Current Issue

시판 석회보르도액의 경우 무작위로 시중에서 유기농업자재로 공시되어 있는 자재 중에서 선발하여 9종을 구입하여 활용하였으며, 시판 석회보르도액의 권장사용농도는 Table 1에서 보는 바와 같이 12~1000배로 평균 319배로 적용작물에 따라 다양한 처리농도를 추천하고 있다. 자가제조한 석회보르도액은 2-2식, 4-4식, 5-5식 및 6-6식 석회보로도액으로 국립농업과학원 “유기농업자재 만들기 쉽게 따라하기(NIAS, 2012)”에 제시한 석회보르도액 표준제조 방법에 따라 실험실에서 제조하여 사용하였다. 석회보르도액 자가제조에 사용한 생석회(CaO, BKP-96, (주)백광소재)는 순도 95%이며, 황산구리(㈜건도)는 순도 99.8%인 시험재료를 시중에서 구입하여 사용하였다. 자가제조한 2-2식, 4-4식, 5-5식 및 6-6식 석회보로도액의 제조에 사용된 생석회와 황산구리의 함량은 Table 1에 제시한 것과 같다.

실험에 사용한 인삼 탄저병원균(C. gloeosporioides JAFP5)과 세균뿌리썩음병원균(S. plymuthica JABP11)은 진안군농업기술센터의 유기인삼 3년근 재배포장에서 채집한 이병 식물체로부터 순수분리하여 배양하였다. 인삼 탄저병과 세균뿌리썩음병이 걸린 이병식물체로부터 병반부위와 건전부위가 포함되도록 50×50 mm 크기로 절단하여 70% 에탄올에 2분간 표면소독하고 멸균 증류수에 2회 세척한 후, 물한천배지(Water Agar)에 병징별로 4개씩 올려 28^oC 항온기에 3일간 배양하였다. WA배지에서 출현한 탄저병원균과 세균뿌리썩음병원균의 균총을 PDA (Potato Dextrose Agar)와 TSA (Tryptic Soy Agar)에 각각 옮겨서 28^oC 항온기에 7일간 순수배양하여 실험에 사용하였다. 세균뿌리썩음병원균의 현탁액은 실험 직전에 순수배양한 균총을 TSB배지에 접종한 후, 28^oC 항온기에 4일간 배양하여 실험에 사용하였다.

진안군농업기술센터의 유기인삼 3년근 재배포장에서 채집한 이병 식물체로부터 순수분리한 인삼 탄저병원균(C. gloeosporioides JAFP5)과 뿌리썩음병원균(S. plymuthica JABP11)로부터 각각 genomic DNA를 분리한 후, 인삼 탄저병원균의 ITS (ribosomal internal transcribed spacer) 부위를 PCR로 증폭하고자 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') primer를 사용하여 PCR을 행하였다(White et al., 1990). 인삼 세균뿌리썩음병원균의 16s rRNA PCR증폭은 27F (5'-AGAGTTTGACMTGGCTCAG-3')과 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGAC TT-3') primer를 사용하여 PCR을 행하였다(Frank et al., 2008). ITS와 16s rDNA 유전자 분석은 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 진행하였다. 각 식물병원균의 염기서열의 유전적 유사성은 NCBI (https://blast.ncbi.nlm.hih.gov/Blast.cgi)에 기탁 된 시퀀스와 비교하였으며 분자 계통 발생 수는 MEGA7 프로그램에서 수행되었다(Kumar et al., 2016). 초기 유전적 상관관계는 M CL (Maximu m Composite Likelihood) 접근 방식을 사용하여 추정하였으며 유전적 거리는 Neighbor-joining 알고리즘을 적용하여 표시하였다.

