Current Issue

실험에 사용한 지의류 추출물은 지의류 생물자원 소재은행(Korea Lichen Research Institute, KoLRI)에서 분양 받은 622종의 지의류 추출물을 사용하였다. 그리고 항세균성 지의류 추출물을 선발하기 위해 병원균을 1/5 TSA media(TSB, 6 g; Agar, 20 g per liter)를 제조하여 정체 배양기 및 진탕 배양기에서 20^oC, 3일간 배양하였다(Kim et al., 2019).

Psa3 균주는 1/5 TSA media에 선상도말하여 20^oC에서 3일간 정체 배양 후, 생성된 단일 colony를 1/5 TSB media 10 mL (TSB, 6 g per liter)에 접종하고 20^oC에서 3일간 진탕 배양하였다. 1차 screening에서 배양이 완료된 Psa3 균주는 1/5 TSB media를 이용해 OD₆₀₀에서 0.1로 희석하여 96-well plate (SPL, Korea)에 각각 100 μL 분주하였고, 622종의 지의류 추출물은 10 μL (V/V)로 3반복으로 첨가였다. 2차 screening은 1차 screening과 동일하게 균주를 OD₆₀₀에서 0.1로 희석 후 96-well plate에 각각 100 μL 분주하였고 항세균력이 높은 지의류 추출물을 선발하기 위해 5 μL (V/V)로 3반복으로 첨가하였다. 그리고 3차 screening은 지의류 추출물의 양을 1 μL (V/V)로 낮추어 5반복으로 진행하였다. 흡광도 측정은 1시간 간격으로 파장 600 nm에서 Microplate reader (BioTek, Synergy H1, Nederland)를 이용해 20^oC 조건으로 48시간 동안 측정하였다. 측정값을 통해 참다래 궤양병원균의 생장이 저해되는 정도를 두가지 방법으로 선발하였다. 절대값 수치인 48시간 배양 후 OD₆₀₀에서 배양 전 OD₆₀₀ 차이를 통해 선발하는 방법과 상대적 수치인 I(Represents inhibition rate)로 전환하여 1차: >90%, 2차: >95%, 3차: >98%를 기준으로 선발하였다(Liu et al., 2021). 최종적으로 두가지 선발 방법 모두에 해당하며 항세균력을 나타낸 지의류 추출물을 선발하였다.

• *CK: OD of untreated, T: OD of treated

항균활성 검정은 paper disc법을 진행하였으며(Ahn et al., 2009), Psa 병원균을 1/5 TSB media (TSB, 6 g per liter)에 20^oC에서 3일간 진탕 배양하였다. 1차 screening에서 1/5 PDK media (potato dextrose, 2 g; peptone, 2 g; agar, 20 g per liter)에 96-pin microplate replicator (Boekel Scientific, Feasterville, PA, USA)를 사용해 28^oC에서 5일간 배양하였다. 그리고 1/5 TSB broth에서 3일간 배양한 궤양병 병원균을 1/5 TSA media (TSB, 6 g; Agar, 3 g per liter)에 OD₆₀₀에서 0.3로 희석 후 5 mL 분주하여 20^oC에서 2일간 배양하여 주위에 형성된 생육저지대(growth inhibition clear zone)의 크기를 확인하였다. 2차 screening은 paper disc (8 mm)를 치상한 다음 OD₆₀₀에서 0.6으로 희석된 방선균 포자현탁액을 10 μL 분주후 28^oC 조건으로 5일간 배양하였다. 배양 후, 1차 screening과 동일하게 궤양병 병원균을 분주하여 생육저지대의 크기를 확인하였다. 마지막 3차 screening은 2차 screening에서 방선균의 분주량을 20 μL로 하여 3반복 진행하였으며, 병원균 분주 48시간 후 생육저지대의 크기를 측정하였다.

