Editorial Board

농산물은 국외로 수출되는 농산물 중 수출 물량이 많은 농산물인 사과, 토마토, 딸기, 배 및 파프리카를 대상으로 하였으며(Table 1), 시중에서 판매하는 친환경 농산물을 구입하여 실험에 활용하였다. 각 농산물은 씨, 꼭지 및 심을 제거한 후 2 cm 정도로 균일하게 절단하여 드라이아이스와 함께 mix homogenizer (Artlon Gold Mix DA338-G, Korea)로 고속 마쇄한 후 분석 전처리 전까지 -20^oC의 냉동 고에 보관하여 사용하였다.

분석대상 농약은 신규 등록농약 중 다성분 동시분석이 가능한 살균제 18종, 살충제 10종, 제초제 7종 및 살선충제 1 종으로 Table 2의 총 36종을 선정하여 분석법을 확립하였다. 분석에 사용한 표준품은 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 및 Wako (Osaka, Japan)에서 구입하였으며, 내부표준물질로 사용된 atrazine (순도 97.3%) 분석용 표준품은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 용매인 methanol 및 acetonitrile은 Merck (Darmstadt, Germany)의 HPLC grade로 구입하였으며, 3차 증류수는 Millipore사의 Milli-Q system (Bedford, USA)을 이용하여 제조한 후 사용하였다. 분석에 사용된 시약인 fomic acid (>98% purity)와 ammonium acetate (99% purity)는 Sigma Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. QuEChERS 전처리를 위한 제품은 Agilent (San Francisco, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료 추출을 위한 제품은 Agilent QuEChERS EN 15662 Extract Kit (4 g MgSO₄, 1 g NaCl, 1 g NaCitrate, 0.5 g disodium citrate sesquihydrate)를 사용하였으며, 정제를 위한 제품은 Agilent QuEChERS dispersive SPE 2 mL (150 mg MgSO₄, 25 mg primary secondary amine (PSA)) 및 Agilent QuEChERS dispersive SPE 2 mL drug residues in meat (150 mg MgSO₄, 25 mg C₁₈)을 사용하였다.

실험에 사용한 각각의 농약은 acetonitrile 및 methanol을 이용하여 stock solution 1,000 mg/L을 조제하였다. 각 농약의 stock solution을 혼합하여 acetonitrile로 희석하여 1, 5 및 50 mg/L로 조제하여 회수율 실험에 사용하였으며, matrix matched standard 조제 시 PSA 및 C₁₈ 정제법의 경우 25, 50, 100, 250 및 500 μg/L의 농약 첨가용 혼합표준용 액을 조제하였으며, 10배 희석법의 경우 5, 10, 25, 50, 100, 250 및 500 μg/L의 농약 첨가용 혼합표준용액을 조제하였다. 내부표준물질(internal standard, ISTD)은 atrazine을 acetonitrile로 혼합하여 20 mg/L로 조제하여 전처리 시료에 첨가하였으며, 2 mg/L로 조제하여 혼합표준용액 조제 시 첨가하였다.

50 mL Falcon® tube에 10 g씩 칭량한 농산물 시료에 각농약 표준용액을 100 µL 처리하였으며, 전처리 중 실험오차를 줄이기 위하여 내부표준물질 100 µL을 함께 처리하여 준비하였다. 준비된 시료에 acetonitrile 용액을 10 mL 첨가하고 진탕기(SPEX Sample Prep, 1600 MiniG, USA)를 사용하여 1,300 rpm에서 15분간 진탕하여 추출하였으며, 층분리를 위해 4 g MgSO₄, 1 g NaCl, 1 g NaCitrate, 0.5 g disodium citrate sesquihydrate를 혼합한 후 진탕기를 사용하여 1,300 rpm에서 1분간 균질화하고 원심분리기(HANIL, Combi-514R, Korea)를 이용하여 3,500 rpm에서 5분간 원심 분리하였다.

『농산물 등의 유해물질 분석법』에서는 LC-MS/MS를 이용한 시료의 경우 d-SPE 정제과정없이 10배 희석하는 방법을 택하고 있으나 향후 복잡한 매트릭스를 함유한 다양한 시료의 분석에 대비하여 본 실험에서는 QuEChERS 공인 분석법인 acetate buffer를 이용한 AOAC법(AOAC Official Method 2007. 01)과 citrate buffer를 이용한 CEN법(CEN Standard Method EN 15662)에서 택하고 있는 PSA 흡착제와 AOAC 공인 분석법 등재후 acetate buffer 이용법에서 추가하여 사용하는 C₁₈ (Lehotay et al. 2010)을 시험하였다. 원심분리된 상징액 1 mL씩 취하여 3가지 방법(정제없이 10배 희석, PSA 정제(150 mg MgSO₄, 25 mg PSA), C₁₈ 정제 (150 mg MgSO₄, 25 mg C₁₈))으로 각각 정제한 후 원심분리 (10,000 rpm, 5 min)하였다.

