Current Issue

2017년 8월 전라남도 영광군 흥농읍(35°24'15.9"N 126°28'28.4"E) 소재지의 인삼 재배 포장에서 4년생을 대상으로 인삼 뿌리 썩음 병징으로 보이는 시료를 채집하였다. 포장에서의 병 발생 정도는 30개체를 기준으로 감염된 식물체의 뿌리를 대상, 육안으로 조사하였다. 조사한 값은 %로 평가하였다. 병원균의 순수 분리를 위해 인삼의 뇌두와 뿌리를 0.5 cm 크기의 절편으로 절단하여 각각 70% ethanol 30초, 1% Sodium hypochlorite (NaOCl) 30초 침지 하여 표면 살균 후 멸균수로 2회 세척하였다. 병반 조직은 9 cm filter paper에서 습기를 제거한 후 water agar (WA; 20 g of agar per L)에 치상 하여 27°C 배양기에서 암 조건으로 3일간 배양하였다. 병반 조직에서 자란 균사를 떼어내 PDA (PDA; 24 g of Potato Dextrose Broth ([BD Difco, USA], 20 g of agar per L) 배지에서 5일간 27°C에서 암 조건으로 정체 배양 후 형태학적 동정 및 분자생물학적 동정을 진행하였다.

분리 배양된 균주의 genomic DNA를 추출하고자 CTAB buffer를 사용하였다(Graham et al., 2003). 멸균된 E-tube에 500 μL의 CTAB buffer에 균사를 넣은 뒤 4 μL Proteinase K (25 mg/mL)를 첨가하여 65°C에서 30분간 반응시켰다. 이후 E-tube에 700 μL의 Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol(PCI; 25:24:1) 을 첨가하여 pipette으로 혼합한 준 다음 12,470 × g, 4°C에서 10분간 원심 분리를 진행하였다. 상층액을 새로운 E-tube로 옮긴 후 400 μL의 Isoprophanol을 첨가하여 12,470 × g, 4°C에서 5분간 원심 분리를 진행하고 상층액을 제거하였다. DNA 정제 과정에서 사용된 잔여물을 제거하기 위해 700μL의 70% ethanol을 첨가하여 12,470 × g, 4°C에서 5분간 원심분리 후 ethanol을 버리는 과정을 2회 반복하였다. 마지막으로 20 μL TE buffer (5 mL of 1M Tris pH 8, 1mL of 0.5M EDTA pH 8, 496mL of dH₂O)에 정제된 DNA를 녹인 후 농도를 검증하고자 1 μL를 이용해 Nano Drop 2000C spectrophotometer (Thermo scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.

분자생물학적 동정을 위해 ITS 영역: ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'), ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), Long subunit for Ascomycota: F (5'-AACKGCGAGTGAAGCRGYA-3'), R (5'-CSATCACTSTACTTGTKCGC-3'), Short subunit: F (5'-TGTTACGACTTTTACTT-3'), R (5'-TTTGACTCAACACGGG-3') 로 3종류 프라이머세트를 이용하여 PCR을 진행하였다 (White et al., 1990; Asemaninejad et al., 2016; Zaremski et al., 2019). 증폭된 절편들은 Expin^TM Gel SV kit (BIONEER, Republic of Korea)를 이용하여 정제 후 Macrogen (Seoul, Republic of Korea)에서 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI Nucleotide BLAST search program (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 동정하였으며 maximum likelihood method를 사용하여 MEGA 10 program유사성 검증을 통해 계통수를 작성하였다.

형태학적 동정으로 대형 분생포자 형성을 위해 2 X V8(20% V8 broth, 4 g CaCO₃, agar 20 g per L) 배지에 7일간 배양 후 멸균된 cheese cloth로 포자 현탁액을 수집하고 현미경 (BX53, Olympus, Tokyo, Japan)에서 400배율로 관찰하였다.

분리된 뿌리 썩음 병원균의 병원성 검증은 건전한 3년근 인삼 뿌리에 병원균 접종하여 검정하였다. 실험 처리구는 병원균을 처리하지 않은 무처리구와 각 병원균 F. solani, F. oxysporum으로 설정하였다. 모든 처리구는 주사기(15 mL)를 이용하여 인삼의 뇌두, 중간, 잔뿌리에 3번씩 찔러 상처를 낸 뒤 PDA (PDA; 24 g of Potato Dextrose Broth [BD Difco, USA], 20 g of agar per L)에서 배양된 병원균을 Cork bore (diam. 4-mm)로 자르고 needle을 이용하여 균사조각이 상처부위에 닿도록 고정하였다. 병원균이 접종된 인삼은 플라스틱 용기에 넣기 전 멸균수로 적셔준 여과지를 깔고 거름망 위해 고정시킨 뒤 28°C 항온기에 보관을 하였다. 인삼에서의 병반은 병원균 접종 5일 후에 확인하였다.