인삼 세균뿌리썩음병원균인 S. plymuthica JABP11에 대한 시판 석회보로도액 9종의 권장사용농도가 제품마다 다르고(Table 1), 자가제조한 석회보로도액 4종의 경우 원액을 사용토록 제조하였다. 따라서 서로 다른 석회보르도액의 항균력 검정을 위해 시판 및 자가제조한 석회보로도액 원액을 멸균증류수에 1.25%, 2.5%, 5% 및 10%(v/v)로 희석하여 멸균된 8×1.5 mm paper disk (Advantec Co. Ltd)에 30 μl씩 떨어뜨린 후, 30분간 크린벤치에서 건조한 후 실험에 사용하였다. 7일간 배양한 S. plymuthica JABP11의 단일 균총을 화염 살균한 백금선로 떠서 10ml 멸균증류수에 희석하여 200 μl씩 TSA배지에 고르게 도말한 후, 석회보로도액 종류별로 희석액을 투여한 paper disk를 일정한 간격으로 올려 28^oC 항온기에 7일간 배양하면서 24시간 간격으로 clear zone 형성의 크기를 조사하여 항균력을 평가하였다.

인삼 세균뿌리썩음병원균인 S. plymuthica JABP11에 대해 항균력이 우수한 석회보로도액 4종을 선발하여 인삼 탄저병원균인 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자 발아 및 부착기 형성 억제능력을 Doh와 Kill (2001)방법을 병행하여 검정하였다. 인삼 탄저병원균의 분생포자 현탁액은 7일간 배양한 균사체에 멸균증류수 20ml로 분생포자를 2회 수확하여 멸균된 킴와이프스에 2차례 걸러서 균사를 제거한 분생포자만 수집하여 4^oC 저온저장고에 보관한 후 실험에 사용하였다. 인삼 탄저병원균의 분생포자 발아 및 부착기 형성 억제능력 검정을 위해 석회보로도액 원액을 멸균증류수에 1.25%, 2.5%, 5% 및 10% (v/v)로 희석하여 24 well cell culture disk (SPL Life Sciences, USA)에 200 μl씩 떨어뜨린 후, 인삼 탄저병 포자현탁액을 1×10⁴ conidia/ml로 희석하여 접종하였다. 실험은 처리 당 3반복으로 실시하였고 28^oC 항온기에 배양하면서 12시간 간격으로 광학현미경으로 분생포자 발아와 부착기 형성 억제 정도를 조사하였다.

모든 결과는 SAS (Statistical Analysis System, Ver. 6.0, 2006) 프로그램을 이용하여 석회보르도액 처리에 따른 세균에 대한 항균력(clear zone), 분생포자 발아 억제율 및 공시한 석회보르도액 종류별 중금속 함량에 대한 통계적인 유의성 검정을 one way 분산분석(ANOVA: analysis of variance)으로 F 값을 구하고 T-test, 표준편차(SD) 및 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple rage test, p=0.05)을 이용하여 통계적 유의성을 검정하였다.

Fig. 1. 
Phylogenetic relationship between Colletotrichum gloeosporioides JAFP5 (A) and Serratia plymuthica JABP11 (B) isolated from ginseng plant constructed using the neighbor-joining tree analysis, based on the combined ITS region and 16s rRNA gene sequences.

Table 1과 같이 9종의 시판 석회보르도액과 4종의 표준제조방법에 따라 자가제조한 석회보르도액에 대한 성분함량, 적용작물, 권장 처리농도, pH 및 EC를 조사한 바, 시판 석회보르도액은 주원료로 생석회(Unslaked lime, CaO)를 사용한 비율이 44%이었고 소석회(Slaked lime, Ca(OH)₂)를 사용한 비율은 56%이었으며, 소석회에 대한 선호도가 다소 높은 것으로 조사되었다. 자가제조한 석회보르도액은 생석회(CaO)를 모두 사용하여 제조하였다. 석회보르도액 제조에 사용된 황산구리(CuSO₄·5H₂O)의 함량은 시판 석회보르도액은 0.4~20%로 다양한 농도의 황산구리를 사용하였으며 평균 11.1%의 황산구리의 함량을 나타내었다. 반면, 표준제조방법에 따라 자가제조한 석회보르도액의 황산구리의 함량은 0.2~0.6%로 평균 0.42%인 반면, 시판 석회보르도액에 비해 황산구리의 함량이 낮은 것으로 나타났다.