이후 10배 희석의 경우 분석용 시료 상징액 100 µL를 취하여 water 300 µL, acetonitrile 500 µL 및 0.5% formic acid in acetonitrile 100 µL를 함께 혼합하였으며, PSA 흡착 제와 C₁₈ 흡착제 처리의 경우 분석용 시료 상징액 500 µL를 취하여 water 300 µL, acetonitrile 150 µL 및 1% formic acid in acetonitrile 50 µL를 함께 혼합 후 기기분석조건에 따라 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다.

분석에 사용한 LC는 AB SCIEX Exion LC™ AC이며, tandem mass spectrometer는 AB SCIEX TRIPLE QUAD™ 5500를 사용하였다. 이동상은 0.1% formic acid와 5 mM ammonium formate를 포함한 buffer용액과 acetonitrile을 사용하여 Halo C₁₈ (2.7 µm, 2.1 mm × 150 mm I.D., advanced materials technology, USA) column으로 분석용 시료 1 µL를 주입하여 분석하였다. MS/MS 분석의 ionization mode는 Electrospray Ionization positive mode를 이용하였으며 Scan type은 MRM mode를 이용하여 분석하였다. 데이터 처리는 MultiQuant™ software 프로그램을 사용하였으며, 기기분석조건은 Table 3와 같고, 36종 농약 성분의 분석 값은 Table 4에 나타내었다.

잔류 농약 분석 시 matrix effect (suppression 혹은 enhancement)의 원인은 서로 다른 반응과 현상에 의해 결정 되는데, 수많은 시료와 농약성분의 반응을 명확히 규명하는 것은 매우 어렵기 때문에 본 연구의 matrix effect 검증은 변 동 폭에 따른 간섭 정도에 초점을 두어 표준농약성분의 chromatogram상 피크 면적의 수치를 기준으로 측정하였다. 5종의 무처리 농산물 시료 추출용액을 이용하여 검량선 작성시 만든 matrix matched standard와 용매로 조제한 solvent standard를 비교하여 matrix effect를 조사하였다. Matrix effect의 산출은 solvent standard의 피크 면적과 matrix matched standard의 피크 면적의 비로 판단하며, 다음과 같은 식으로 산출하여 백분율로 나타내었다.

분석법의 검증을 위하여 정제없이 10배 희석하는 경우 0.01, 0.05, 0.5 mg/kg의 농도 수준의 농약을 3반복으로 첨가하여 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)을 산출하였다. PSA흡착제와 C ₁₈ 흡착제 정제 처리의 경우 0.05와 0.5 mg/kg의 농도 수준에서 3반복으로 시험하였다.

수출농산물 5종에 대한 36종 신규 등록농약의 3가지 정제법에 대하여 matrix matched standard와 solvent standard를 비교하여 matrix effect를 산출하였으며 Fig. 1에 나타내었다. Matrix effect 판단 시 ±20%의 수준은 영향이 거의 없는 수준이고, ±20~50%의 수준은 약간의 영향을 받는 수준이며, 그 이상은 matrix에 강한 영향을 받는 수준으로 평가한다(Ferrer et al., 2011; Domínguez et al., 2014; Gwon et al., 2014).

Fig. 1. 
The number of pesticides with the range of matrix effects of 10 dilution without d-SPE, PSA cleanup and C18 cleanup at d-SPE.

해당 기준으로 본 실험의 결과를 확인한 결과, 정제없이 10배 희석을 수행하였을 경우 총 180가지 경우 중 179가지 경우가 -8.33 ~ +14.77% 이내, 평균 +2.62로 matrix의 영향이 거의 없는 수준으로 나왔으며, 파프리카 중 fluopyram에서 +21%로 약간의 enhancement 영향을 받은 수준으로 나타나 매우 양호한 matrix effect 값을 보였다.

PSA정제법을 수행하였을 경우 총 180가지 경우 중 178 가지 경우가 -18.98 ~ +12.54% 이내, 평균 +0.80로 matrix의 영향이 거의 없는 수준으로 나왔으며, 파프리카 중 pyribencarb 및 pyribencarb KIE-9749의 2가지 경우 에서만 각각 -21% 및 -22%로 약간의 suppression 영향을 받은 수준으로 나타나 PSA 흡착제가 정제없이 10배 희석한 것과 비슷한 정제 효과를 나타낸 것으로 보였다.

