Current Issue

시험에 사용한 농약은 살균제 Benomyl (98%), fluazinam (98%), terbuconazole (99%), 살충제 carbosulfan (98%), diazinon (98%), terbufos (85%), 제초제 butachlor (95%), glufosinate ammonium (98%), oxadizaon (96%), pretilachlor (94%)으로 농약 회사에서 제공받거나 sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

숙련도 물질 10종 2,4-Dinitrochlorobenzne (99%), oxazolone (90%), formaldehyde (36.5%), benzylideneactetone (98%), farnesal (85%), 2,3-butanedione (97%), 1-butanol (99%), 6-methylcoumarin (99%), lactic acid (85%), 4-methoxyacetophenone (99%)과 양성대조물질 cinnamaldehyde (95%)은 sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

펩타이드인 cysteine (Ac-RFAACCA-COOH, > 96%, molecular weight 750.35) 및 lysine (Ac-RFAAKAA-COOH, > 98%, molecular weight 775.43)은 ㈜펩트론(Daejeon, Republic of Korea)에서 주문 제작하였다.

본 연구는 OECD TG 442C로 등재된 In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) 및 유럽연합 동물대체시험법 관련 연구 추진기관(EURL-ECVAM)의 검증 연구(ECVAM Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA for skin sensitisation testing DB-LAM Protocol No.15)에 의거하여 시험을 수행하였다(EURL-ECVAM, 2013; OECD, 2015a; MFDS, 2016; DB-ALM, 2020). 표준검량곡선을 작성하기 위해 시스테인 및 리신 함유 펩타이드 표준용액 0.534-0.0167 mM을 총 6 개 농도로 준비하였다. 농약 원제, 숙련도 물질 및 양성대조군(cinnamaldehyde)에 대한 용매는 acetonitrile, distilled water (DW), DW:acetonitrile=1:1(v/v), isopropanol, acetone, isopropanol:acetone=1:1(v/v), DMSO:acetone=1:9(v/v), DMSO:acetone=1:1(v/v)의 순으로 완전히 용해되는 것을 우선적으로 선정하였다. 시스테인 및 리신 함유 펩타이드 용액에 100 mM 시험 물질을 각각 1:10 및 1:50 비율로 혼합 하였다. 25 ± 2.5°C에서 24 ± 2시간 동안 암실에서 반응시킨 후, 펩타이드 용액은 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)에서 UV 검출기를 이용하여 220 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 펩타이드 소실률은 다음과 같은 식을 통하여 산출하였다.

평가된 시험 물질에 대해 산출된 시스테인 및 리신 소실률을 합산한 평균값으로 각각 4가지 무반응성, 저반응성, 중반응성 및 고반응성으로 분류된 예측모델을 통해 피부 감작성에 대해 판정하였다. 본 시험 전에OECD TG에서 제시된 숙련도 물질을 통해 시험의 숙련도를 검정하였으며. 실험은 총 3반복하여 진행하였다. 펩타이드 반응성 시험법에 대한 시험 진행과정을 도식화 하여 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1. 
Procedure of Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitization.

시스테인 함유 펩타이드 표준원액은 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5)에, 리신 함유 펩타이드 표준원액은 0.1M ammonium acetate buffer (pH 10.2)에 녹여 0.667mM이 되도록 준비하였다. 표준검량곡선 측정을 위해 각 펩타이드 표준원액 1600 μL와 acetonitrile 400 μL를 혼합하여 0.534 mM 농도로 제조한 후 희석용액(Dilution buffer, 0 mM)과 1:1(v:v) 비율로 6개의 농도까지 계대희석 하였다. 희석용액은 각 펩타이드 표준원액의 용매인 0.1 M phosphate buffer solution 또는 ammonium acetate buffer 8 mL에 acetonitrile 2 m L를 혼합하였다. 본 시험에 들어가기에 앞서 시험 물질조제 및 OECD TG 442C에 제시되어 있는 5개의 대조군(참고대조군 A, B, C, 양성대조군 및 동시용출대조군)을 제조하였다. 참고대조군 A는 시험 물질을 분석하기 전 HPLC시스템의 적합성을 증명하는 대조군, 참고대조군 B는 분석시간 경과에 따른 안정성을 증명하는 대조군, 참고대조군 C는 시험 물질에 사용된 용매가 펩타이드 소실률에 영향을 주지 않는 것을 증명하는 대조군이다. 양성대조군은 양성반응이 나타나는 물질로써 시험 물질과 펩타이드가 적절한 반응을 나타내는지 증명하는 대조군이다. 동시용출대조군은 시험 물질의 머무름 시간(Retention time)이 펩타이드 머무름 시간과 같아 겹치는지를 증명하기 위한 대조군이다. Acetonitrile 및 water를 Fisher-Scientific (Hampton, Rockingham, USA)사에 구입하여 용매로 사용하였으며 숙련도 물질, 선정된 시험 농약 10종 및 양성대조물질을 1 00m M의 농도로 3 m L씩 제조하였다. 본 시험에서는 시험 물질(100 mM)을 시스테인 펩타이드 용액과는 1:10, 리신 펩타이드 용액과 시험 물질은 1:50 비율로 혼합하여 각 군당 3개씩 조제하였다. 5개의 대조군의 경우, 시험 물질 대신 같은 용량의 용매를 넣어주어 각 군당 3개씩 조제하였으며 모든 시험 물질 및 대조군은 2 mL vial에 차광하여 반응시켰다.

