The Korean Society of Pesticide Science

Current Issue

The Korean Journal of Pesticide Science - Vol. 27 , No. 4
[Paper List]

[ ORIGINAL ARTICLES ]
The Korean Journal of Pesticide Science - Vol. 21, No. 3, pp. 269-278
Abbreviation: Korean J. Pestic. Sci.
ISSN: 1226-6183 (Print) 2287-2051 (Online)
Print publication date 30 Sep 2017
Received 28 Jul 2017 Revised 08 Sep 2017 Accepted 12 Sep 2017
DOI: https://doi.org/10.7585/kjps.2017.21.3.269

LC-QTOF-MS를 활용한 현미 중 동물용의약품의 정량 분석
임성진† ; 오영탁† ; 노진호 ; 주형곤 ; 이민호 ; 윤효인 ; 최근형 ; 류송희 ; 김단비 ; 박병준*
농촌진흥청 국립농업과학원 화학물질안전과

Quantitative Analysis of Veterinary Pharmaceuticals in Brown Rice using Liquid Chromatography-Time of Flight Mass Spectrometry
Sung-Jin Lim† ; Young-Tak Oh† ; Jin-Ho Ro ; Hyeong-Gon Joo ; Min-Ho Lee ; Hyo-In Yoon ; Geun-Hyoung Choi ; Song-Hee Ryu ; Dan-Bi Kim ; Byung-Jun Park*
Chemical Safety Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju, 55365, Republic of Korea
Correspondence to : *E-mail: bjpark@korea.kr
Contributed by footnote: †These authors contributed equally to this work.

Funding Information ▼
초록

본 연구는 LC-QTOF-MS를 활용하여 현미 중 동물용의약품 분석을 위한 SPE cartridge 정제방법 및 다성분 동시분석법을 개발하고자 하였다. 현미 중 동물용의약품 분석을 위한 정제 방법은 HLB cartridge (500 mg, 6 mL)를 사용하였고, 그 용리액을 LC-QTOF-MS로 분석하였다. 개발된 분석방법의 유효성은 회수율, RSD 및 LOQ로 검증하였으며, 그 값은 각각 70.3-112.0%, 1.1-5.7% 및 0.076-7.6 μg/kg 이었다. 본 연구에서 개발된 동물용의약품 동시 분석법은 농업환경 및 농산물 중 이들의 모니터링에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract

SPE cartridge clean-up method for simultaneous determination of veterinary pharmaceuticals (VPs) in brown rice was developed and validated by LC-QTOF-MS. The clean-up method was established with HLB (500 mg, 6 mL) cartridges for VPs in brown rice, and the eluate was analyzed to quantify the compounds by LC-QTOF-MS. The developed method was validated, and the recovery, RSD, and LOQ of VPs were 70.3-112.0%, 1.1-5.7%, and 0.076-7.6 μg/kg, respectively. These results showed that the developed method for simultaneous determination of VPs contribute to monitoring of it in agricultural environment and agriculture product.

Keywords: Antibiotics, LC-QTOF-MS, Simultaneous determination, Veterinary pharmaceuticals
키워드: 항생제, LC-QTOF-MS, 동시분석, 동물용의약품
서 론

동물용의약품(veterinary pharmaceuticals)은 동물질병의 예방 및 치료를 위하여 사용하는 의약품으로, 양봉용, 양잠용, 수산용 및 애완용 의약품을 포함한다. 한국동물약품협회와 농림축산검역본부에 따르면 2015년 현재 우리나라에서는 tetracycline, penicillin, sulfonamide, macrolide, quinolone, ionophore, polypeptide, phenicol, aminoglycoside, pleuromutilin, lincosamide, cephem, strptogramin, orthosomycin, glycolipid, quinoxaline, nitrofuran 및 기타류 7002 품목의 동물용의약품이 허가되어 판매되었고(약 6,661 억원), 이 중 67.9%가 생물학적 제제, 사료첨가제, 항병원성 약으로 사용되었으며, 전체 판매된 동물의약품 중 사료첨가, 동물투여 및 원료의 비율은 각각 8.7, 89.5 및 1.8%로 대부분이 동물투여에 사용되었다.

우리나라 가축분뇨 발생량은 2013년 현재 72,103 농가(허가대상 17,115 농가, 신고대상 54,988 농가)에서 173,052 m3/일 발생하고 있으나, 런던협약에 따라 2012년부터 가축분뇨의 해양투기가 전면 금지되어 발생량의 6.6% (11,476 m3/일) 만이 101개의 가축분뇨 공공처리시설에서 처리되고 있는 실정이다(Ham et al., 2011; Environmental Statistics Yearbook, 2015). 동물에 투여된 동물용의약품 중 상당수는 체내에서 대사되지 않고 최대 90%까지 모화합물 형태로 분뇨를 통해서 배출되고, 이들은 가축의 배설을 통해 목초지에 직접 투여되거나 거름살포를 통해 간접적으로 환경에 투여된다(Huang et al., 2001; Boxall et al., 2002; Kulshrestha et al., 2004; Sassman and Lee, 2005). 직·간접적으로 환경에 투여된 동물용의약품은 토양에 직접적으로 유입되거나 관개수 및 유출수에 의해 하천 및 농경지에 유입되고, 용탈에 의해 지하수에 유입된다(Hirsch et al., 1999; Kim et al., 2008; Park et al., 2010; Kim and Myung, 2010; Huh and Myung, 2010; Zhao et al., 2016; Ide et al., 2016; Chen et al., 2016). 최근 농경지에 유입된 chloramphenicol, chlorotetracycline, enrofloxacin, erythromycin, lincomycin, norfloxacin, oxytetracycline, sulfadiazine, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulphathiazole, tetracycline, trimethoprim, tylosin 등의 동물용의약품이 감자, 고수풀, 고추, 당근, 무, 배추, 벼, 상추, 샐러리, 시금치, 오이, 옥수수, 유채, 토마토에서 0.02-42,510 μg/kg 수준으로 흡수됨이 보고되고 있다(Boxall et al., 2006; Dolliver et al., 2007; Hu et al., 2010; Seo et al., 2010; Sabourin et al., 2012; Kang et al., 2013; Wu et al., 2013; Goldstein et al., 2014; Malchi et al., 2014; Pan et al., 2014; Wu et al., 2014; Hurtado et al., 2016; Chung et al., 2017; Lee, 2017).

