin, surfactin 등과 같은 식물병원성 곰팡이에 대한 강한 길항작용 물질이 제형화 후에도 유지되고 있음을 의미한다.

하지만 앞선 보고와 다르게 본 연구의 혼합제형물에 2% 함유된 식물추출물인 님+데리스(azadiracchitin 0.75% + rotenone 0.05%) 및 담배(nicotine 2.2%) 잎 추출물은 해충방제에서는 효과가 우수하였으나(Park et al., 2019), 토마토 시들음병에 대한 온실포장방제효과에서는 PPL 균주의 유효성분인 fengycin의 효과가 주요한 것으로 사료된다. 또한 처리회수별 발생율은 모든 처리구에서 무처리구 대비 7일 간격으로 5회 처리한 경우 24~32% 발생하였으며 60% 이상의 방제효율을 나타냈다. NR 제형의 3회 처리구도 36%의 병발생율로 55%의 방제효과가 있었지만, TB 처리구에서는 시들음 증상이 48% 보였으며 40%의 방제효과를 나타냈다. 종합적으로 본 연구에서 사용한 미생물과 식물추출물 혼합제형물 2종에 대한 토마토 시들음병 방제에서 NR과 TB 제형물은 토마토에 7일 간격으로 250배의 희석농도로 3회 이상 관주하는 제어조건으로 결정하였다.

따라서 본 연구는 식물추출물과 B. amyloliquefaciens PPL의 혼합제형물의 토양병해에 대한 방제효과에서 가능성이 충분히 있는 것으로 나타났다. 대부분의 병해충 방제약제의 경우 약제 살포시기를 놓쳐 방제효과가 떨어져 이를 극복하기 위해 고농도의 약제를 자주 살포하는 경우 약해가 발생하는 경우가 있기에 주의하여야 한다. 그러나 지상부 병해와 달리 토마토 시들음병은 주변 환경조건이 불리할 경우 토마토 시들음병원균은 후막포자를 생성하여 장기간 토양에서 존재하기 때문에 예방적인 살포가 매우 중요하다. 더군다나 가지과류 작물 중에서도 작물에 따라서 병발생 특이성을 나타내므로 방제약제도 적절한 선택에 의한 살포가 중요하다. 최근 토양병해에 대한 우수한 화학농약의 개발 및 연구가 활발히 진행되고 있으며, 미생물 및 천연물질의 작물보호제를 작물 정식전부터 병행하여 꾸준히 사용할 경우 개발 상용화될 화학농약의 치료효과의 방제수준만큼은 아닐지라도 예방적인 방제효과는 기대할 수 있을 것이다.