인삼의 근권에서 미생물 분리를 위해 뿌리의 표면 토양을 붓으로 털어 근권을 수집하였다. 수집된 토양으로부터 미생물을 분리하기 위해 토양 0.5 g을 멸균수 9mL을 튜브에 넣고 10초간 vortexer로 혼합하였다. 현탁액 1mL을 9mL의 멸균수에 혼합한 다음 10^-5, 10^-6, 10^-7의 농도로 희석하였다. 희석액 100 μL를 1/5 TSA (Tryptic soya broth 30 g, agar 20 g per L)배지에 도말 후 27°C 항온기에 3일 동안 배양하였다. 배지에서 자란 미생물 군락은 1/5 TSA에 획선법(streaking)으로 한 개의 균총을 확보하였다. 보관 균주 제작을 위해 96 well plate에 100 μL TSB (Tryptic soy broth 30 g per L)배지를 분주 후 단일 균총을 접종하였다. 이 후 27°C에서 3일간 진탕 배양을 하였다. 배양이 완료된 96 well plate에 50% glycerol 100 μL 첨가하여 Platemax®Pierceable Aluminum Sealing Film (Axygen, Union City, CA, USA)로 밀봉하여 –20°C에 보관하였다.

분리된 근권 미생물을 인삼 뿌리 썩음 병원균과 대치 배양을 통해 길항 미생물을 선발하였다. 대치 배양은 3 단계로 진행되었으며 1 단계로 tray plate에 PDK (Potato dextrose broth 10 g, Peptone 10 g, agar 20 g per L) 배지를 제조한 후 replica를 이용하여 96 well에 있는 보관 균주를 접종한 뒤 27°C에서 2일간 배양하였다. 이후 PDA 배지에서 배양이 완료된 병원균을 tray plate에 접종하여 27°C에서 대치 배양 진행하였다. 1 단계에서 clean zone을 보였던 colony를 2단계와 3단계에서는 PDK broth 배지 5mL에 접종하였다. 2일간 진탕 배양 후 OD₆₀₀ 값이 0.8이 되도록 조정하여 PDK agar 배지의 중심으로부터 3 cm 떨어진 위치에 중심선과 직각이 되도록 3 cm를 획선법을 실시하고 1단계와 동일한 조건으로 배양하였다. 분리된 미생물이 배양이 완료된 후 병원균을 중심부에 접종하여 27°C에서 5일간 대치 배양 후 clean zone의 길이를 측정하여 − no inhibition; + (low inhibition), 0.1–0.5 cm; ++ (medium inhibition), 0.5–1 cm; +++ (strong inhibition), 1–1.5 cm; ++++ (the highest inhibition), >1.5 cm을 기준으로 항진균능력을 검증하였다.

선발된 항진균성 미생물을 TSB 배지 5mL에 접종하여 3일간 진탕 배양한 뒤 2mL을 E-tube로 옮겨 원심분리기에서 12,470 × g 조건으로 3분간 반응하여 pellet를 확보하였다. Pellet이 형성된 E-tub에서 상층액은 버린 후 CTAB buffer 500 μL를 넣고, CTAB 기법으로 DNA를 정제하였다(Graham et al., 2003). 이 후 분자 생물학적 동정을 위해 16S rRNA 영역을 증폭하였으며 PCR 과정에서 Genomic DNA 1 μL (100 ng/μL), Primer (10 pmol) 1 μL, dNTP (10 mM) 1 μL, 10 × reaction buffer 2 μL, Taq polymeraes 0.2 μL (500 unit), ddH₂O 12.8 μL로 최종 20 μL 반응물을 조제한 후 PC을 수행하였다. 사용된 프라이머는 27 F (5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 1492 R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하였으며 증폭된 산물을 1% agarose gel에 전기 영동을 하여 약 1400 b의 증폭된 DNA 절편은 Expin^TMGel SV kit (BIONEER, Republic of Korea)로 정제 후 Macrogen (Seoul, Republic of Korea)에서 염기서열 분석을 진행하였다. 분석된 염기서열은 NCBI Nucleotide BLAST search program (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 동정 후 maximum likelihood method를 사용하여 MEGA 10 program 유사성 검증을 통해 계통수를 나타내었다.