현미는 벼의 왕겨만을 벗겨낸 쌀로서 배(embryo), 배유(albumen) 및 쌀겨(호분)층으로 구성되어 있고, 백미에 비하여 영양분의 손실이 적으며 지방, 단백질, 비타민, 식이섬유 및 각종 무기질 등이 풍부하여 영양성이 뛰어나고, 콜레스테롤 저하작용, 혈압상승 억제, 항돌연변이 작용, 항산화 활성 등의 기능성이 알려져 국민들의 건강에 대한 관심이 증대함에 따라 백미보다 현미 소비가 증가하는 추세에 있다(Madaz, 1983; Muramoto and Kawamura, 1991; Champnagne and Hron, 1992; Chun et al., 1995; Choi et al., 1996; Kang et al., 2006; Kim et al., 2012; Lee and Han, 2015).

Liquid chromatography (LC)-quadrupole time of flight(QTOF)-mass spectrometry (MS)는 질량범위만 입력하여 분석하므로 분석법 설정에 소요되는 시간이 짧고, 스캔속도가 빨라 동시에 분석할 수 있는 성분 수도 제한이 없으며 정확한 분자량 및 조각이온의 패턴확인이 가능하여 항생제, 농약 등의 정량·정성분석 및 미지성분에 대한 동정에 사용되어 왔다(Prieto et al., 2011; Broecker et al., 2012; Masiá et al., 2013; Boix et al., 2014; Sirtori et al., 2014). 따라서 본 연구에서는 liquid chromatography (LC)-quadrupole time of flight (QTOF)-mass spectrometry (MS)를 활용하여 현미 중 국내 다사용 항생제에 대한 다성분 동시분석법을 개발하고자 하였다.

재료 및 방법
시약 및 표준품

조사대상 동물용의약품 amoxicillin, ampicillin, ceftiofur, chlortetracycline, doxycycline, erythromycin, fenbendazole, flumequine, lincomycin, oxolinic acid, oxytetracycline, penicillin, spiramycin, sulfadiazine, sulfamethazine 및 trimethoprim 표준품은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), clopidol, enrofloxacin, sulfadimethoxine, sulfamethoxazole, sulfathiazole, tiamulin, tilmicosin 및 tylosin 표준품은 Fluka (Shanghai, China)로 부터 구입하여 사용하였다 (Fig. 1).


Fig. 1. 
The structure of veterinary pharmaceuticals.

시료 정제를 위한 ENVI-Carb (500 mg, 6 mL) 및 LC-Si glass tube (1,000 mg, 6 mL) solid phase extraction (SPE) cartridge는 Supelco (Philadelphia, USA), NH2 (500 mg, 6mL), graphite carbon (500 mg, 6 mL) 및 primary secondary amine (PSA, 500 mg, 6 mL) SPE cartridge는 GL Sciences (Tokyo, Japan), Florisil (1,000 mg, 6 mL) 및 C18 (500 mg, 6mL) SPE cartridge는 Sillicycle (Quebec, Canada), hydrophilic lipophilic balance (HLB, 500 mg, 6 mL) 및 Wax (150 mg, 6 mL) SPE cartridge는 Waters (Massachusetts, USA), Silica gel (1,000 mg, 6 mL) SPE cartridge는 Applied Separations (Pensylvania, USA)로 부터 구입하여 사용하였다. 시료 중 동물용의약품 추출, 재 용해 및 기기분석을 위한 내부표준물질 umbelliferone과 triethylamine은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), methanol 및 ethanol은 J.T. Baker Tedia (Ohio, USA)의 제품을 사용하였다.

SPE cartridge 효율성 검증

현미 중 조사대상 동물용의약품 정량분석의 정제에 적용할 ENVI-Carb, NH2, Florisil, HLB, graphite carbon, Silica gel, LC-Si glass tube, Wax, C18 및 PSA SPE cartridge 효율성은 회수율 시험으로 조사하였다. 선정된 10종류의 SPE cartridge에 ethanol을 사용하여 1 μg/L 동물용의약품 혼합액을 제조한 다음 50 mL distilled water (DW)를 가하고, 이를 각각의 DW와 methanol로 활성화 한 각각의 cartridge에 loading 하였다. 각각의 cartridge에 methanol 12 mL를 가하여 흡착된 동물용의약품을 용리시킨 후 농축하고, 이를 내부표준물질 umbelliferone (1 mg/L) 함유 ethanol 5 mL로 재 용해하여 LC-QTOF-MS (DE/Impact II, Bruker Korea, Seongnam, Korea)로 분석한 다음 회수율을 산출하였다(Table 1, 2, 3). 이로부터 가장 양호한 회수율 결과를 나타낸 cartridge를 현미 중 동물용의약품 정량을 위한 재료로 선택하였다.

