경상남도 농업기술원 시설재배지(ATEC greenhouse)에서 재배되고 있는 토마토 포장에서 미생물을 분리하기 위하여 2013년 11월부터 2014년 5월까지 6개월 동안 2주 간격으로 총 13회 포장에서 시료를 채집하였다. 시료의 종류로는 화기 시료와 벌집 시료를 채집하여 포장에서 50-mL falcon tube에 담은 후 냉온 보관 방법을 이용하여 실험실까지 운송하였다.

이후 1 X PBS buffer (8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄, 0.24 g KH₂PO₄를 먼저 살균수 800 ml 에 녹인 후, pH를 7.4로 조정, 최종적으로 1 L로 맞춤) 30 mL을 분주한 후 초음파세척기를 이용하여 시료의 표면에 존재하는 미생물을 PBS buffer로 분리시켰다(Joyce et al. 2003). PBS Buffer에 분리된 미생물 현탁액 1 mL을 멸균수 9 mL에 넣어 5번에서 7번으로 순차적으로 희석하였다. 희석시킨 용액을 ISP media No 2 (4 g Yeast extract, 10 g Malt extract, 4 g Glucose, 20 g Agar/1 L, pH 7.2 ± 0.2)와 TSA (Tryptic Soy Broth 30 g, Agar 20 g/1 L)에 100 μL 양을 도말 하였다. 이때 각 처리 구 당 3회 반복으로 지정하여 실행하였다. 도말이 완료된 배지는 28^oC 배양기에서 10일간 배양하였다.

10일 경과 후 배지에서 확인되는 세균의 단일 콜로니를 각각 새로운 E-Tube에 TSB 200 μL에 풀어준 다음 28^oC 진탕배양기에서 2일간 배양을 하였다. 보관 균주 제작을 위해 배양액 90 μL와 50% glycerol stock 90 μL를 96-well plate한 칸에 분주한 후 pipette으로 혼합하여 -80^oC 보관하였다(Duetz et al. 2000).

PDK 배지(Potato Dextrose Broth 10 g, Peptone 10 g, Agar 20 g/1 L) 를 이용하여 Tray plate 에 각각 20 mL 분주하여 배지를 제작한 다음 96-well plate에 배양된 균주를 Replicator를 이용하여 미생물을 배지에 접종 시켰다(Andrews et al. 1983). 2일간 28^oC에서 배양한 다음 4개의 미생물 colony 중앙 부분에 4-mm 크기의 잿빛곰팡이 병원균 agar block을 접종하여 1차 대치배양을 실행하였다. 5일간 대치배양을 진행한 다음 항균력을 지닌 균주들을 선발하여 PDK 배지에 3단 도말 후 2차 대치배양에 사용하였다. 2차 대치배양은 90-mm Petri dish에 wood stick으로 길이 3 cm로 네 방향으로 각 균주마다 도말 하여 3일간 28^oC에서 배양한 다음 중앙에 잿빛곰팡이병원균 agar block을 접종하여 10일간 대치 배양을 진행하였다. 2차 대치배양에서 효과가 나타난 균주를 이용하여 동일한 방법으로 3차 대치 배양을 진행하였다.

선발된 균주를 TSA 배지에서 삼단 도말 하여 27^oC에서 3일간 배양한 다음 단일콜로니를 50 mL TSB 배지에 접종하였다. 3일간 27^oC에서 진탕 배양한 다음 4,000 rpm으로 15분간 원심 분리를 완료한 후 상층액을 피펫을 이용하여 제거 하였다. 1.5-mL tube에 남아 있는 pellet을 1 mL의 CTAB buffer에 녹여 500 uL씩 두 개의 E-tube로 분할하였다. 각각의 E-tube에서는 Lysozyme solution (50 mg/mL)을 30 μL 첨가한 후 37^oC에서 1시간 배양하였다. 이후 Proteinase K solution (20 mg/mL)을 3 μL를 첨가하여 65^oC Hot block에서 30분간 반응 시켜 주었다. 완료된 E-tube를 상온에서 15분간 식힌 다음 500 μL의 PCI (Phenol:Chloroform: Isoamyl alcohol, 24:25:1)를 넣고 좌우로 5~7회 혼합하여 주었다. 다음 13,000 rmp으로 10분간 원심분리기를 작동 시켰다. 상층액 400 μL를 새로운 E-tube로 옮긴 후 500 μL Isoprophanol을 첨가하여 주었다. 용액이 첨가된 tube를 좌우로 7회 혼합한 다음 5분간 13,000 rpm으로 원심분리기에서 DNA를 침전시켜 주었다. 마지막으로 70% Ethanol을 500 μL 첨가하여 이전과 동일하게 원심분리기에서 반응 시켰으며 이후 E-tube 내부의 용액을 버리고 상온에서 30분~45분 가량 건조를 진행하였다. 튜브에 50 μL의 TE-buffer를 첨가하여 DNA를 녹여내고 -80^oC에서 보관 하였다(Fatima et al., 2011). 16sRNA 영역을 증폭하기 위해 27F와 1492R primer를 사용하였으며 sequence는 Solgent (Daejeon, Korea)에서 진행하였다(Lane 1991).