선발된 방선균은 16S rRNA, atpD, rpoB 그리고 trpB의 염기서열을 이용해 동정하였으며, MS agar (mannitol soya; mannitol, 20 g; soya, 20 g; agar, 20 g per liter)에 삼단 선상도말 하여 28^oC에서 3일간 배양 후, 단일 colony를 MS agar 배지에 전면 도말 하여 28^oC에서 5일간 배양하였다. 배양균의 DNA 추출 과정은 다음과 같다. 1.7 mL E-tube에 CTAB buffer [2% CTAB, 20 mM EDTA.Na₂.2H₂O, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris, pH 8.0] 500 μL (Valizadeh et al; Kim et al., 2017)과 배양한 균주를 넣은 후, Lysozyme solution (50 mg/mL)을 15 μL 첨가한 후 37^oC에서 1시간 배양하였다. 이후 Proteinase K solution (20 mg/mL)을 8 μL를 첨가 및 분쇄하여 65^oC Heating block에서 30분간 반응을 하였다. 반응 후 상온에서 10분간 식힌 다음 PCI (Phenol:Chloroform: Isoamyl alcohol, 24:25:1) 500 μL를 넣고 5~7회 좌우로 흔들어 혼합하였다. 다음 12,470 × g로 10분간 원심분리기를 작동하였으며, 상층액 400μL를 새로운 E-tube에 옮겨 Isopropanol 400 μL 첨가하였다. 첨가된 tube를 5~7회 좌우로 흔들어 혼합 후 12,470 × g으로 5분간 원심분리에서 DNA를 침전시켜 주었다. 마지막으로 70% Ethanol 500 μL 첨가하여 원심분리기에서 5분간 반응을 시켰으며 이후 상층액을 버리고 1~2시간 가량 건조를 진행하였다. 건조된 tube에 20 μL의 TE-buffer를 첨가하여 DNA를 녹인 후 농도를 검정하기 위해 1 μL를 이용해 Nano Drop 2000C spectrophotometer (Thermo scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다. 정제된 DNA는 16S rRNA, atpD, rpoB and trpB 영역을 증폭하기 위해 16S rRNA 유전자에 대하여 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)/ 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’), atpD 유전자에 대하여 atpDF (5’-GTCGGCGACTTCACCAAGGGCAAGGTGTTCAACACC-3’)/ atpDR (5’- GTGAACTGCTTGGCGACGTGGGTGTTCTGGGACAGGAA-3’), rpoB 유전자에 대하여 rpoBPF (5’-GAGCGCATGACCACCCAGGACGTCGAGGC-3’)/ rpoBPR (5’-CCTCGTAGTTGTGACCCTCCCACGGCATGA-3’), trpB 유전자에 대하여 trpBPF (5’-GCGCGAGGACCTGAACCACACCGGCTCACACAAGATCAACA-3’)/trpBPR (5’-TCGATGGCCGGGATGATGCCCTCGGTGCGCGACAGCAGGC-3’) primer (Rong and Huang, 2014)를 사용하였고 염기서열 분석은 Macrogen (Seoul, Korea)에서 진행하였으며 확보된 염기서열은 NCBI nucleotide blast search program (https://blast.ncbi.nih.gov/Blast.cgi)를 통해 동정하였다. 동정 후 maximum likelihood method를 사용하여 MEGA 10 program 유사성 검증을 통해 계통수를 나타내었다.

지의류 추출물의 3차 screening의 결과값을 이용한 성장곡선 그래프는 R program (version 4.0.3)의 ggplot2 package를 사용하여 시각화를 수행하였다. 그리고 방선균의 항세균 능력 측정값의 유의성 분석으로 Kruskal-Wallis Rank Sum Test를 진행하였으며 사후 분석으로 Tukey’s honestly significant difference test를 진행하여 분석이 완료된 결과 값은 R program (version 4.0.3)의 ggplot2 package를 사용하여 분석 및 시각화를 수행하였다.

