Editorial Board

본 연구에 사용된 propineb (순도 68.5%)의 분석용 표준품은 ㈜바이엘에서 분양받아 사용하였다. 추출에 사용된 ethylenediaminetetraacetic acid-disodium (EDTA-2Na)은 Dae Jung 사(Korea)로부터 구입하여 사용하였다. NaOH는 일본의 Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd. (Japan)로부터 구입하여 사용하였고, L-cysteine, 1,2-propanediol은 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)로부터 구입하여 사용하였다. Methyl iodide는 Kanto Chemical Co., Inc. (Japan)으로부터 구입하여 사용하였으며, tetrabutylammonium hydrogen sulfate (TBAH)는 Sigma Aldrich 사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. Sodium sulfate anhydrous, sodium chloride anhydrous는 Dae Jung 사(Korea)로부터 구입하여 사용하였으며 amyl alcohol은 Junsei Chemical Co., Ltd. (Japan)에서 GR급을 구입하여 사용하였다. n-Hexane, methanol, dichloromethane, chloroform, hydrochloric acid, water는 Merck 사(Germany)에서 GR급을 구입하여 사용하였다. 전처리 시 농산물 시료를 진탕하기 위한 진탕기(Lab. Companion IS-971R, Jeio Tech, Korea 및 BV1010, Benchmark Scientific, USA)를 사용하였으며, 감압유거를 위해 농축기(Eyela NE-1001, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)를 사용하였고, 원심분리를 위하여 원심분리기(Allegra X-15R, Beckman Culter Life Sciences, USA)를 사용하였다. 본 연구에 사용한 propineb의 화학구조식은 Fig. 1과 같다(Turner, 2015).

Fig. 1. 
Chemical structure of propineb.

Propineb의 분석법 개선을 위한 분석 대상 농산물은 단백질 함량(약 19%)이 높은 팥(Vigna angularis Willd., red bean)으로 선정하였다(RDA, 2016). 팥의 무농약 재배 시료는 시중 대형마트에서 판매하는 유기농산물을 구매하여 잔류농약분석용 식품 전처리 방법에 따라 처리 후 분석하였다. 분석 시료는 -20^oC 이하에서 냉동보관하여 분석 시 일정량을 취하여 사용하였다.

Propineb 표준용액은 propineb 일정량을 L-cysteine 0.5 g와 0.25 M ethylenediaminetetraacetic acid-disodium (EDTA-2Na) 수용액(0.45 M NaOH 함유, pH 9.5~9.6)에 녹여 100 mg L⁻¹이 되도록 하여 stock solution을 조제하였다. 이를 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 mg L⁻¹의 농도가 되도록 희석한 후, 유도체화 한 후 20 μL씩 HPLC/UVD에 주입하여 peak의 면적을 기준으로 표준검량선을 작성하였다.

Propineb 분석은 자외선 흡수 분광검출기가 장착된 HPLC system (Dionex ultimate 3000, USA)을 이용하였으며, column은 Shiseido C₁₈ (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5.0 μm, Japan)을 사용하였다(Table 1). 확립된 기기분석 조건에서 propineb의 retention time은 12.4 min.이었다.

HPLC/UVD 분석을 통하여 시료 중 검출된 propineb 잔류분의 정성적 신뢰성 확인을 위하여 LC-MS/MS를 이용하였으며, 분석 조건은 Table 2와 같다.

팥 시료로부터 propineb를 추출하기 위하여 시료 5 g에 증류수 20 mL를 가하여 20분간 정치, 습윤화하였다. 이후 0.25 M ethylenediaminetetraacetic acid-disodium (EDTA-2Na) 수용액(0.45 M NaOH 함유, pH 9.5~9.6) 80 mL에 L-cysteine 0.5 g 및 sodium chloride를 넣고 2,500 rpm으로 10분간 진탕·추출하였다. 추출액에 chloroform 50 mL, amyl alcohol 10 mL를 첨가하여 2,500 rpm으로 10분간 shaking한 후 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 제단백(deproteinization)을 3회 진행하였다. 이후 상등액 10 mL를 취하여 0.41 M tetrabutylammonium hydrogen sulfate 수용액 1 mL를 첨가하였으며, 1 N HCl을 첨가하여 pH 7.5로 신속 조절한 후 유도체화 시료로 사용하였다. 용액이 담겨 있는 분액 여두에 sodium chloride 3 g을 넣고 0.05 M methyl iodide가 함유된 n-hexane:dichloromethane (1:4, v/v) 용액 30 mL로 실온에서 10분간 3회 methylation한 후, sodium sulfate anhydrous층을 통과 탈수시키고 약 10분간 실온에서 방치하였다. 여기에 20% 1,2-propanediol을 함유한 dichloromethane 1 mL를 넣고 rotary vacuum evaporator를 이용하여 30^oC 이하의 수욕 상에서 감압농축하였으며 methanol 2 mL로 재용해한 후, HPLC/UVD로 분석하였다.