마지막으로 C₁₈정제법을 수행하였을 경우 총 180가지 경우 중 167가지 경우가 -19.75 ~ +18.80% 이내, 평균 +3.85로 matrix의 영향이 거의 없는 수준이었으며, 사과 중 pyribencarb, pyribencarb KIE-9749 및 valifenalate에서 각각 -24%, -24% 및 28%, 배 중 pyribencarb KIE-9749에서 -22%, 토마토 중 pyribencarb 및 pyribencarb KIE-9749에서 각각 -27% 및 -28%, 파프리카 중 cyantraniliprole, fluopyram, imicyafos, pyraclonil, pyribencarb, pyribencarb KIE-9749 및 pyrimisulfan에서 각각 44%, 28%, 22%, 24%, -36%, -38% 및 33%로 총 13가지 경우에서 각각 suppression 혹은 enhancement 영향을 받은 수준으로 나타나 10배 희석법, PSA정제에 비해 다소 크게 나타났다.

5가지 수출 농산물을 대상으로 36종의 신규 등록농약에 대한 분석법 검증을 위하여 QuEChERS EN 15662법으로 추출 후 정제없이 10배 희석, PSA 정제, C₁₈ 정제하여 LCMS/MS로 분석하였으며, 각 성분별 피크를 Fig. 2에 나타내었다. 분석결과에 따라 산출된 LOQ는 0.01 mg/kg이였으며, 모든 R² 값은 0.995 이상을 만족하여 분석 결과의 유효성을 입증하였다. 내부표준물질인 atrazine의 피크면적과 각 농약 성분의 피크면적을 나눈 면적비를 이용하여 회수율을 산출한 결과를 10배 희석법, PSA 및 C₁₈ 정제법 각각 Table 5, 6 및 7에 나타내었다. 10배 희석법의 경우 사과 78.1~120.8%, 파프리카 88.8~112.2%, 배 82.6~113.2%, 딸기 81.3~111.2%, 토마토 89.3~106.6%의 회수율을 보였으며, RSD는 6.6~13.2%였다. C₁₈ 정제법의 경우 사과 81.8~114.1%, 파프리카 85.6~124.1%, 배 89.3~117.6%, 딸기 95.7~109.4%, 토마토 94.6~107.1%의 회수율을 보였으며, RSD는 4.7~12.5%였다. 10배 희석법과 C₁₈ 정제법의 경우 모든 경우에서 EU 가이 드라인(SANTE/11813/2017)의 잔류분석법 기준인 회수율 70~120% 및 RSD ≤ 20% 범위를 만족하였다. 그러나 PSA 정제법의 경우 pyrifluquinazon, pyrimisulfan 및 isofetamid GPTC를 제외하고 사과 89.1~103.7%, 파프리카 73.1~117.5%, 배 74.3~105.6%, 딸기 72.4~106.6%, 토마토 72.3~121.1%의 회수율을 보였으며, RSD는 5.6~17.4%였다. Pyrifluquinazon의 경우 사과에서 66% 및 58%의 회수율을 보였으며, pyrimisulfan의 경우 사과 및 배에서 각각 61%, 65% 및 62%, 62%의 회수율을 보였다. 특히 isofetamid의 대사산물인 GPTC의 경우 5종의 수출 농산물 모두 55~68% 의 회수율을 보였는데 이는 GPTC가 carboxylic acid를 갖고 있는 구조로서 PSA 정제법의 흡착정제과정에서 PSA에 흡착되어 회수율이 저조하게 나타난 것으로 판단된다(Koesukwiwat, 2010). QuEChERS 전처리법을 이용할 때 회수율이 저조한 농약들은 전처리과정이나 기기분석과정에서 농약이 분해되거나 분배시 acetonitrile층으로 농약이 충분히 넘어오지 않거나 d-SPE 정제과정에서 흡착제에 흡착이 되는 경우로 생각될 수 있다(Kwon et al., 2011). 본 연구에서 위의 3성분이 10배 희석 처리와 C₁₈ 정제 처리에서 회수율이 양호했던 것을 고려해볼 때 PSA 정제과정에서 흡착 되었거나 PSA 처리에 따른 pH상승에 의한 분해가 원인이 되었을 수 있으나 추후 원인 규명이 더 필요하다.

Fig. 2. 
Chromatogram of 36 pesticides standard analyzed by LC-MS/MS (10 µg/kg).