지의류생물자원 소재 은행(Korean Lichen Research Institute (KoLRI)로부터 분양 받은 622종의 지의류 추출물을 대상으로 참다래 궤양병원균 Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)에 대한 길항 능력을 확인하였다(Fig. 1). 절대값 수치인 48시간 배양 후 OD₆₀₀에서 배양 전 OD₆₀₀의 차이를 통해 선발된 10종은 C-3B, C-7F, E-10B, G-1A, G-5B, G-7A, G-8A, H-5D, H-7F, H-8E이었으며 각 Parmelia sulcate, Melanelia, Parmotrema, Crustose sp., Myelochroa irrugans, Parmelia pseudolaevior, Umbilicaria esculenta, Lecanora, Stereocaulon sp., Pamalina conuplicans 균주로부터 추출되었다(Table 1). 선발된 항세균력을 가진 지의류 추출물 중 I (Inhibition rate, %) 결과값을 통해 C-3B, C-7F, E-10B, G-7A, G-8A, H-5D, H-7F (Parmelia sulcate, Melanelia, Parmotrema, Parmelia pseudolaevior, Umbilicaria esculenta, Lecanora, Stereocaulon sp.)의 추출물 7종을 최종적으로 선발하였다(Table 1). 공통적으로 선발된 지의류 추출물은 Table 2에서 7종으로 확인되었으며 그 중 5종은 항세균력과 항진균력을 가진 것으로 보고가 되었다(Ranković et al., 2006; Chauhan and Abraham, 2013; Wei et al., 2008; Santiago et al., 2010). 이러한 이유로 선발된 지의류가 참다래 궤양병원균에 대하여 길항 능력을 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 본 결과를 통해 선발된 지의류 추출물 중 기작이 보고 되지 않은 지의류 추출물이 항세균 능력으로 선발된 것을 통해 새로운 생물학적 방제 연구에 기초적 자료 마련을 할 수 있을 것이라 사료된다.

Fig. 1. 
Inhibition effect of lichen extracts against the Pseudomonas syringae pv. actinidiae. The bacterial stock added 100 μL and lichen extracts is 1 μL on 1/5 TSB broth medium (n = 5). Plate-96 well is incubated at 20^oC for 48 h. Lichen list: C-3B, C-7F, E-10B, G-7A, G-8A, H-5D, H-7F. Bacterial growth curve was calculated with ggplot2 package of the R (4.0.3).

본 실험실에서 국내 토양에서 분리 보관중인 방선균 자원 1,006개를 대상으로 참다래 궤양병원균인 Pseudomonas syringae pv. actinidiae에 대한 길항 능력을 확인하였다(Fig. 2). 검정 균주 1,006개 중 Psa와 1차 대치 배양을 통해 길항 능력을 지닌 방선균 51개, 2차 대치배양을 통해 5개, 3차 대치배양에서 4개가 최종 선발되었다(Table 3). 항세균작용이 가장 우수한 균주는 GU1E7으로서 참다래 궤양병원균과 대치배양 결과 병원균 생장억제력이 56.7% 였으며, 그 다음으로는 GU1D7 (55.8%), GU2C7 (54.2%), GU2C5 (50.8%) 순으로 참다래 궤양병원균을 억제함을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 또한 방선균을 처리하지 않은 대조구 보다 방선균처리구가 병원균의 생장을 더욱 강력하게 억제하는 것을 확인하였으며, 이전에 보고된 Streptomyces racemochromogenes W1SF4 (Kim et al., 2019) 보다 약 2배의 clean zone을 형성하는 것으로 확인되었다. 각 처리구별 유의성 확인을 위해 Kruskal-Wallis Rank Sum Test를 진행하였고, 결과 값으로 P 값이 0.02174812로 0.05보다 낮은 값을 나타내 처리구별 차이를 가진다고 확인하였다. 그리고 사후 분석으로 Tukey HSD (Tukey’s honestly significant difference test)를 통해 분석하였을 때 P 결과 값이 0.001보다 낮은 것을 확인할 수 있으며, 방선균을 처리한 처리구와 처리하지 않은 처리구가 차이가 유의미한 것을 확인하였다. 이전에 보고된 S. racemochromogenes W1SF4와 선발된 방선균의 항세균 능력 또한 P 결과 값이 0.001보다 낮아 차이가 있다는 것을 확인하였다. 항세균능력을 나타낸 4개의 길항균주는 유전자 염기서열을 통한 분류 및 동정을 진행하였다. 결과를 통해 확보된 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST를 이용하여 유전자 상동성을 검색한 결과를 기반으로 Streptomyces sp.와 99%의 유연관계를 보였으며 분자계통학적 유연 관계 분석에서도 함께 속함을 알 수 있었다(Fig. 3). 이를 바탕으로 계통학적 유연관계를 분석한 결과 Streptomyces sp. GU1D7 (Accession number: MZ081661), Streptomyces sp. GU1E7 (Accession number: MZ081647), Streptomyces sp. GU2C5 (Accession number: MZ081658), Streptomyces sp. GU2C7 (Accession number: MZ081660)으로 명명하였다. 그리고 각 균주의 16S rRNA, atpD, rpoB, trpB 유전자를 사용하여 계통학적 유연관계를 분석한 결과 보고된 균주들 중 유사한 종은 없는 것으로 확인이 되었으며, 항세균력을 가진 S. racemochromogenes W1SF4와는 다른 것으로 확인하였다(Fig. 4).