Table 1. 
Analytical conditions (HPLC-QTOF-MS) for veterinary pharmaceuticals in brown rice
Items Analytical conditions
LC instrument DIONEX Ultimate 3000
MS instrument Bruker, DE/Impact II
Column ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 μm, 2.1 × 100 mm
Mobile phase A: Water with 0.1% formic acid, B: Acetonitrile with 0.1% formic acid
Time (min) A (%) B (%)
0
1
25
28
28.5
30 		99
99
1
1
99
99 		1
1
99
99
1
1
Flow rate 0.25 mL/min Dry gas 10.0 L/min
Column temp. 35oC Dry temp. 200oC
Injection volume 10 μL Ion energy 6.0 eV
Ionization mode ESI Positive Collision energy 8.0 eV
Scan type MS (TIC) Mass range 50-1600 m/z
Run time 30 min

Table 2. 
The alignment process and parameters for LC-QTOF-MS
Items Contents
Target screening ○ Detection parameters
　• Retention time tolerance: ±1.5 min
　• Extracted ion chromatogram width: ±5mDa
　• Create chromatogram time slices: ±0.75 min
○ Identification parameters
　• Identification m/z tolerance: ±5 ppm
　• mSigma threshold: 50
Find ○ Molecular features
　• S/N threshold: 3
　• Correlation coefficient threshold: 0.7
　• Minimum compound length: 20 spectra
　• Smoothing width: 10
○ Chromatogram
　• Algorithm: version 2.0
　• Sensitivity: 99%
　• Minimum peak valley: 10%
Process ○ Smoothing width: 0.2[s]/Cycles : 1
○ Baseline subtraction of chromatogram
　• Flatness (0.0-1.0): 0.8
○ Smoothing of mass spectra
　• Smoothing width (m/z): 0.2[Da]/Cycles: 1
○ Baseline subtraction of mass spectra
　• Flatness (0.0-1.0): 0.8

Table 3. 
Mass spectrometer characteristics of veterinary pharmaceuticals
Name Protonated
molecular formula		 Retention time
(min)		 Theoretical mass
(m/z (M+H)+ )		 Detected mass
(m/z (M+H)+ )		 Error
(ppm)
Umbelliferone C9H7O3 7.8 163.0390 163.0384 3.4
Amoxycillin C16H20N3O5S 1.3 366.1118 366.1110 0.8
Ampicillin C16H20N3O4S 6.5 350.1169 350.1154 4.4
Ceftiofur C19H18N5O7S3 9.8 524.0363 335.1037 6.1
Chlortetracycline C22H24ClN2O8 8.8 479.1216 524.0352 1.1
Clopidol C7H8Cl2NO 5.4 191.9977 360.1704 3.9
Doxycycline C22H25N2O8 9.3 445.1605 262.0855 7.4
Enrofloxacin C19H23FN3O3 7.3 360.1718 262.0703 2.5
Erythromycin C37H68NO13 10.9 734.4685 479.1204 2.5
Fenbendazole C15H14N3O2S 12.6 300.0801 445.1596 2.1
Flumequine C14H13FNO3 11.6 262.0874 461.1534 4.4
Lincomycin C18H35N2O6S 6.0 407.2210 407.2196 3.4
Oxolinic acid C13H12NO5 9.4 262.0710 734.4648 5.1
Oxytetracycline C22H25N2O9 6.8 461.1555 843.5180 3.9
Penicillin C16H19N2O4S 11.8 335.1060 869.5699 3.9
Spiramycin C43H75N2O14 8.7 843.5213 916.5208 6.1
Sulfadiazine C10H11N4O2S 5.4 251.0597 251.0590 3.0
Sulfadimethoxine C12H15N4O4S 10.1 311.0809 311.0799 3.1
Sulfamethazine C12H15N4O2S 7.0 279.0910 279.0897 4.9
Sulfamethoxazole C10H12N3O3S 8.7 254.0594 254.0588 2.1
Sulfathiazole C9H10N3O2S2 5.9 256.0209 256.0198 4.4
Tiamulin C28H48NO4S 12.1 494.3299 291.1438 4.5
Tilmicosin C46H81N2O13 10.0 869.5733 494.3269 7.0
Trimethoprim C14H19N4O3 6.6 291.1452 191.9973 2.5
Tylosin C46H78NO17 11.3 916.5264 300.0774 9.2

분석법의 유효성 검증

현미 중 동물용의약품 잔류량 분석을 위한 분석법의 유효성은 검량선의 직선성, 회수율 시험, 정량한계(limits of quantitation, LOQ) 및 상대표준편차(relative standard deviation)로 검증하였다. 검량선의 직선성은 시험대상 동물용의약품 표준품을 ethyl alcohol에 각각 용해하여 내부표준물질 umbelliferone (1 mg/L) 함유 0.1-1,000 μg/L 수준의 표준용액을 조제한 다음 Table 1의 기기조건에서 분석한 다음 내부표준물질과 각각의 성분간 피크의 면적비율로 검량선을 작성하여 직선성을 확인하였다. 시험대상 항생제 각 성분의 LOQ는 S/N (signal to noise ratio) 비가 10이 되는 농도로 하여 다음의 식으로부터 산출하였다.

