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실험에 사용한 농약 표준품(Aldrin 등 41성분)은 Accustandard (New Haven, USA), Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany), Chem Service (West Chester, USA), HPC standards (Cunnersdorf, Deutschland), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Wako (Osaka, Japan) 사로부터 각각 구입하여 사용하였다. 시료 전처리 과정 중 추출 및 정제를 위해 사용한 아세토니트릴(acetonitrile), 헥산(n-hexane) 및 아세톤(acetone)은 잔류농약 분석용 특급시약(pesticide residue analysis grade)으로 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구매하여 사용하였고, 기타 시약들은 모두 잔류농약 특급을 사용하였다. 시료의 정제를 위해 Florisil 카트리지(500 mg, 6 cc)는 applied separation (Hamilton, USA)에서 구매했고, 맴브레인 필터(PTFE 0.2 μm)는 Thermo (Waltham, USA)를 사용하였다.

실험 검체는 식품의약품안전처에서 고시한 잔류농약 시험법 개발 시 고려하는 대표 축산물 5종인 소고기, 돼지고기, 닭고기, 계란 및 우유를 시중에서 구입하였다. 구입한 검체는 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 -70^oC에 보관하며 실험에 사용하였다.

GC-MS/MS 분석대상 농약 29종은 국내 축산물에 기준 설정된 살충제에서 식품공전 및 국제식품규격위원회(CODEX)의 잔류물의 정의에 따라 대사체와 이성질체를 포함 41화합물의 표준품을 순도에 맞추어 각각 칭량하여 아세톤 20mL에 녹여 1,000 mg/L 농도의 표준원액을 조제하였고, Stock Solution 형태로 판매되는 표준품은 그대로 표준원액으로 사용하였다. 각각의 표준원액을 일정한 농도가 되도록 아세톤으로 희석하여 혼합표준용액을 제조하였다. 표준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 4^oC에 보관하였고, 분석 시 희석하여 사용하였다.

축산물 잔류농약의 기기 분석에 사용한 GC-MS/MS는 7890B GC system과 7010 GC/MS Triple Quad (Agilent, Santa Clara, USA)를 사용하였다. 분석용 칼럼은 HP-5ms (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm, Agilent, USA)을 사용하였으며, 운반 기체로는 헬륨 가스로 유속을 1 mL/min으로 콜리젼가스는 질소를 사용하여 하였다. 또한, 주입부 온도는 300^oC로 설정하여 splitless 하에 2 μL를 주입하였다. 오븐 온도는 70^oC에서 2분간 유지 후, 300^oC까지 20^oC 상승 후 8분간 유지시키는 조건을 사용하였고, 자세한 GC-MS/MS의 분석조건은 Table 1과 같다.

균질화한 검체 10 g (소고기, 돼지고기, 닭고기는 100 g, 우유 500mL, 달걀 10개 이상을 혼합, 분쇄 후)을 정밀히 달아 250mL 용량의 원심분리관에 넣고 0.1% formic acid가 함유된 아세토니트릴 50mL를 넣은 후 30분간 진탕추출한다. 이후 황산마그네슘 4 g 및 염화나트륨 1 g을 첨가하여 진탕 후 3,000 g에서 5분간 원심 분리한 후 상층액 25mL를 둥근바닥 플라스크에 옮긴 뒤 아세톤에 녹아있는 2% 디에 틸렌글리콜 0.2mL 첨가 후 40^oC 이하의 수욕 중에서 감압농축하여 건고된 잔류물을 아세톤/핵산(20/80, v/v) 혼합액4 mL로 녹인다. SPE-Florisil 카트리지(500 mg, 6 cc)에 핵산 5mL 및 아세톤/핵산(20/80, v/v) 혼합액 5mL을 차례로 가하여 활성화 시킨 뒤 앞서 녹인 추출액 4mL을 초당 2~3방울 정도 속도로 용출하여 받은 후 아세톤/핵산(20/80, v/v) 혼합액 5mL을 용출하여 동일한 시험관에 받는다. 이후 아세톤에 녹아있는 2% 디에틸렌글리콜 0.2mL 첨가 후 40^oC 이하의 질소기류 하에서 농축 후 잔류물을 아세톤/핵산(20/80, v/v) 1 mL에 녹인 후 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과하여 이를 시험용액으로 하였다(MFDS., 2018). (Fig. 1).

Fig. 1. 
Schematic diagram of samples preparation method.

