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Tebufenozide와 teflubenzuron의 분석용 표준품은 Kemidas Co. (Suwon, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 시험대상 성분의 이화학적 특성은 Table 1과 같다. Acetonitrile (ACN)과 methanol, water는 Burdick & Jackson^TM (Honeywell International Inc, Morris Plains, NJ, USA)의 high-performance liquid chromatography (HPLC) grade를 사용하였고, ammonium formate (Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan)와 formic acid (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)는 순도 >98%를 사용하였다. 아로니아 중 tebufenozide와 teflubenzuron의 추출은 Phenomenex Inc. (Torrance, CA, USA)의 QuEChERS extraction kit (4 g MgSO₄ anhydrous, 1 g NaCl, 1 g sodium citrate tribasic dihydrate 및 0.5 g sodium citrate dibasic sesquihydrate)를 사용하였고, 추출 시료의 정제를 위한 dispersive-solid phase extraction (d-SPE)는 primary-secondary amine (PSA) 25 mg과 C₁₈ 25 mg 및 MgSO₄ 150 mg으로 구성된 Agilent Technologies, Inc. (Santa Clara, CA, USA)의 d-SPE kit와 Supelclean ENVI-Carb^TM (Supelco^®, Sigma-Aldrich, Inc., Bellefonte, PA, USA)를 사용하였다.

Pesticide	Tebufenozide	Teflubenzuron
Chemical structure
Mode of action	Ecdysone receptor agonist	Inhibitor of chitin biosynthesis
Molecular weight (g mol-1)	352.5	381.1
Solubility in water (20oC, mg L-1)	0.83	0.01
Vapor pressure (20oC, mPa)	1.56 × 10-4	9.16 × 10-4
log Kow	4.25	4.3

아로니아의 잔류성 시험은 경상남도 진주에서 7월부터 8월까지 실시하였으며, 시험기간 동안 시험포장의 일일 평균 온도는 22.3-29.1^oC이었고, 일 최대 강수량은 142.7 mm이었다(Fig. 1). 잔류 시험 품종은 블랙초크베리였고, 수령은 8-10년이었다. 잔류시험포장의 대조구는 10.5 m² (7.0 m × 1.5 m)로 조성하였으며, 시험구는 27 m² (18 m× 1.5 m)로 조성하여 시험구별 3반복 배치하였고, 시험구의 시험약제간 교차오염을 방지하기 위해 완충구를 3 m 이상 두었다. 아로니아에 대한 tebufenozide와 teflubenzuron의 잔류시험은 20% 액상수화제와 5% 액상수화제를 ㈜경농(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였고, tebufenozide와 teflubenzuron 2,000배 희석액을 충전식 분무기로 시험구 전체에 약액이 충분히 흐를 정도로 균일하게 7일간격 2회 살포 후 일시 수확하였다. 잔류분석을 위한 시료는 수확 당일 반복구당 1.0 kg 이상 수확하였으며, 수확한 시료는 냉장상태로 실험실로 옮긴 후 드라이아이스와 함께 곱게 분쇄하고 잔류분석 전까지 냉동 보관하였다.

Fig. 1. 
Weather condition for tebufenozide and teflubenzuron residue field trials on black chokeberry (Aronia melanocarpa).

Tebufenozide 잔류분석 시료는 균질화된 아로니아 시료 10.0 g에 ACN 10.0 mL를 가한 후 QuEChERS extraction kit를 첨가하여 30분간 진탕 및 초음파 추출(Powersonic 410, Hawshin Tech Co., Ltd., Seoul, Korea)하였다. 추출시료는 4^oC, 4000 rpm에서 10분간 원심분리(LABOGENE 1580R, Labogen^TM, Bio-Medical Science Co., Ltd., Seoul, Korea)하고, 상등액 1 mL를 취하여, d-SPE kit와 ENVI-Carb^TM 25 mg이 든 microtube에 넣고 3분간 vortexing한 후 syringe filter (PTFE, 0.22 μm, BIOFACT Co., Ltd., Daejeon, Korea)로 여과하여 잔류분석용 시료로 제조하였다. Teflubenzuron 잔류분석 시료는 tebufenozide와 동일한 방법으로 추출하였으며, 정제는 ENVI-Carb^TM 이 포함되지 않은 Agilent Technologies, Inc. (Santa Clara, CA, USA)의 d-SPE kit (PSA 25 mg, C₁₈ 25 mg, MgSO₄ 150 mg)를 사용하였다.

아로니아 중 tebufenozide와 teflubenzuron의 잔류분석은 LC-MS/MS (LC-MS 8050 Triple Quadrupole, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 Table 2의 조건에 따라 분석하였다. 이동상 용매는 5 mM ammonium formate를 포함한 0.1% formic acid 수용액과 5 mM ammonium formate와 0.1% formic acid를 포함한 methanol을 사용하였고, Phenomenex Inc. (Torrance, CA, USA)의 Kintex phenyl-hexyl (2.1 × 100 mm, 2.6 μm) 칼럼을 사용하여 분리하였다.

Tebufenozide와 teflubenzuron의 검량선 작성은 표준품을 이용하여 100 mg L^-1 stock solution을 제조한 후 무처리 아로니아 시료의 추출물로 희석하여 matrix-matched standard를 제조하였다. Tebufenozide와 teflubenzuron의 검량선은 0.005-0.500 mg kg^-1의 범위에서 작성하였고, signal/noise비 10이상을 기준으로 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 산출하였으며(Oh et al., 2020), 회수율 시험은 0.01 mg kg^-1과 0.1 mg kg^-1에서 3반복 수행하였다.