2017년 8월 전라남도 영광군 흥농읍에 위치한 4년근 인삼재배지에서 잎의 가장자리가 갈색으로 변하면서 시들어가는 식물체가 발견되었다(Fig. 1A and B). 이러한 증상을 나타내는 인삼 개체수를 발병도로 확인한 결과 인삼 재배지에서 42%~67%가 확인되었다. 인삼 뿌리에서는 흰색의 균사체가 다량으로 형성되었다(Fig. 1C). 병징을 나타내는 식물체는 채집하여 해당 병원균을 분리하였고, 형태학적 동정과 분자유전학적 동정을 진행하였다. 채집하여 온 인삼 병반의 뇌두 부분에서 11개, 뿌리 부분에서 9개의 균체를 분리하였으며 광학현미경을 통해 포자를 이용한 형태학적 동정을 진행한 결과 3가지 형태가 관찰되었다. A type으로 양끝이 뾰족하며 긴 포자 형태로 2~4개의 격막을 가지며, 초승달 모양을 나타내는 3.5 ~ 5.5 × 25 ~ 30 μm 크기로 확인되었다(Y1, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8, Y9, Y10, Y11, Y12, Y13, Y17, Y18, Y 19). B type 유주자낭의 형태를 띠는 그룹(Y16, Y20, Y21), C type 포자를 관찰할 수 없었던 그룹(Y2, Y3, Y14)으로 크게 3가지 형태로 관찰되었다. 이후 3가지 유전자 영역인 Internal transcribed spacer (ITS), small-subunit (SSU) rRNA, large-subunit (LSU) rRNA 로 분자생물학적 동정 결과 A type은 NCBI BLAST 분석을 통해 각각 F. oxysporum, F. solani와 100% 일치하여 분자계통학적 유연 관계에 함께 속하는 것을 확인되었다(Fig. 2 and Fig. 3). B type은 Kim et al. (2020a)에 의해 보고된 Phytophthora cinnamomi로 확인되었다. 병징으로부터 분리된 20개의 균총은Fusarium sp.가 70%로 대부분을 차지하였으며 P. cinnamomi가 15%로 확인되었다(Kim et al., 2020a).

Fig. 1. 
Root rot symptom of disease on P. ginseng caused by Fusarium sp. (A): Panax ginseng cultivated field for 4 years, (B): Root rot disease symptom on above ground leaf, (C): Symptom of root disease symptom and white hyphae on root.

Fig. 2. 
Mycelium and conidia of pathogens isolated from P. ginseng root. (A): Colony of F. oxysporum, (B): Macroconidia of F. oxysporum (C): Colony of F. solani (D): Macroconidia of F. solani. Pathogen was incubated at 28°C for 5 days at PDA media and macroconidia as seen through the microscope with 400×.

Fig. 3. 
Phylogenetic tree obtained through the maximum-likelihood of MEGA 10 program using the ITS, SSU rRNA, LSU rRNA sequence of other isolates and that of other isolates of GenBank. (A): Phylogenetic tree of F. oxysporum, (B): Phylogenetic tree of F. solani

인삼에 토양 전염성이며 진균류 병원균으로는 Cylindrocarpon destructans, F. solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis 등의 여러 병원균들이 보고되어 있다(Lee et al., 2018). 이들 병원균은 토양 내에 장기간 서식하면서 뿌리 부위를 침해하므로 공기 전염성 병해의 국부적인 병반과는 달리 때때로 식물 전체를 죽게 하는 전신감염성의 병해를 초래한다(Lee et al., 2018). 인삼에 피해를 주는 병원균 중 고온 다습한 시기에 발병된 뿌리 썩음 병징으로부터 분리된 병원균은 F. oxysporum과 F. solani 가 70%를 차지하였다.

병원균 F. oxysporum, F. solani는 건전한 3년근 인삼에 접종하여 병원성 검증을 실시하였다. 무처리구에서는 병이 발생하지 않았지만(Fig. 4A) F. solani 병원균 처리구에서는 접종 부위를 중심으로 갈색 병반을 띄며 썩어 들어가는 것을 볼 수 있었으며 인삼의 표면이 벌어지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 표면에는 인삼 재배지에서 관찰된 흰색 균사체들이 뿌리를 덮었으며 절단면에서 뇌부 부분과 도관부의 갈변이 확인되었다 (Fig. 4B). F. oxysporum 처리구에서는 접종부위에서만 일부 갈변 된 현상이 관찰되었으며 F. solani와 비교하여 병원성이 약한 것을 확인하였다(Fig. 4C). 이러한 인삼 뿌리로부터 코흐의 가설을 검증하고자 병원균재분리가 진행한 결과 접종하였던 병원균과 동일한 Fusarium sp.가 재분리 되었다. 이를 통해 인삼재배지에서 뿌리 썩음병 감염의 원인균로 Fusarium sp. 임을 뒷받침할 수 있는 근거를 확보하였다.