축산물 동시다성분 시험법은 ‘CODEX 가이드라인(CAC/GL 40)’과 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원의 ‘식품 등 시험법 마련표준절차에 관한 가이드라인 (2016)’을 적용하여 시험법의 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery) 및 재현성(reproducibility)에 대한 유효성을 검증하였다(CAC., 2003; NIFDS., 2016). 매질 효과를 고려한 직선성의 확인을 위하여 각각의 분석 성분은 농약 성분이 있지 않는 무처리 시료를 본 연구에서 개발한 전처리방법과 동일하게 실험하여 만든 추출용액을 90% 이상 함유하도록 표준용액을 희석하는 matrix-matched 방법으로 분석하여 0.005-0.5 μg/mL의 농도범위에 대한 각각의 peak 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 검량선의 결정계수(coefficient of correlation, R²)를 구하였다. 또 검출한계(Limit of Detection, LOD)와 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 크로마토그램상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio)가 각각 3 및 10 이상으로 하였다. 시험법의 정확성 및 재현성을 평가하기 위하여 각 시료의 무처리 시료에 분석대상 농약의 표준용액을 첨가하고 균질화하여 30분 이상 정치 후 분석하여 회수율을 구하였다. 처리농도는 대표축산물 5종에 대하여 정량한계, 정량한계의 2배, 정량한계의 20배에 해당하는 농도로 각 시료에 5반복으로 수행하였으며, 평균과 상대표준편차(RSD, relative standard deviation)를 계산하여 시험법의 정확성과 정밀성 및 재현성을 평가하였다. 또한 부산 및 경인지방식품의약품안전청과 실험실간 검증을 실시하여 시험법의 유효성을 확인하였다.

정량한계 (mg/kg)=최소검출량(ng)시료 주입량(μL)×최종희석부피(mL)분석검체량(g)×추출용매(mL)분획량(mL)=최소검출량(ng)2 (μL)×1 (mL)10 (g)×50 (mL)25 (mL)

검체 중 대상성분과 분석성분이 동일하다면 분석성분량으로부터 직접 잔류량을 산출하고, 분석성분이 대상성분의 변환체나 ion과 같은 일정 부분이라면 화학식량 차이에 따른 환산계수를 적용하여 잔류물을 산출한다. 분석 대상 살충제 농약 29종 중에서 잔류물의 정의에 대사산물이 포함되는 경우 다음과 같이 대사산물의 잔류량에 환산계수를 곱하여 정량하였다(NIFDS., 2017).

• * 대사산물을 포함하는 농약의 잔류량 = 모화합물의 잔류량 ＋ (환산계수 × 대사산물의 잔류량)
• * 환산계수 = 모화합물의 분자량 / 대사산물의 분자량

본 실험의 분석대상인 유기인계, 유기염소계, 카바메이트계 및 트리아졸계 피레스로이드계 등 여러계열의 농약 29종(41 화합물)을 선정하고 MRM 조건을 확립하기 위해 full scan과 product ion scan을 진행하였다. Mass range를 50-550 m/z로 설정하고 1mg/kg, 5mg/kg의 standard solution을 사용하여 Full scan을 진행했다. Full scan에서 나온 결과을 바탕으로 감도가 높고 선택성이 우수한 것을 우선순위로하여 precursor ion을 선정하였고 mass 값은 가능한 200 m/z 이상 되는 것을 선정하였다. 그리고 선택된 precursor ion으로 product ion scan을 진행했다. 다양한 CID energy (3-42 eV)를 사용하여 product ion scan을 진행, 가장 높은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로, 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성이온(qualification ion)으로 선정하였다. 최적 기기분석 조건은 Table 1에 나타내었고, 분석조건에서 선정된 특성 이온과 머무름 시간은 Table 2에 나타내었다.

분석 대상 농약 29종의 검출한계는 기기 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio) 3 이상으로 결정하여 각각의 성분에 따른 LOD는 0.0005 (Phosalone 및 Fenvalerate), 0.001 (Fenpropathrin 및 Phenthoate) 및 0.002 mg/kg (Aldrin등 24종)이었고, LOQ는 S/N ratio 10 이상으로 결정하여 0.001 (Phosalone 및 Fenvalerate), 0.003 (Fenpropathrin 및 Phenthoate) 및 0.005 mg/kg (Aldrin 등 24종) 이었다. 본 연구에서 모든 대상 농약의 정량한계는 국내 축산물중 농약잔류허용기준 설정된 가장 낮은 수준인 0.005mg/kg 이하로 잔류허용기준 준수여부를 판별하기에 문제가 없을 것으로 판단된다.

본 시험법의 대상 농약 29종이 모든 종류의 축산물 시료에 대하여 기준이 설정되어 있지 않아 최소 0.01mg/kg 수준 이하로 관리할 필요성이 있고 동시분석의 특성에 따라 모든 농약 물질의 정량한계를 0.005 mg/kg 이하의 수준으로 적용할 필요성이 있어 이에 따른 회수율 실험을 진행하였다. 또한 29종 농약 중 가장 낮은 잔류허용기준을 가지는 Lindane (γ-BHC)의 경우 유, 포유류부산물, 가금류부산물에서 0.005 mg/kg 로 기준 설정되어 있어 0.005mg/kg 수준의 검증을 포함하여 회수율 실험을 진행하였다. 시험법의 정확성을 평가하기 위하여 5개의 대표축산물에 정량한계, 정량한계의 2배, 정량한계의 20배 수준인 0.005, 0.01 및 0.1 mg/kg의 농도로 처리하여 회수율 실험을 5회 반복하여 수행하였다.