LOQμg/L=최소검출량pg×최종재용해량mL기기주입량μL×시료량mL(1) 

회수율 시험은 혼합표준용액을 현미 10 g에 25와 50 μg/kg 수준으로 처리한 다음 Fig. 2의 방법에 따라 3반복으로 실시하였고, 각각의 성분 피크면적을 각각의 검량선에 대입하여 산출한 농도와 첨가농도의 비로부터 회수율(%)을 산출하였다.


Fig. 2. 
Flow chart for analysis of veterinary pharmaceuticals in brown rice.

현미 중 동물용의약품 분석

현미 중 동물용의약품 잔류량 분석을 위한 시료 전처리는 시료(10 g)에 0.1 M triethylamine을 포함한 methanol 150(100+50) mL를 가하여 2회에 걸쳐 2시간 동안 진탕하여 추출하였다. Methanol 추출액을 감압 여과한 다음 40oC에서 감압농축(IKA RV 10 Digital, Staufen, Germany)하고, 증류수(distilled water, DW) 50 mL를 가하여 재 용해하였다. 이를 methanol 3 mL 및 DW 3 mL를 흘려주어 활성화 한 HLB cartridge (500 mg, 6 mL)에 loading 한 다음 methanol 12 mL로 cartridge에 흡착된 동물용의약품을 용리시켰다. 용리액을 감압농축하고, ethanol 5 mL를 사용하여 재 용해한 다음 LC-QTOF-MS로 분석하였다(Table 1, Fig. 2).

결과 및 고찰
SPE cartridge 효율성

현미 시료 중 동물용의약품 분석 시 정제에 적합한 cartridge를 선발하기 위하여 본 연구에서 시험된 ENVI-Carb 등 10개의 cartridge는 하천수, 과일, 작물, 커피, 우유, 폐수, 분뇨 등 다양한 시료에서 농약, 항생제, 곰팡이 독소 (mycotoxin), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), persistent organic pollutants (POPs) 등의 분석 시 정제과정에 사용되어 왔다(Tsubouchi et al., 1988; Sannino, 1998; Doong and Lee, 1999; Sheridan and Meola, 1999; Fernández et al., 2000; Moret and Conte, 2000; Jaraczewska et al., 2006; Karthikeyan and Meyer, 2006; Xu et al., 2009; Yoo et al., 2009). 선발된 10종류의 cartridge 효율성은 1 μg/L 수준의 24종의 동물용의약품 혼합액을 사용하여 회수율시험을 통하여 조사하였다. 10종류의 cartridge 중 HLB cartridge는 chlortetracycline, clopidol, doxycycline, oxytetracycline 및 tilmicosin 5종의 동물용의약품에서 회수율이 다소 낮은 39.6-63.8%를 이었으나, 이들을 제외한 19종에서는 회수율이 71.0-112.7% 범위로 농촌진흥청에서 권장하는 회수율 70-120% 기준을 충족하였다(RDA, 2016, Table 4). 따라서 현미 중 동물용의약품 다성분 동시분석을 위한 전처리 도구로서 HLB cartridge를 선정하였다.

Table 4. 
Recoveries of veterinary pharmaceuticals in selected ten cartridges
Veterinary pharmaceuticals Recovery (%)
A B C D E F G H I J
Amoxycillin 18.8 29.4 18.0 72.4 15.4 15.4 27.7 25.5 31.0 15.4
Ampicillin 3.4 3.4 3.4 74.8 3.4 5.0 3.4 3.4 11.1 3.4
Ceftiofur 0.8 0.8 25.5 72.5 0.8 2.1 2.1 0.8 27.5 0.8
Chlortetracycline 0.4 0.4 0.4 44.5 0.4 0.4 0.4 1.7 0.4 0.4
Clopidol 1.4 1.4 52.5 63.8 1.4 8.9 8.7 63.8 45.6 1.4
Doxycycline 2.5 2.5 2.5 48.4 2.5 2.5 2.5 6.2 2.8 2.5
Enrofloxacin 2.3 2.0 1.9 73.2 2.0 2.0 3.4 57.8 6.0 1.9
Erythromycin 2.9 2.9 62.6 99.0 3.0 50.9 2.9 62.5 11.3 3.2
Fenbendazole 2.4 2.4 55.1 86.8 2.4 53.4 29.9 75.6 75.0 2.6
Flumequine 4.1 4.1 4.1 93.1 4.1 13.3 12.5 75.6 58.1 4.1
Lincomycin 97.9 87.8 79.8 112.7 98.5 99.4 92.3 60.8 86.3 91.3
Oxolinic acid 1.5 1.5 1.5 71.0 1.5 4.7 2.3 68.6 53.0 1.5
Oxytetracycline 2.3 2.3 2.3 44.2 2.3 2.3 2.3 9.3 2.3 2.3
Penicillin 21.0 21.8 27.0 109.5 33.6 25.6 22.1 20.3 43.5 24.6
Spiramycin 21.1 21.1 33.2 73.4 21.1 38.6 35.6 41.0 21.1 21.1
Sulfadiazine 10.6 2.4 2.4 103.9 70.0 3.0 5.8 74.6 4.3 2.4
Sulfadimethoxine 1.7 1.7 11.3 89.0 1.7 4.3 5.4 69.2 19.3 1.7
Sulfamethazine 39.1 31.1 11.1 97.4 83.0 10.9 13.3 76.5 35.0 7.8
Sulfamethoxazole 2.7 1.4 4.8 102.8 19.4 4.5 4.7 78.1 4.9 1.4
Sulfathiazole 1.1 1.1 2.2 109.3 3.8 1.1 4.7 75.1 7.3 1.1
Tiamulin 4.4 4.3 59.6 72.0 4.3 81.3 67.1 68.0 65.0 4.7
Tilmicosin 3.2 3.2 21.9 39.6 3.2 4.3 3.2 43.8 3.2 3.2
Trimethoprim 1.3 42.6 67.5 99.6 1.0 90.7 76.8 73.0 75.1 9.4
Tylosin 1.1 1.1 51.9 74.7 1.1 56.8 49.8 50.9 48.4 1.2
A: ENVI-Carb, B: NH2, C: Florisil, D: HLB, E: Graphite carbon, F: Silica gel, G: LC-Si glass tube, H: Wax, I: C18, J: PSA