펩타이드와 시험 물질을 반응시킨 시료를 분석하기 위해 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Model: Agilent 1220 series HPLC system, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다. 칼럼은 Zorbax SB-C18(3.5 μm, 2.1 mm × 100 mm, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, 용매 A (0.1% (v/v) Trifluoroacetic acid in water)와 용매 B (0.085% (v/v) Trifluoroacetic acid in acetonitrile)를 이동상으로 하여 0-10분에 이동상 용매 B가 10%에서 25%로 직선구배 후 10-13 분에 90%, 13 분에서 13.5 분에 10%, 13.5 분에서 20 분까지 10%가 되도록 하여, flow rate 0.35 mL/min로 설정하였다. UV spectrometer를 통해 220 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 주입량은 5 μL로 설정하였다(Table 1). 시험 분석순서는 검량표준액(STD1-6 및 희석용액)와 참고대조군 A, 동시용출대조군, 참고대조군 B, 분석시료 3반복(참고대조군 C, 양성대조군 및 시험물질 순으로) 및 참고대조군 B의 순서로 물질 분석 디자인을 설정하여 분석하였다.

펩타이드 소실률은 각 검체에서 피크 면적을 구하고 참고 대조군 C의 평균 피크 면적으로 나눈 값으로 결정하였다. HPLC분석의 유효성 기준으로는 표준검량곡선의 상관계수 R²값이 0.99를 초과하여야 하며, 양성대조군(cinnamaldehyde)의 평균 소실률은 3 반복하였을 때, 시스테인 함유 펩타이드는 60.8-100%, 리신 펩타이드는 40.2-69% 범위의 값을 나타내야 한다. 시험 물질 및 양성대조군 반복간 소실률의 표준편차의 경우 시스테인 및 리신이 각각 14.9%, 11.6% 미만이어야 한다. 참고대조군 A및 C의 펩타이드 평균 농도는 0.5 ± 0.05 mM 범위에 속해야 하고, 참고대조군 B와 C의 펩타이드 변이계수(coefficient variation) 값은 15% 이하여야 한다. 또한 동시용출대조군 간섭 물질 면적이 참고대조군 C 피크 면적 평균 10% 이상을 경우를 포함하여 위의 기준 중에 하나라도 충족하지 못할 시에는 재시험을 수행하였다. 예측모델을 통해 시스테인 및 리신 펩타이드 소실률 평균값이 0-6.38%일 경우 무반응성(음성), 6.38-22.62%일 경우 저반응성(양성), 22.62-42.47%일 경우 중반응성(양성), 42.47-100%일 경우 고반응성(양성)으로 판정하였다(Table 2). 또한 리신 펩타이드 피크 면적 값이 동시용출을 보일 경우, 시스테인 펩타이드 소실률 만으로 결과를 판정하였다(Table 3).

본 시험을 수행하기에 앞서 시험의 유효성을 검증하기 위해 OECD TG 442C에 기술된 부록 2 숙련도 시험(Proficiency test)을 수행하였다. 그 결과, 시스테인 및 리신펩타이드에 대한 표준검량곡선의 상관계수 R² 값은 0.99를 초과하였으며, 참고대조군 A, B, C 펩타이드 평균 농도가 0.5 ± 0.05 mM로 기준을 충족하였으며, 분산계수 또한 모두 15% 이하임을 확인하여 검증기준에 충족하였다. 양성대조군인 cinnamaldehyde의 반복의 평균 펩타이드 소실률(peptide depletion)은 각각 71.88% (cysteine peptide 기준 60.8-100%), 58.79% (lysine peptide 기준 40.2-69%)로 모두 허용 범위에 포함되었다.