그 결과 각 농도에서 평균 회수율은 62.5-120.0%이었고, 이 결과는 잔류물 분석에 관한 CODEX 가이드라인에서 요구하는 잔류농약 분석 기준에서 0.005 및 0.01 mg/kg은 회수율 범위 60-120%, 반복 간 변동계수 ≤ 30%, 0.1 mg/kg은 회수율 범위 70-120%, 반복 간 변동계수 ≤ 20%을 만족하는 것으로 확인되었고 대부분의 분석 물질에 대한 높은 정확성, 재현성 및 효율성을 확인할 수 있었다(Table 4). 퀘쳐스법을 기반으로 하며 GC-MSMS를 이용한 축산물 중 농약 동시분석법은 기존에 연구된 내용이 있지만, 닭고기, 우유, 등 한두가지 축산물시료만을 대상으로 분석법을 검증한 내용이 대부분이었다(Frank et al., 2017; Manjusha et al., 2019; Song et al., 2019; Jianmei et al., 2020; Ping et al., 2020). 본 연구에서는 포유류 고기 중에서는 소고기(반추동물)와 돼지고기(비반추동물), 닭고기(가금류), 계란(알류), 우유(유) 5가지 대표적인 축산물 시료를 대상으로 분석법을 검증한 결과물로써 대부분의 축산물 시료에 대하여 29종 동시다성분 분석에 적용가능함을 확인할 수 있었고 GC-MS/MS를 이용하여 분석한 29종의 크로마토그램은 Fig. 2에 나타내었다.

Fig. 2. 
Standard chromatogram of 29 kinds of pesticides (0.01 mg/L). Retention time (RT) and Peak Number are shown by Table 2.

한 실험실내에서 검증이 완료된 실험법이라도 다른 환경의 실험실에 적용하였을 때 유효성이 있는지 입증하기 위해 실험실간 교차검증을 수행하였다. 독립된 실험실간 검증에 참여한 곳은 경인 및 부산지방식품의약품안전청이었다. 본연구기관에서 개발하여 실험실내 검증 완료 한 방법을 지방식약청에 제공하고 동일한 방법으로 분석을 수행한 후 두 실험실간의 회수율 및 상대표준편차를 비교하였다. 검증 결과 대부분의 분석 성분의 평균 회수율 범위는 60-120%로 나타났고 상대표준편차는 30% 이하로 확인하였으나 일부성분에 대하여 CODEX 가이드라인에 적합하지 않은 화합물이 있는 것으로 확인되었다. 분석 대상 29종 41화합물 농약 중 12화합물이 적정 회수율 또는 상대표준편차 범위를 만족하지 못하였으며, 이러한 성분은 Chinomethionate, Chlordan-cis, Oxychlordane, p,p-DDT, o,p-DDT, p,p-DDE, α-Endosulfan, δ-Keto-endrin, Fenvalerate, Heptachlor, Pirimicarb 및 Propagite이며 같은 농약성분이라도 두개의 실험실 중에서 한 곳에서는 회수율과 편차가 적정범위에 만족하더라도 독립된 다른 곳에서 적정 범위를 벗어나거나, 두 실험실 모두 적정범위(60~120%)의 회수율 값을 가지더라도 두 실험실간의 비교시 상대표준편차가 큰 경우였다. 비록 실험실간 검증 가이드라인에 만족하지 못하는 성분들이라도 정성분석으로 사용하여 스크리닝 시험에 적용이 가능할 것으로 판단된다. 그 외 29성분에 대해서는 CODEX 가이드라인에서 제시한 실험실간 교차검증에서의 상대표준편차 범위(처리농도 0.001 mg/kg 초과 0.01 mg/kg 이하에서 상대표준편차 45% 이하, 0.01 mg/kg 초과 0.1mg/kg 이하에서 상대표준편차 32 % 이하)를 만족하는 것으로 확인되었다(Table 5).

본 연구내용은 국내 축산물에 기준 설정된 농약 100종 중에서 살충제만을 대상으로 분석법을 개발한 내용이지만, 식량자급률이 낮으며 수입축산물 양이 꾸준한 국내 현실에서 정부는 코덱스와 같은 국제적으로 기준 설정된 축산물 중농약 잔류허용기준을 국내 기준으로 꾸준히 확대해나갈 예정이기에(MFDS., 2018) 기준 확대 또는 재개정에 따른 시험법 개발도 병행해야 할 것으로 판단된다. 또한 피프로닐 계란 검출 사례와 같이 농산물에 등록된 농약의 의도적인 사용에 대한 문제점이 발견되었기에 축산물에는 등록되지 않았더라도 농산물 중 사용 등록된 살충제 농약을 대상으로 축산물 시료에 대한 분석법 개발도 필요한 것으로 보이며 이에 대한 보다 많은 연구가 진행되어야할 것으로 판단된다.