석회보르도액의 적용작물에 대해서는 시판 석회보르도액의 경우 CLBM6와 CLBM8을 제외하고 7종류 모두 과수와 채소작물에 적용 가능한 것으로 추천하였다. CLBM6의 경우는 벼에만 적용 가능한 것으로 표기하였으며 CLBM8은 적용작물에 대한 언급은 없으나 잿빛곰팡이의 예방 및 치료에 사용토록 권장하고 있다. 자가 제조한 석회보르도액 중에서 SMLBM5-5와 SMLBM5-6은 포도 잎점무늬병과 노균병에 적용토록 보고하였으며 SMLBM4-4는 양파의 노균병에 적용 가능하며, SMLBM2-4는 대부분의 채소와 식량작물 및 과수에 적용 가능한 것으로 추천하고 있다(Table 1).

시판 석회보르도액의 권장사용농도는 12~1,000배이며 평균 319배로 적용작물에 따라 다양한 처리농도를 추천하고 있다. 시판 석회보르도액 중에서 CLBM8과 CLBM9의 경우 각각 잿빛곰팡이병과 엽채소, 핵과류 및 단감에 1,000배로 희석하여 사용토록 권장하고 있으며 CLBM6의 경우 벼에 12배의 고농도로 처리할 것을 권장농도로 추천하고 있다. 자가 제조한 석회보르도액의 경우 물에 희석하지 사용하지 않고 원래 제조한 원액의 용량에 맞게 물에 희석하여 사용토록 기술하고 있다(Table 1).

시판 석회보르도액의 pH의 범위는 6.5~7.0으로 나타났고 평균 pH는 6.7이었다. 시판 석회보르도액 중에서 CLBM8의 pH가 6.5로 가장 낮게 조사되었으며, CLBM7의 pH는 7.0으로 가장 높았다. 자가제조한 석회보르도액의 pH의 범위는 6.8~7.1으로 나타났고 평균 pH는 6.9로 시판 석회보르도액의 평균값보다 높게 나타났다. 자가제조한 석회보르도액 중에서 SMLBM6-6의 pH가 6.8로 가장 낮았고 SMLBM2-4의 pH는 7.1로 가장 높았다(Table 1).

시판 석회보르도액의 EC의 범위는 9.1~195 mS/cm로 제품의 종류에 따라 다양하게 나타났고 평균 EC는 49.5 mS/cm 이었다. 시판 석회보르도액 중에서 CLBM4의 EC가 9.1 mS/cm로 가장 낮게 조사되었으며 CLBM8의 EC는 195 mS/cm로 가장 높게 나타났다. 자가제조한 석회보르도액의 EC의 범위는 1.6~3.7 mS/cm로 나타났고 평균 EC는 2.8 mS/cm로 시판 석회보르도액의 평균값보다 매우 낮게 나타났다. 자가제조한 석회보르도액 중에서 SMLBM2-4의 EC가 1.6 mS/cm로 가장 낮게 조사되었으며 SMLBM6-6의 EC가 3.7로 가장 높게 나타났다. 자가제조한 석회보르도액의 EC는 석회보르도액 중의 구리의 함량이 증가할수록 EC가 증가하는 것으로 보인다(Table 1).

인삼 탄저병원균과 세균뿌리썩음병원균으로부터 genomic DNA를 분리하여 ITS와 16s rDNA 유전자 단편을 PCR증폭하여 분자 종동정을 수행하였다. 인삼 탄저병원균의 ITS 유전자 단편은 520 bp로 NCBI 데이터베이스에서 상동성이 높은 염기서열을 검색한 결과, Collectotrichum gloeosporides(KX463021.1과 KX960911.1)과 99% 이상의 상동성을 보였다. 또한, 인삼 세균뿌리썩음병원균의 16s rDNA 유전자 단편은 1420 bp로 NCBI DB를 통해 상동성이 높은 유전자를 검색한 결과, Serratia plymuthica(CP065673.1, LS483469.1, MK720277.1, 그리고 NR_037111.1)와 100%의 상동성을 보였다. 따라서, 실험에 공시한 인삼 탄저병과 세균뿌리썩음병 균주를 각각 C. gloeosporioides JAFP5와 S. plymuthica JABP11로 명명하였다.