약제 처리 후 경과일수에 따른 잔류량 변화에 대한 회귀식을 Eq. 1에 적용하여 산출하였고, 작물 잔류 반감기(dissipation time, DT₅₀)는 Eq. 2를 사용하여 산출하였다(Lee et al., 2022).

Tebufenozide와 teflubenzuron의 잔류 안전성 평가를 위한 이론적 일일최대섭취량(theoretical maximum daily intake, TMDI)은 식품의약품안전처(Ministry of Food and Drug Safety, MFDS)의 잔류물질정보에 등록되어 있는 MRL과 2019년 국민영양통계 중 전체 연령의 식이 섭취량 자료와 국민 평균 체중(61 kg)을 Eq. 3에 적용하여 산출하였다(KHIDI, 2019; Lee et al., 2021). MFDS의 잔류물질정보에 등록되어 있는 일일섭취허용량(Acceptable daily intake, ADI)과 산출한 TMDI를 Eq. 4에 적용하여 %ADI를 산출하였다.

아로니아 중 tebufenozide와 teflubenzuron의 잔류분석을 위한 검량선의 직선성(R²)은 모두 0.999 이상으로 양호하였고, 아로니아에서 tebufenozide와 teflubenzuron의 LOQ는 0.005 mg kg^-1이었다. 아로니아에서 분석대상 성분의 회수율은 0.01 mg kg^-1와 0.1 mg kg^-1에서 시험하였고, 그 결과 tebufenozide의 평균 회수율은 93.7-98.2%이었으며, teflubenzuron의 평균회수율은 94.1-95.9% 이었다. 이들 정량분석에 대한 변이계수(Coefficient of variation, CV)는 0.6-3.9%이었다(Table 3).

20% Tebufenozide (SC) 2,000배 희석액을 7일간격 2회 살포 후 tebufenozide의 잔류량을 조사하였다. 수확 당일 약액 살포 후 tebufenozide의 초기 잔류량은 평균 2.861±0.337 mg kg^-1 (2.585-3.237 mg kg^-1) 이었고, 최종 약액 살포 21일 경과 후 잔류량은 평균 1.658 ± 0.295 mg kg^-1 (1.348-1.935 mg kg^-1) 이었다(Table 4). 최종 약액 살포 후 경과일수에 따른 tebufenozide의 잔류량은 Fig. 2와 같이 감소함을 확인할 수 있었다. 최종 약액 살포 14일 경과 후 잔류량은 초기 잔류량 대비 16.2% 감소하였으며, 21일 경과 후 시료의 잔류량은 초기 잔류량 대비 42.1%로 감소하였다. 시험기간 동안 아로니아 중 tebufenozide의 잔류량은 50% 이하로 감소하지 않았으며, 회귀식을 이용하여 산출한 잔류 반감기는 33.6일이었다. 이는 포도에서 보고된 tebufenozide의 작물 잔류 반감기(37.9-68.6일)와 유사하였다(Likas and Tsiropoulos, 2011).

Fig. 2. 
Dissipation pattern of tebufenozide (A) and teflubenzuron (B) in black chokeberry (Aronia melanocarpa).

5% Teflubenzuron (SC) 2,000배 희석액을 7일간격 2회 살포 후 경과일수에 따른 teflubenzuron의 잔류량을 조사하였다. 수확 당일 약액 살포 후 teflubenzuron의 초기 잔류량은 평균 1.035 ± 0.101 mg kg^-1 (0.972-1.151 mg kg^-1) 이었고, 최종 약액 살포 21일 경과 후 잔류량은 초기 잔류량 대비 65.0% 감소한 0.362 ± 0.048 mg kg^-1 (0.319-0.415 mg kg^-1)이었으며, 아로니아 중 teflubenzuron의 잔류 반감기는 16.4일이었다(Table 4). Teflubenzuron의 작물 잔류 반감기는 복숭아에서 11.5일로 유사하였으나, 초기 잔류량은 0.26 mg kg^-1으로 아로니아의 초기 잔류량이 4배 높았다(Yoon et al., 2012). 이러한 차이는 두 작물의 무게대비 표면적 비 등 작물의 형태적 특성에 의한 초기 잔류량의 차이로 판단되었다(Lee et al., 2022).

현재 우리나라에서 tebufenozide는 56종의 작물, teflubenzuron은 58종의 작물에 MRL이 각각 설정되어 있으며, 아로니아에 대한 tebufenozide와 teflubenzuron의 잠정 MRL은 각각 2.0 mg kg^-1과 1.0 mg kg^-1으로 설정되어 있다(MFDS, 2022). 이에 따른 전체 등록 작물에 대한 TMDI를 국민건강 영양조사의 농산물 식이 섭취량을 기준으로 산출하면 tebufenozide는 6.94×10^-1mg kg_bw^-1 day^-1, teflubenzuron은 5.26×10^-3mg kg_bw^-1 day^-1로 각각 ADI의 34.7%와 52.6%이었다. 다만, 아로니아에 설정된 잠정 MRL의 %ADI는 tebufenozide가 1.3%, teflubenzuron이 0.02%로 높지 않았다(MFDS, 2022). 다만, 20% tebufenozide와 5% teflubenzuron 2,000배 희석액을 7일간격 2회 살포할 경우 최종 약액 살포 21일 경과 이후 수확할 때 잠정 MRL 기준을 충족할 수 있으므로, 아로니아에 대한 20% tebufenozide와 5% teflubenzuron 액상수화제의 안전사용기준은 2,000배 희석액을 사용하되, 수확 21일 전까지 7일간격 2회 처리로 고려해 볼 수 있을 것이다.