Fig. 2. 
Antibacterial rate of anti-Psa strains against Psa by disk diffusion assay. Streptomyces spp. was pre-inoculated with 20 μL of OD₆₀₀ 0.6. After 5 days later, added 5 mL of Psa bacterial stock (OD₆₀₀ 0.3) incubated at 20^oC for 2 days (n = 3). Tukey’s honestly significant difference test and bar graph were calculated with ggplot2 package of the R (4.0.3).

Fig. 3. 
Phylogenetic tree of the anti-Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains based on gene sequences by the maximum likelihood method and MEGA 10 alignment. The sequences of reference species were obtained from NCBI GenBank. (A): Phylogenetic tree of Streptomyces sp. GU1D7, (B): Phylogenetic tree of Streptomyces sp. GU1E7, (C): Phylogenetic tree of Streptomyces sp. GU2C5, (D): Phylogenetic tree of Streptomyces sp. GU2C7.

Fig. 4. 
Phylogenetic tree of strains GU1D7, GU1E7, GU2C5 and GU2C7 based on 16S rRNA and housekeeping genes (atpD, rpoB and trpB). Sequences were compared by multiple alignment analyses using Maximum likelihood method of MEGA 10 alignment.

국내에서는 참다래 궤양병에 대한 방제로는 동제 또는 항생제가 주로 사용되고 있는 상황이다(Lee et al., 2020). 이러한 화학적 방제는 식물에 미치는 약해와 과일에 잔류 등의 문제의 한계가 있다. 특히 이러한 방제제의 저항성을 가진 병원세균의 출현이라는 어려움을 겪고 있다. Streptomyces 균주는 국외에서도 생물학적 방제 인자로서 다양한 보고가 이루어졌으며 streptomycin, chloramphenicol, tetracycline, kanamycin, hygromycin (Procópio et al., 2012) 등과 같은 항생물질과 rapamycin, amphotericin, pikromycin (Hwang et al., 2014) 등과 같은 다양한 이차대사산물을 보유하고 있어 병원성 세균에 대한 친환경 방제제로 활용되고 있다. 기존의 보고에 따르면 참다래 궤양병원균인 Pseudomonas syringae pv. actinidiae에 항세균력을 지니고 있는 Streptomyces sp.가 보고된 바가 있다(Fang et al., 2017; Kim et al., 2019). 그리고 지의류(Lichen)의 경우 대부분 약용으로 사용되었지만 streptomycin과 penicillin이 발견된 후 대사 산물에 관한 연구가 활발히 진행되었다(Ingolfsdottir et al., 2002). 그 후 다양한 대사산물들이 발견되었으며, 실제 지의류의 추출물의 항균작용이 보고가 되었다. 하지만 Psa에 대한 지의류의 항세균 결과는 아직 보고가 된 것이 없다. 본 연구를 통해 선발된 Streptomyces sp.와a 지의류 추출물은 방제의 어려움을 겪고 있는 참다래 궤양병에 대하여 항세균 능력을 지니고 있으며 생물적 방제 균주 및 새로운 생물적 자원으로서 제형 개발 및 포장에서의 효과 검정 등의 연구를 통해 실효성이 확인된다면 향후 참다래의 안정적인 생산에 기여할 수 있을 것이라 사료된다.