분석법의 유효성

본 연구에서는 분석의 정확성을 높이기 위하여 내부표준법을 사용하였으며, 내부표준물질로는 동물용의약품 정량에 쓰이는umbelliferone을 사용하였다(Wu et al., 2008). 동물용의약품 24종의 검량선은 0.1-1,000 μg/L 혼합표준용액(1.000 mg/L umbelliferon포함)을 제조하고, Table 1, 2 및 3의 LC-QTOF-MS 조건에서 분석한 다음 내부표준물질과 각 성분간 피크의 면적비율로부터 작성하였다. 각 성분의 머무름시간은 amoxicillin 1.3 (y=0.0019x+0.0292, R2=0.9862), ampicillin 6.5 (y=0.00104x+0.0355, R2=0.9929), ceftiofur 9.8 (y=0.0165x-0.0125, R2=0.9958), chlortetracycline 8.8 (y=0.0247x+0.0107, R2=0.9971), clopidol 5.4 (y=0.0181x+0.0251, R2=0.9912), doxycycline 9.3 (y=0.0691x-0.171, R2=0.9982), enrofloxacin 7.3 (y=0.0751x+0.1399, R2=0.9946), erythromycin 10.9 (y=0.0263x+0.6024, R2=0.9941), fenbendazole 12.6 (y=0.3188+0.7697, R2=0.9957), flumequine 11.6 (y=0.0463x+0.1887, R2=0.9959), lincomycin 6.0 (y=0.0573x+0.0977, R2=0.9946), oxolinic acid 9.4 (y=0.0418x+0.0639, R2=0.9961), oxytetracycline 6.8 (y=0.0142x+0.0322, R2=0.9928), penicillin 11.8 (y=0.0067x+0.1034, R2=0.9936), spiramycin 8.7 (y=0.0124x-0.2619, R2=0.9980), sulfadiazine 5.4 (y=0.006x+0.0143, R2=0.9901), sulfadimethoxine 10.1 (y=0.1019x+0.1685, R2=0.9955), sulfamethazine 7.0 (y=0.0399x-0.1427, R2=0.9939), sulfamethoxazole 8.7 (y=0.0314x+0.0425, R2=0.9950), sulfathiazole 5.9 (y=0.0051x+0.0056, R2=0.9947), tiamulin 12.1 (y=0.3806x+1.6423, R2=0.9930), tilmicosin 10.0 (y=0.0207x-0.0671, R2=0.9970), trimethoprim 6.6 (y=0.0926x+0.6609, R2=0.9894), Tylosin 11.3 (y=0.0903x+0.1033, R2=0.9960) 분 이었고, 검량선의 직선성은 상관계수(R2)가 >0.9862 으로 양호하였다(Table 3, Fig. 3).


Fig. 3. 
Standard chromatogram (A), representative ion chromatogram (B), mass spectrum (c), and recovery chromatogram of LC-QTOF-MS.

현미 중 동물용의약품에 대한 회수율 시험은 25와 50 μg/kg 수준에서 수행하였고, 그 결과를 Table 5에 나타냈다. Erythromycin, fenbendazole, penicillin 및 tylosin을 제외한 현미 중 동물용의약품 20 성분의 회수율, RSD 및 LOQ는 각각 70.3-112.0%, 1.1-5.7% 및 0.076-7.6 μg/kg 범위로 나타났다(Table 5). 이상의 현미 중 회수율과 RSD결과는 회수율 70-120%, RSD 20% 이하로 잔류분석법 기준에 적합하였다(RDA, 2016).