Propinbe의 분석법 개선을 위해 팥을 이용하여 시험을 수행하였다. 기술한 분석과정 중 제단백을 0회(대조구), 1회, 2회, 3회, 4회 수행한 후, 평균값과 상대표준편차를 구하여 최적의 처리횟수를 확인하였다.

잔류분석법의 적합성을 판단하기 위하여 팥에 대한 회수율 시험을 수행하였다. 팥 시료 중 propineb의 최종농도는 0.4 및 2.0 mg L⁻¹ 수준이 되도록 처리하였으며, 2수준 3반복으로 처리하여 앞서 기술한 분석과정을 수행한 후 평균값과 상대표준편차를 구하였다.

본 연구의 분석 대상 성분인 propineb의 물리화학적 특성은 Table 3과 같다(Turner, 2015). Propineb의 n-octanol/water 분배계수는 -0.26으로 비극성 유기용매에 난용성인 화합물이다. Propineb는 분자 구조 내 -NH기를 가지고 있어 GLC 분석이 적합하지 않음을 확인하였다(Kim et al., 2013). 비유도체화 propineb (non-methylated propineb)의 경우 methylation하기 전 용해되는 과정에서, Na⁺과 함께 이온화하기 때문에 column 손상 및 강한 흡착력 등이 우려되어 분석에 적합하지 않다고 판단하였다. 또한 분자 내 황, 질소 원자의 비공유 전자쌍이 전자전이에 의해 특정 파장대를 흡수하는 특성 상 UV에서 강한 흡광성을 나타낼 것으로 판단되어 HPLC를 통한 기기분석을 시도하였다. 유도체화 propineb (methylated propineb)의 경우 272 nm에서 가장 높은 흡광력을 보였으며, 시료 중 방해물질과의 간섭이 최소화 될 것으로 예상되어 측정파장으로 선정하였다(Fig. 2). 보편적으로 중성의 화합물 분리에 많이 사용되는 역상(reversed phase) column (C₁₈)을 사용하여 분석하였으며, 재현성과 분석 시간 측면에서 유리 할 것으로 판단되는 isocratic 조건을 우선 시도하였으나, 분석 시료 중 불순물의 간섭을 최소화하기 위하여 분리가 충분히 이루어질 수 있는 gradient 조건을 propineb의 분석 조건으로 최종 선정하였다(Ahn et al., 2018)

Fig. 2. 
UV absorption spectrum of methylated propineb (maximum absorption 272 nm).

Propineb의 표준용액(0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 mg L⁻¹)을 20 μL씩 기기에 주입하여 얻은 검량선의 회귀방정식은 y = 0.037617187x − 0.005350334 (R²=0.999)로 R² 값은 0.999 이상으로 직선성이 매우 우수하였다(Fig. 3).

Fig. 3. 
Calibration curve of methylated propineb.

대부분의 농산물은 수분을 함유하고 있어, 비극성 유기용매보다는 acetone, acetonitrile 및 methanol 등의 극성 유기용매를 사용하여 추출효율을 얻는다(Lee, 2012). 그러나 본 연구의 분석성분인 propineb는 금속이온을 함유하고 있으므로 대부분의 유기용매 및 물에 난용성인 화합물이다. 따라서 본 연구에서는 대상 농산물로부터 propineb를 추출하기 위한 용매로 0.25M ethylenediaminetetraacetic acid-disodium (EDTA-2Na) 수용액(0.45 M NaOH 함유, pH 9.5~9.6)을 사용하였다. Ethylenediaminetetracetic acid (EDTA)는 금속이온의 제거를 위해 대표적으로 사용하고 있는 chelating agent로 본 연구에 적합한 추출용매로 판단하였다(Kwon et al., 2004; Hwang et al., 2011). Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 수용액 중에 용해되면 가장자리에 있는 수소이온들이 용해되어 -4가 이온으로 활동하게 되며, 동시에 여섯 자리 리간드로 작용할 수 있다(Fig. 4)(Kim et al., 2011). 이는 금속이온에 대하여 강한 친화력을 가져 chelate 화합물을 형성하고(Hyeon and Lee, 1995), 이 같은 성질은 유기용매 및 물에 난용성인 propineb가 수용액이 되는 것을 가능하게 해준다. 이 때, 용액의 pH는 9~10 정도로 유지시켜 주는 것이 바람직한 것으로 보고되어 있다(Park et al., 1979; Kim et al., 2010). 본 연구에서는 pH 조절을 위해 0.45 M NaOH를 사용하여 용액의 pH가 9~10이 유지되도록 하였다. 단백질을 함유하고 있는 농산물 시료의 경우 수용액 상의 단백질 존재로 methylation 방해현상을 야기하는 것으로 판단되어 유도체화를 진행하기 전 제단백(deproteinization)을 적용하여 분석법의 개선을 시도하였다.