섬유소 분해능을 검증하기 위하여 cellulase enzyme media (yeast extract 1 g, CMC 1 g, KH₂PO₄ 4 g, MgSO₄ 1 g, MnSO₄ 0.05 g, FeSO₄ 0.05 g, CaCl₂ 2 g, NH₄Cl 2 g, Agar 18 g/1 L)를 사용하였다. 단백질 분해 능력을 검증하기 위해서는 Protease enzyme media (skim milk 10 g, agar 18 g, per 1 L)를 이용하여 효소활성 검사를 실시하였다(Carder 1986). 선발된 미생물OD₆₀₀ 0.2를 각 배지에 10 μL 접종하여 27^oC 에서5일간 배양한 후 섬유소 분해 능을 확인하기 위해 0.1% congo red 시약으로 10 mL을 분주하여 10분간 염색 한 다음 1 M NaCl 을 이용해 5번 세척하였다. 이후 4^oC 에서 12시간 보관한 다음 clean zone을 확인하여 효소 분해 능력을 검정하였다. 단백질 분해 능력은 clean zone을 형성하는 것을 통해 분해 능력을 검정하였다(Berg et al. 2005).

선발된 생물적방제 후보 균주의 발병억제도를 확인하고자 대조구로서 길항균과 Botrytis cinerea 미접종 처리구, B. cinerea 처리구, B. cinerea 와 길항균 동시 처리구로 나누어 실험을 진행하였다. 각 처리구 별로 5반복으로 진행하였으며 토마토 꽃5송이씩을 사용하였다. 후보 균주는 PDK 액체 배지에서 3일간 진탕 배양한 다음 OD₆₀₀ 0.2 농도로 희석하여 꽃 1송이당 피펫을 이용하여 100 μL씩 접종하였다. 병원균은 PDA (Potato Dextrose Broth 25 g, Agar 20 g/1 L) 배지에 agar plug 접종한 다음 10일간 배양 후 멸균수를 이용하여 포자현탁액으로 제작된 것을 사용하였다. 포자현탁액은 Hemocytometer를 이용하여 10⁶ cfu/mL농도로 확인된 포자 현탁액을 꽃 1송이당 100 μL씩 접종 하였다(Badawy and Rabea 2009). 길항균과 병원균 동시 처리구에서는 각각의 미생물을 100 μL 부피내에 단독처리구와 같은 농도로 조정하여 피펫을 이용하여 토마토 꽃에 분주하였다. 대조구에는 멸균수 200 μL를 병원균 처리구에는 멸균수 100 μL씩을 추가로 분주하였다. 습식 처리 상태로 상온에서 10일간 발병률을 조사 하였다. 발병률(Disease Incidence, %)은 잿빛곰팡이병의 병징 혹은 표징이 나타난 것을 1로 하여 발병률(%)을 조사하였다.

경상남도 농업기술원 ATEC센터 토마토 시설재배지에서 2013년 11월 11일부터 14일을 간격으로 2014년 5월 13일까지 토마토 화기 시료와 벌집 시료를 채집하였다. 총 13차에 걸쳐서 각각의 시료를 채집하였으며 화기 시료에서 분리된 미생물 1,004개 colony를 확보하였으며 벌집 시료에서는 925개의 미생물 colony를 확보하였다. 이후 분리된 1,929개의 미생물 colony 와 B. cinerea (KACC40574) 대치 배양을 통하여 항균력을 지닌 균주를 선발하였다. 1차 선발(Dirty and quick screen)에서는 토마토 화기 시료(TF1~TF13)로부터 258개, 벌집시료에서(TH1~TH13) 237개를 선발하였다. 2차와 3차 선발을 통하여 화기 시료에서 38개 미생물을, 벌집 시료에서는 21개를 선발하였다(Table 1). 그 중 화기 시료에서 분리된 미생물 중 항균활성능력이 가장 높게 나타낸 TF2A1, TF2E12, TF2H2, 균주의 3개의 미생물 colony를 최종적으로 선발 하였다. 벌집 시료에서는 TH1F1, TH13B1, TH13E12 균주가 잿빛곰팡이 병원균에 대하여 우수한 항진균력을 가지는 균주로 선발되었다(Table 1 and Fig. 1).

Fig. 1. 
Antagonism test against Botrytis cinerea. A: Bacteria was isolated from tomato flower samples (TF), B: Bacteria was isolated from tomato pollinator hive (TH). Antagonism test was conducted in PDK media with B. cinerea for 7 days at 28^oC.

토마토 화기 시료에서 선발된 TF2A1, TF2E12, TF2H2, TF2H12 4개의 colony와 벌집에서 선발된 TH1F1, TH13B1, TH13E12 3개를 이용하여 cellulase enzyme과 Protease enzyme 활성 실험을 진행하였다. 그 결과 토마토 꽃과 화분에서 분리된 미생물들은 항균력에 상관없이 두개의 enzyme에 대하여 우수한 활성을 나타내었다(Fig. 2).

Fig. 2. 
Enzyme activity test with the selected isolates. A: Cellulase enzyme test with congo red colorization, B: Protease activity test.

잿빛곰팡이 병원균에 대한 항진균력이 높게 확인된 선발된 6개의 미생물과 항균활성이 없는 TF2H12균주를 16sRNA sequence를 이용하여 동정한 결과 모두 Paenibacillus polymyxa로 확인되었다(Table 2). 그 중 항균력에서 가장 뛰어난 효과를 보였던 TF2H2균주를 이용하여 토마토 화기에서 잿빛곰팡이 방제 실험을 진행한 결과 잿빛곰팡이를 처리한 처리구는 모든 화기에서 100% 발병이 관찰된 반면 P. polymyxa TF2H2와 Botrytis cinerea 포자 현탁액을 같이 처리한 처리구에서 발병율이 25% 로 나타났다(Fig. 3). 동시에 멸균수만을 처리하였던 무처리구에서는 P. polymyxa TF2H2와 잿빛곰팡이 포자현탁액을 같이 처리한 처리구와 유사한 발병도를 확인 할 수 있었다.

Fig. 3. 
Gray mold disease control effectiveness of the selected isolate P. polymyxa TH2H2 in tomato. Error bars represented the standard deviation of replicates.