Table 5. 
Recovery, LOQ, and RSD of veterinary pharmaceuticals in brown rice
Veterinary pharmaceuticals Recovery rate (%) LOQ
(μg/kg)		 RSD (%)
25 μg/kg 50 μg/kg 25 μg/kg 50 μg/kg
Amoxycillin 95.7 ± 2.4 88.2 ± 2.0 7.6 2.5 2.3
Ampicillin 97.3 ± 3.2 90.2 ± 1.8 7.6 3.3 2.0
Ceftiofur 85.7 ± 1.8 92.4 ± 2.6 7.6 2.1 2.8
Chlortetracycline 77.4 ± 2.0 80.2 ± 3.2 1.5 2.6 4.0
Clopidol 70.3 ± 1.8 78.4 ± 1.8 7.6 2.6 2.3
Doxycycline 85.3 ± 2.2 80.2 ± 2.9 1.5 2.6 3.6
Enrofloxacin 77.2 ± 3.2 82.4 ± 3.0 1.5 4.1 3.6
Erythromycin 58.3 ± 1.4 50.4 ± 1.6 0.15 2.4 3.2
Fenbendazole 40.0 ± 1.0 42.4 ± 2.0 0.15 2.5 4.7
Flumequine 90.8 ± 2.8 84.4 ± 4.2 1.5 3.1 5.0
Lincomycin 93.8 ± 2.0 90.2 ± 2.2 0.15 2.1 2.4
Oxolinic acid 106.9 ± 3.4 84.4 ± 1.9 1.5 3.2 2.3
Oxytetracycline 86.7 ± 2.2 90.2 ± 1.0 7.6 2.5 1.1
Penicillin 54.9 ± 1.9 50.4 ± 2.3 7.6 3.5 4.6
Spiramycin 99.7 ± 3.2 80.4 ± 2.7 7.6 3.2 3.4
Sulfadiazine 107.3 ± 2.4 92.6 ± 1.5 7.6 2.2 1.6
Sulfadimethoxine 90.6 ± 1.9 88.4 ± 2.6 0.15 2.1 2.9
Sulfamethazine 97.0 ± 3.4 90.2 ± 3.2 1.5 3.5 3.5
Sulfamethoxazole 109.4 ± 2.6 90.8 ± 2.4 0.076 2.4 2.6
Sulfathiazole 95.3 ± 5.4 91.2 ± 1.8 7.6 5.7 2.0
Tiamulin 112.0 ± 2.8 102.4 ± 1.6 0.15 2.5 1.6
Tilmicosin 96.9 ± 3.2 84.4 ± 1.0 1.5 3.3 1.2
Trimethoprim 91.0 ± 2.6 85.7 ± 2.2 0.76 2.9 2.6
Tylosin 43.1 ± 1.0 56.8 ± 1.7 0.76 2.3 3.0

본 연구는 현미 중 동물용의약품 정량을 위해 HLB cartridge를 활용하여 정제하고, LC-QTOF-MS로 분석하는 방법의 유효성을 검증한 것으로, 현미 중 동물용의약품 20성분을 동시에 분석하는 다성분 동시분석법의 최초의 보고이다. 이 분석법은 농업환경 및 농산물 중 동물용의약품에 대한 모니터링 조사 및 분석법 개발을 위하여 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 우리나라는 2019년부터 국내 사용등록 또는 수입식품의 잔류허용기준(MRL, maximum residue level) 설정 신청으로 MRL이 설정된 농약 이외에는 일률기준(0.01 mg/kg)으로 관리하는 positive list system(PLS)을 모든 농산물에 적용한다. 식품의약품안전처는 식품위생법 제7조의3(농약 등의 잔류허용기준 설정 요청 등)에 따라 식품 및 수입식품에 잔류하는 농약관리법에 따른 농약, 약사법에 따른 동물용의약품의 잔류허용기준 설정이 필요한 자는 관련 자료를 쭓Y@제출하여 기준설정을 신청 및 요청할 수 있도록 하고 있다. 따라서 PLS가 모든 농산물에 적용되는 2019년 이후에는 본 연구에서 개발한 현미 중 동물용의약품 다성분동시분석법의 amoxicillin 등 일부 성분은 LOQ가 PLS의 일률기준 0.01 μg/kg 보다 다소 낮은 수준(7.6 μg/kg)으로 정량분석 요구 수준을 충족하지 못할 수 있으므로 이를 해결하기 위한 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것으로 판단된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업 및 국립농업과학원(PJ012600, PJ010922, PJ012092, PJ010822 및 PJ011435)의 지원에 의해 이루어졌습니다.