숙련도 물질에 대한 시스테인과 리신 펩타이드 소실률(peptide depletion)의 평균은 2,4-Dinitrochlorobenzne에서 58.60% (고반응성, 양성), oxazolone은 65.64% (고반응성, 양성), formaldehyde는 24.88% (중반응성, 양성), benzylideneactetone은 46.38% (고반응성, 양성), farnesal은 13.23% (중반응성, 양성), 2,3-butanedione은 46.80% (고반응성, 양성), 1-butanol은 1.55% (무반응성, 음성), 6-methylcoumarin은 0.81% (무반응성, 음성), lactic acid는 1.55% (무반응성, 음성), 4-methoxyacetophenone에서 1.05% (무반응성, 음성)로 나왔다(Table 4). 1-Butanol에서 리신 펩타이드 피크와 동시용출(co-elution)이 보여 시스테인 펩타이드(Table 3)의 결과로 양성 여부를 판단하였다. 피부 감작성 판정은 OECD TG 442C 가이드라인에 기술된 결과와 비교하였을 때(Table 4) 모두 정확하게 판정되었다. 결론적으로, 숙련도 물질 10개 모두 OECD 가이드라인에 기술된 기준에 부합하여 본 시험을 진행하였다.

농약 원제 10종에 대한 시험을 수행 하기 위해서 숙련도 시험과 마찬가지로 시험의 유의성을 확보하였다. 그 결과, 시스테인 및 리신 펩타이드에 대한 표준검량곡선의 상관계수 R2 값은 0.99 이상이었으며, 참고대조군 A, B, C 모두 펩타이드 평균 농도가 0.5 ± 0.05 mM으로 나타났다. 변이계수 또한 모두 15% 이하임을 확인하였다. 양성대조군인 cinnamaldehyde 평균 소실률은 각각 65.80% (cysteine peptide 기준 60.8-100%), 56.56% (lysine peptide 기준 40.2-69%)로 모두 허용 범위에 포함되었다.

DPRA를 이용한 선정된 농약 원제 10종의 피부 감작성을 평가한 결과 농약 원제 10종 중에서 총 6종이 피부 감작성 양성으로 분류되었다(Table 4). 시스테인과 리신 펩타이드 소실률의 평균은 Benomyl에서 50.00% (고반응성, 양성), butachlor는 27.23% (중반응성, 양성), carbosulfan은 50.00% (고반응성, 양성), diazinon은 1.23% (무반응성, 음성), fluazinam은 59.91% (고반응성, 양성), glufosinate ammonium은 1.31% (무반응성, 음성), oxadiazon은 1.71% (무반응성, 음성), pretilachlor은 43.88% (고반응성, 양성), tebuconazole은 0.05% (무반응성, 음성), terbufos에서 20.94%(저반응성, 양성)로 나왔다(Table 4). Benomyl의 경우, 리신펩타이드 피크와 동시용출이 보여 시스테인 펩타이드의(Table 3) 결과로 양성 여부를 판단하였다. 농약 원제에 대한 피부 감작성 성적을 농약회사에서 등록 신청 시 제출한 자료 및 국제기구에서 기니피그 또는 마우스를 이용한 감작성 시험 결과 자료(in vivo data)를 바탕으로 하여 본 연구에서 사용한 동물대체시험법인 펩타이드 반응성 시험(DPRA)의 결과와 비교하여 피부 감작성 예측 정도를 확인한 결과(Table 4), 농약 원제 10종의 피부 감작성 판정은 기존 in vivo 실험 결과와 비교하였을 때, 모두 부합하는 것으로 나타났다. Benomyl, butachlor, carbosulfan, pretilachlor 및 terbufos 와 같은 일부 농약 원제의 경우, 시스테인 펩타이드 모델에서는 높은 감작성을 보였으나 리신 펩타이드에서는 상대적으로 낮거나 반응성이 없었다(Table 4). 이러한 시스테인과 리신 함유 펩타이드 소실률의 차이를 보이는 현상은 다른 연구 결과에서도 나타났다(Takenouchi et al 2014; Avonto et al., 2018). 이 현상은 DPRA 시험법에서 사용되는 두 종류의 펩타이드와 시험 물질의 특성 차이에 의한 것으로 판단된다. 즉, 피부 감작성을 일으키는 알레르겐의 대부분이 친전자성(electrophile) 특성을 보이는 물질이기 때문에 DPRA법에서 사용되는 친핵성(nucleophile) 아미노산과 공유결합이 이루어 지는데, 이러한 원리와 연관지어 볼 수 있다. 시험 물질과 펩타이드 간의 공유결합력은 Gerberick et al. (2004)이 친핵체와 친전자체 사이의 상호 작용 메커니즘을 설명해주는 굳은 산 및 무른 산 이론(Hard and Soft Acid and Base theory, HSAB theory)을 제시하였고, 이와 관련하여 상대적으로 경질 친핵체(hard nucleophile)인 리신펩타이드의 경우, 피부 감작성 물질이 연질 친전자성(soft electrophile)인 경우에 서로 반응성이 낮아 펩타이드 소실률에 영향을 줄 수 있는 것으로 보고하였으며, 본 연구에서도 이와 같은 이유로 시스테인과 리신 간의 펩타이드 소실률 차이가 나타날 수 있다. 또한 펩타이드 산화를 촉진하는 물질의 경우에는 펩타이드 소실이 실제보다 과대평가 될 수 있을 가능성으로 인해 농약 원제에 대한 펩타이드 반응성이 다를 수 있다(Lepoittevin, 2006; OECD, 2015a; Avonto et al.,2018; Cho, 2018). 최근에는 펩타이드 산화를 일으키는 물질에 대해 측정이 어려운 DPRA 시험법의 단점을 보완하여, 좀 더 안정된 형태의 펩타이드 모델을 이용한 Amino acid Derivative Reactivity Assay (ADRA)방법 및 시험 조건을 완화한 시험법들이 다양하게 개발되고 있다(Gerberick et al., 2009; Lalko et al., 2012; Yamamoto et al.,2015; Zhang et al., 2018; Patel et al., 2019; Cho et al., 2019).