Fig. 4. 
Pathogenicity test of P. ginseng (A): Control treated, which had wound with syringe and no inoculated pathogen, (B): F. solani treatment, (C): F. oxysporum treatment. All treatments are inoculated treated at 28°C, 90~95% relative humidity for 7 days (n = 3).

인삼 근권에서 분리한 미생물은 총 1508개이며, 이 중 고병원성인 F. solani strain Y9과 1단계 대치 배양을 통해 길항미생물 59개를 선발하였으며 2 단계 대치배양에서 17개, 3 단계 대치배양에서 13개가 선발되었다. 그 중 4-1 C4, 4-1 C6, 4-1 D6, 4-1 E6, 4-1 F6, 4-1 H6, 4-1 H11, 4-3 F4, 5-1 G7등 9개가 길항세균으로 선발되었다. 선발된 9개의 균주 중 F. oxysporum에 대해서는 4-1D6, 4-1C4, 4-1C6, 4-1E6, 4-1F6, 4-1H6, 5-1G7균주가 높은 항균 활성을 나타냈다(Table 1; Fig. 5A). 5-1G7는 F. solani에 대해 우수한 항균 능력이 확인되었다(Fig. 5B). F. oxysporum를 억제하지 못했던 4-3F4 균주는 F. solani에 대해 항균 활성을 띠었고 4-1C4, 4-1C6, 4-1D6, 4-1E6, 4-1F6, 4-1H6, 4-1H11는 F. solani에 대해 모두 억제 능력을 지니고 있음을 검증하였다.

Fig. 5. 
Antifungal activity test using isolated bacteria (A): Antifungal assay against to F. oxysporum, (B): Antifungal assay toward to F. solani. Bacteria (OD₆₀₀ 0.8) was streak on PDK media and incubated for 2 days. After 2 days, a pathogen (0.4-cm diam.) was inoculated at the center of the plate and incubated at 28°C for 5 days (n = 3).

뛰어난 항균능력을 나타낸 9개의 길항미생물은 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 분류 및 동정이 진행되었다. 4-3F4 균주는 Ensifer adhaerens로 동정되었으며 나머지 8개의 균주는 모두 Genbank의 각각 Bacillus subtilis, B. velezensis와 100%로 일치함이 확인되었고 분자계통학적 유연 관계 분석에서도 함께 속함을 알 수 있었다(Fig. 6A and B). Bacillus 속에 속하는 균주 들은 인삼의 뿌리 썩음병에 관여하는 F. oxysporum과 F. solani에 대해 뛰어난 항 진균능력을 나타내는 것을 확인하였다. 기존의 보고에 따르면 인삼에서 뿌리 썩음 병의 원인균인 Fusarium과 C. destructans 대해 항진균능력을 지니고 있는 Bacillus가 보고된바 있다(Jang et al., 2011; Song et al., 2014). 기존의 연구에서 보고된 바와 유사하게 인삼 뿌리썩음병에 항진균 능력을 나타내는 다양한 Bacillus 속을 선발하여 미생물 제제의 다양성을 확보할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 6. 
Phylogenic tree for Bacillus spp. from a Maximum likehood analysis. Phylogenic tree analysis with 16S rRNA region and Mega10 alignment.

국내에서는 인삼의 생물학적 방제로 인삼 모잘록병에 대한 Bacillus velezensis CC112와 뿌리 썩음병에 항진균능력을 나타내는 Bacillus sp. 가 보고된 바 있다(Kim et al., 2012; Kim et al., 2020b). Bacillus 균주는 국외에서도 생물학적 방제 인자로서 다양한 보고가 이루어졌으며 cyclic lipopeptides (bacillomycin D, fengycin, iturin, surfactin), a dipeptide (bacilysin), siderophore (bacillibactin), polyketides (bacillaene, difficidin, and macrolactin) 등과 같은 다양한 이차대사산물 생합성 관련 유전자를 보유하고 있어 병원성 세균 및 진균류에 대한 친환경 방제로 상품화되어 활용되고 있다(Lee et al., 2012). 본 연구를 통해 선발된 Bacillus sp.는 고온 다습한 환경에서 발생하는 인삼 뿌리 썩음병 방제인자를 지니고 있으며 생물적 방제 미생물로서 제형 개발, 포장에서의 효과 검정 등의 연구를 거쳐 실효성이 확인된다면 향후 인삼의 안정적 생산에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.