Literature Cited
1. Boix, C., M. Ibánez, J. V. Sancho, N. León, V. Yusá, and F. Hernández, (2014), Qualitative screening of 116 veterinary drugs in feed by liquid chromatography-high resolution mass spectrometry: Potential application to quantitative analysis, Food Chem, 160, p313-320.
2. Boxall, A. B. A., P. Blackwell, R. Cavallo, P. Kay, and J. Tolls, (2002), The sorption and transport of a sulphonamide antibiotic in soil systems, Toxicol. Lett, 131, p19-28.
3. Boxall, A. B. A., P. Johnson, E. J. Smith, C. J. Sinclair, E. Stutt, and L. S. Levy, (2006), Uptake of veterinary medicines from soils into plants, J. Agric. Food Chem, 54, p2288-2297.
4. Broecker, S., S. Herre, and F. Pragst, (2012), General unknown screening in hair by liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-QTOF-MS), Forensic Sci. Int, 218, p68-81.
5. Champnagne, E. T., and R. J. Hron, (1992), Stability of ethanolextracted brown rice to hydrolytic and oxidative deterioration, J. Food Sci, 57, p433-436.
6. Chen, G., X. Liu, D. Tartakevosky, and M. Li, (2016), Risk assessment of three fluoroquinolone antibiotics in the groundwater recharge system, Ecotoxicol. Environ. Saf, 133, p18-24.
7. Choi, S. W., S. H. Nam, and H. C. Choi, (1996), Antioxidative activity of ethanolic extracts of rice brans, Food Sci. Biotechnol, 5, p305-309.
8. Chun, H. S., I. H. Kim, and H. J. Kim, (1995), Effect of brown rice extract on mitomycin C-Induced chromosome aberration in cultured CHL cells, J. Korean Food Sci. Technol, 27, p1003-1007.
9. Chung, H. S., Y. J. Lee, M. M. Rahman, A. M. A. El-Aty, H. S. Lee, M. H. Kabir, S. W. Kim, B. J. Park, J. E. Kim, F. Hacimüftüo, lu, N. Nahar, H. C. Shin, and J. H. Shim, (2017), Uptake of the veterinary antibiotics chlortetracycline, enrofloxacin, and sulphathiazole from soil by radish, Sci. Total. Environ, 605-606, p322-331.
10. Dolliver, H., K. Kumar, and S. Gupta, (2007), Sulfamethazine uptake by plants from manure-amended soil, J. Environ. Qual, 36, p1224-1230.
11. Doong, R., and C. Lee, (1999), Determination of organochlorine pesticide residues in foods using solid-phase extraction clean-up cartridges, Analyst, 124, p1287-1289.
12. Fernández, J. M., P. P. Vázquez, and J. L. M. Vidal, (2000), Analysis of N-methylcarbamates insecticides and some of their main metabolites in urine with liquid chromatography using diode array detection and electrospray, Anal. Chim. Acta, 412, p131-139.
13. Goldstein, M., M. Shenker, and B. Chefetz, (2014), Insights into the uptake processes of wastewater-borne pharmaceuticals by vegetables, Environ. Sci. Technol, 48, p5593-5600.
14. Ham, S. K., Y. S. Kim, and H. J. Lim, (2011), The effect of developed SCB liquid fertilizer on the growth of Kentucky bluegrass, Asian J. Turfgrass Sci, 25, p73-78.
15. Hirsch, R., T. Ternes, K. Haberer, and K. L. Kratz, (1999), Occurrence of antibiotics in the aquatic environment, Sci. Total Environ, 225, p109-118.
16. Hu, X. G., Q. X. Zhou, and Y. Luo, (2010), Occurrence and source analysis of typical veterinary antibiotics in manure, soil, vegetables and groundwater from organic vegetable bases, northern China, Environ. Pollut, 158, p2992-2998.
17. Huang, C. H., J. E. Renew, K. L. Smeby, K. Pinkerston, and D. L. Sedlak, (2001), Assessment of potential antibiotic contaminants in water and preliminary occurrence analysis, Water Resour. Update, 120, p30-40.
18. Huh, M. J., and S. W. Myung, (2010), Simultaneous analysis of β-lactam antibiotics in surface water, Anal. Sci. Technol, 23, p119-127.
19. Hurtado, C., C. Domínguez, L. Pérez-Babace, N. Cañameras, J. Comas, and J. M. Bayona, (2016), Estimate of uptake and translocation of emerging organic contaminants from irrigation water concentration in lettuce grown under controlled conditions, J. Hazard. Mater, 305, p139-148.
20. Ide, A. H., S. M. Ahmad, N. R. Neng, and J. M. F. Nogueira, (2016), Enhancement for trace analysis of sulfonamide antibiotics in water matrices using bar adsorptive microextraction (BAμE), J. Pharm. Biomed. Anal, 129, p593-599.
21. Jaraczewska, K., J. Lulek, A. Covaci, S. Voorspoels, A. Kaluba-Skotarczak, K. Drews, and P. Schepens, (2006), Distribution of polychlorinated biphenyls, organochlorine pesticides and polybrominated diphenyl ethers in human umbilical cord seum, maternal serum and milk from Wielkopolska region, Polan. Sci. Total Environ, 372, p20-31.
22. Kang, B. R., M. J. Park, and H. S. Lee, (2006), Germination dependency of antioxidative activities in brown rice, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr, 35, p389-394.
23. Kang, D. H., S. Gupta, C. Rosen, V. Fritz, A. Singh, Y. Chander, H. Murray, and C. Rohwer, (2013), Antibiotic uptake by vegetable crops from manure-applied soils, J. Agric. Food Chem, 61, p9992-10001.
24. Karthikeyan, K. G., and M. T. Meyer, (2006), Occurrence of antibiotics in waste water treatment facilities in Wisconsin, USA, Sci. Total. Environ, 361, p196-207.
25. Kim, B. J., and S. W. Myung, (2010), Simultaneous analysis and occurrences of six pharmaceuticals in surface water by LC/ESI-MS/MS, Anal. Sci. Technol, 23, p572-578.
26. Kim, D. J., S. K. Oh, J. H. Lee, M. R. Yoon, I. S. Choi, D. H. Lee, and Y. G. Kim, (2012), Changes in quality properties of brown rice after germination, Korean J. Food Sci. Technol, 44, p300-305.
27. Kim, J. H., C. K. Park, M. Y. Kim, and S. G. Ahn, (2008), Contamination of veterinary antibiotics and antimicrobials in Han River Basin, J. Kor. Soc. Environ. Anal, 11, p109-118.