화학물질의 독성 연구에 대해 기존의 연구자들은 수많은 동물의 희생이 불가피 한 것으로 여기고 실험동물을 사용하였지만, 윤리적인 문제 및 동물시험에서의 결과와 실제 결과가 일치하지 않는 경우도 존재하였다. 또한 실험동물의 사용을 줄이고 대체하자는 국제적인 동향에 따라 그동안 기니피그 또는 마우스를 이용하여 평가했던 피부 감작성 평가를 in chemico 대체시험법인 DPRA를 활용하여 합성 펩타이드 모델로 대체하는 것은 다른 피부 감작성시험들과 비교하여 사용 가능한 가장 간단하고 예측력이 높은 방법 중 하나이다(Gerberick et al., 2007; Dimitrov et al., 2015; Avonto et al., 2018). 이외에도 시험에 소요되는 기간이 짧으며 시험 비용을 절감할 수 있다(MFDS, 2017; Cho et al., 2019). 그러나 DPRA 시험법은 HPLC 분석 기기를 이용하기 때문에 종류와 분석 조건에 따라서도 결과가 실험실 간 다소 차이를 보일 수 있어 in vivo 시험법인 LLNA 시험에 비해 정확도가 낮을 수 있다(Gerberick et al., 2007; MFDS, 2016; Cho et al., 2019). 그 밖에도 DPRA 시험법은 세포를 사용하지 않는 in chemico 방법이기 때문에 시험 물질마다 피부에 접촉되기 이전 또는 세포 내에서 어떠한 변형을 거칠 경우 DPRA 시험법으로는 정확한 판정이 어려울 수 있다(Lepoittevin, 2006; Troutman et al., 2011; Lalko et al., 2012; MFDS, 2016). 따라서 동물대체시험법을 이용한 피부 감작성 평가의 정확도를 재고하기 위해서는 추가적으로 피부 감작 독성발현경로(AOP)의 다른 주요한 단계(key event 2-4)들을 함께 보완할 수 있는 다양한 in vitro 시험법들과 조합하여 통합독성평가(Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA)를 해야 한다. 농촌진흥청의 고시 중 농약의 인축독성 시험성적서 검토 기준에서도 마찬가지로 key event를 바탕으로 순차적인 시험 전략을 이용하여 피부 감작성을 검토하도록 되어있다(Takenouchi et al., 2014; Tollefsen et al., 2014; OECD, 2016b; Avonto et al., 2018; Ohtake et al., 2018; RDA, 2020).

농약 원제 및 품목에 대한 독성 및 안전성 평가는 매우 중요하기 때문에 적법한 절차와 객관적인 시험기법으로 검증하는 필수적인 과정이 요구된다. DPRA는 주로 화장품의 원료로 쓰이는 단일 물질에 한하여 동물대체 피부 감작성시험으로 확대되고 있는데 비해, 농약 원제에 대해서는 선행연구가 많이 부족하다는 한계를 가지고 있다. 따라서 본 연구를 통해 DPRA를 활용하여 농약의 등록에 필요한 독성평가 시험 자료로 제공될 수 있을 것이라고 생각된다.