Figure 2와 같이 공시한 9종의 시판 석회보르도액과 4종의 자가 제조한 석회보르도액의 인삼 세균뿌리썩음병원균(S. plymuthica) 3종(P1, P2, P3)에 대한 항균력을 검정한 결과, 9종의 시판 석회보르도액 중에서 3종의 석회보드로액(CLBM7, CLBM8, CLBM9)은 3종의 S. plymuthica에 대하여 항균력(clear zone)이 12.5 mm 이상으로 조사되어 항균력이 높은 것으로 나타났다. 또한 4종의 자가 제조한 석회보르도액 중에서 SMLBM6-6만이 3종의 S. plymuthica 균주에 대해 항균력을 보이는 것으로 나타났다(Fig. 2). 그러나 인삼 세균뿌리썩음병원균 균주에 따른 시판 석회보르도액과 자가 제조한 석회보르도액의 처리간에 항균력의 통계적 유의성 차이는 없는 것으로 조사되었다(Fig. 2).

Fig. 2. 
Evaluation of commercial and homemade lime Bordeaux on the antibacterial activity against ginseng bacterial root rot pathogen, Serratia plymuthica (P1, P2, and P3) on TSA at 28^oC for 7 days. CLBM: CLBM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9 are the commercial lime bordeaux mixtures. SMLBM: SMLBM 1, 2, 3, and 4 are the self-made lime bordeaux mixture according to the standard method (NIAS, 2010). Error bars show the standard error among 10 replications. Mean with same letters are not significantly different in DMRT (p=0.05).

Table 2와 같이 인삼 세균뿌리썩음병(S. plymuthica JABP11)에 대한 항균력이 우수한 석회보르도액 4종을 선발하여 석회보르도액 처리농도(1.25~10%/v)별로 처리한 후, 12시간 간격으로 인삼 탄저병원균(C. gloeosporioides JAFP5)에 대한 포자발아와 부착기 형성에 미치는 영향을 살내에서 검정하였더니, 무처리의 경우 처리 12시간 이후 C. gloeosporioides JAFP5 분생포자의 발아율이 53.1%로 나타났고 48시간 후에는 73.0%로 높게 나타났다. 또한 무처리의 부착기 형성정도도 48시간 후에 30.3%로 나타났다. 대조구로 처리한 황토유황합제(LoS)의 경우 모든 처리농도(1.25~10%/v)에서 48시간 이후에 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자의 발아와 부착기 형성을 완벽하게 억제하는 것으로 나타났다(Table 2).

선발한 3종의 시판 석회보르도액 중에서 CLBM7과 CLBM8은 처리한 모든 농도(1.25, 2.5, 5.0, 10%/v)에서 48시간 동안 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자의 발아와 부착기 형성을 완벽하게 억제하였다. 시판 석회보르도액인 CLBM8는 2.5~10%/v의 농도에서는 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자의 발아와 부착기 형성을 완벽하게 억제하였으나 1.25%/v 농도에서는 처리 48시간 후에 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자의 발아률이 10.8%로 나타났고 부착기는 형성되지 않는 것으로 나타났다(Table 2, Fig. 2).

자가 제조한 석회보르도액인 SMLBM6-6도 2.5~10%/v의 농도에서는 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자의 발아와 부착기 형성을 완벽하게 억제하였으나 SMLBM6-6 1.25%/v 농도에서는 처리 48시간 후에 C. gloeosporioides JAFP5의 분생포자의 발아율과 부착기율이 각각 21.6%와 3.8%로 나타났다(Table 2, Fig. 3).

Fig. 3. 
Microscopic observation of the spore germination and appressorium formation of ginseng anthracnose fungus, Collectotrichum gloeosporioides JAFP5 treated with the commercial (CLBM8 (A-24 hr, B-48hr), CLBM9 (C-24 hr, D-48 hr)) and self-made (SMLBM6-6 (E-24 hr, F-48 hr)) lime bordeaux mixtures in vitro assay. Untreated control (G-24 hr, H-48 hr) was treated a distilled water same volume of each treatments. cs, conidia spore; gt, germ tube; ap, appressorium; my, mycelia.