28. Kulshrestha, P., R. F. Giese, and D. Aga, (2004), Investigating the molecular interactions of oxytetracycline in clay and organic matter: Insights on factors affecting its mobility in soil, Environ. Sci. Technol, 38, p4097-4105.
29. Lee, J. S., and J. J. Han, (2015), Development of antioxidant and oxygen scavenging sachets to prevent the rancidity of brown rice, Korean J. Packaging Sci. Technol, 21, p41-47.
30. Lee, Y. J., (2017), Monitoring of antibiotics in agricultural soils and their uptake in raddish, MS thesis, Chonnam University, Gwangju, Korea.
31. Madaz, G., (1983), Effect of brown rice and soybean dietary fiber on the control of glucose and lipid metabolism in diabetic rats, Am. J. Clin. Nutr, 38, p388-393.
32. Malchi, T., Y. Maor, G. Tadmor, M. Shenker, and B. Chefetz, (2014), Irrigation of root vegetables with treated wastewater: evaluating uptake of pharmaceuticals and the associated human health risks, Environ. Sci. Technol, 48, p9325-9333.
33. Masiá, A., M. Ibánez, C. Blasco, J. V. Sancho, Y. Picó, and f. Hernández, (2013), Combined use of liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry and liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry in systematic screening of pesticides and other contaminants in water samples, Anal. Chim. Acta, 761, p117-127.
34. Moret, S., and L. S. Conte, (2000), Polycyclic aromatic hydrocarbons in edible fats and oils: occurrence and analytical methods, J. Chromatogra. A, 882, p245-253.
35. Muramoto, G., and S. Kawamura, (1991), Rice protein and antihypertensive peptide (angiotensin converting enzyme inhibitor) from rice, J. Japanese Soc. Food Sci. Technol, 34, p18-26.
36. Pan, M., K. C. Wong, and L. M. Chu, (2014), Distribution of antibiotics in wastewater-irrigated soils and their accumulation in vegetables crops in the Pearl River Delta, southern China, J. Agric. Food Chem, 62, p11062-11069.
37. Park, M. S., B. J. Kim, and S. W. Myung, (2010), The analysis of pharmaceuticals in drinking water by HPLC/ESI-MS/MS, Anal. Sci. Technol, 23, p457-464.
38. Prieto, A., M. Möder, R. Rodil, L. Adrian, and E. Marco-Urrea, (2011), Degradation of the antibiotics norfloxacin and ciprofloxacin by a white-rot fungus and identification of degradation products, Biores. Technol, 102, p10987-10995.
39. RDA, Rural Development Administration, (2016), Notification No. 2016-31 of RDA, 2016.6.27, Partial Amendment.
40. Sabourin, L., P. Duenk, S. Bonte-Gelok, M. Payne, D. R. Lapen, and E. Topp, (2012), Uptake of pharmaceuticals, hormones and parabens into vegetables grown in soil fertilized with municipal biosolids, Sci. Total Environ, 431, p233-236.
41. Sannino, A., (1998), Determination of phenylurea herbicide residues in vegetables by liquid chromatography after gel permeation chromatography and Florisil cartridge clean up, J. AOAC Int, 81, p1048-1053.
42. Sassman, S. A., and L. S. Lee, (2005), Sorption of three tetracyclines by several soils: Assessing the role of pH and cation exchange, Envrion. Sci. Technol, 39, p7452-7459.
43. Seo, Y. H., B. O. Cho, A. S. Kang, B. C. Jeong, and Y. S. Jung, (2010), Antibiotic uptake by plants from soil applied with antibiotic-treated animal manure, Korean J. Soil Sci. Fert, 43, p466-470.
44. Sheridan, R. S., and J. R. Meola, (1999), Analysis of pesticide residues in fruits, vegetables, and milk by gas chromatography/tandem mass spectrometry, J. AOAC Int, 82, p982-990.
45. Sirtori, C., A. Agüera, I. Carra, and J. A. S. Pérez, (2014), Identification and monitoring of thiabendazole transformation products in water during Fenton degradation by LC-QTOFMS, Anal. Bioanal. Chem, 406, p5323-5337.
46. Tsubouchi, H., H. Terada, K. Yamamoto, K. Hisada, and Y. Sakabe, (1988), Ochratoxin A found in commercial roast coffee, J. Agric. Food Chem, 36, p540-542.
47. Wu, S. S., C. Y. Chein, and Y. H. Wen, (2008), Analysis of ciprofloxacin by a simple high-performance liquid chromatography method, J. Chromatogra. Sci, 46, p490-495.
48. Wu, X., F. Ernst, J. L. Conkle, and J. Gan, (2013), Comparative uptake and translocation of pharmaceutical and personal care products (PPCPs) by common vegetables, Environ. Int, 60, p15-22.
49. Wu, X., J. L. Conkle, F. Ernst, and J. Gan, (2014), Treated wastewater irrigation: uptake of pharmaceutical and personal care products by common vegetables under field conditions, Environ. Sci. Technol, 48, p11286-11293.
50. Xu, X. L., L. Li, W. K. Zhong, and Y. J. He, (2009), Multi-residue analysis of 205 crop pesticides using mini-solid phase extraction-large volume injection-GC-MS, Chromatographia, 70, p173-183.
51. Yoo, H., K. S. Guruge, N. Yamanaka, C. Sato, O. Mikami, S. Miyazaki, N. Yamashita, and J. P. Giesy, (2009), Depuration kinetics and tissue disposition of PFOA and PFOS in white leghorn chickens (Gallus gallus) administered by subcutaneous implantation, Ecotox. Environ. Safety, 72, p26-36.
52. Zhao, S., X. Liu, D. Cheng, G. Liu, B. Liang, B. Cui, and J. Bai, (2016), Temporal-spatial variation and partitioning prediction of antibiotics in surface water and sediments from the intertidal zones of the Yellow River Delta, China, Sc. Total Environ, 569-570, p1350-1358.
 

Published by
The Korean Society of Pesticide Science

• #309 Annex, The Farmer’s Hall 436-3, Hwaseo-dong, Suwon 442-870. Korea
• Tel. 031-296-4088      • Fax. 070-8809-4087      • E-mail : kjps97@hanmail.net      • Homepage : http://www.kjps.or.kr