Fig. 4. 
Chemical structure of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).

제단백(deproteinization) 방법은 수용액 내의 단백질을 제거하는 과정으로, 본 연구에서는 단백질이 과량 포함된 수용액에 chloroform을 첨가해 단백질 분자를 변성시키고 침전시키는 chloroform법이 가장 간단하고 효율적인 방법으로 판단하여 시도하였다. 본 연구에서의 제단백 과정은 추출용액에 chloroform 50 mL, amyl alcohol 10 mL를 각각 단계적으로 첨가하여 3회 연속 반복을 수행하였을 때, 유도체화를 통한 회수율을 산출함으로써 최종적으로 가장 적합함을 확인하였다. 이 후 최적화된 methylation 과정을 확립하기 위하여 추출액 10 mL, 20 mL, 50 mL를 취하여 유도체 과정을 상대적으로 비교한 결과, 10 mL를 사용하였을 때 가장 적합한 것으로 판단하였다. 상등액 10 mL를 취한 후 상이동촉매인 0.41 M tetrabutylammonium hydrogen sulfate (TBAH) 수용액 1 mL를 첨가하였다. 상이동촉매인 tetrabutylammonium hydrogen sulfate (TBAH)의 Bu₄N⁺ 이온이 propineb가 유기용매 층으로 이동하게 해 주는 역할을 한다(Abdol R. et al., 2008; Lee and Han, 2009). 이 후, 원활한 methylation이 가능하도록 하기 위하여 1 N HCl 수용액을 사용하여 추출액의 pH를 중성인 상태로 유지시켰다.

Propineb는 잔류분석을 위하여 유도체화 과정이 필요한 dithiocarbamate계 농약으로 메틸화 시약은 0.05 M methyl iodide가 사용되고 있다. 본 연구에서는 0.05 M methyl iodide가 함유된 n-hexane:dichloromethane (1:1, v/v)으로 유도체화를 수행하였다. 이 때, 사용된 용매는 비중이 물보다 낮아 분액여두의 상층에 있게 되고, 하층은 ethylenediaminetetraacetic acid-disodium (EDTA-2Na) 수용액이 존재한다. 반복적으로 유도체화를 진행할 때, 상층의 유기용매층을 농축플라스크에 받는 과정에서 시간 효율의 고려하여 n-hexane:dichloromethane (1:4, v/v)을 사용하여 유기용매층을 하층으로 분배시켰다. 유기용매 층으로 이동된 propineb는 CH₃I와 반응하여 methylation이 진행된다. 결론적으로 본 연구에서 사용된 n-hexane:dichloromethane (1:4, v/v)가 적합하다고 판단하였으며 30 mL로 3회 methylation하였을 때 최적의 회수율을 확인할 수 있었다. 이후 methylation된 propineb의 농축 시에 생성물이 휘발되는 것을 방지하기 위하여 20% 1,2-propanediol을 함유한 dichloromethane 용액을 첨가해 생성물이 alcohol과 수소결합을 생성하도록 유도하였다.

대표적인 고단백 식품인 두류 중 하나인 팥은 단백질 함량이 약 19%인 것으로 알려져 있다(RDA, 2016). Kim (2007) 등은 단백질이 수용액상에서 콜로이드 형태로 부유한다고 보고하였으며(Kim and Ahn, 2007), 부유하는 과량의 단백질은 팥에 대한 propineb의 잔류분석을 수행할 시 메틸화 시약과 반응하여 propineb의 methylation을 저해한다고 판단되었다. Cho (2002)는 단백질이 수용액 상에서 정전기적 인력, 척력, 수소결합 및 S-S bond 등의 영향을 받는다고 보고하였으며, -SH기 두 개가 산화되어 생기는 결합인 S-S bond는 특히 메틸화 시약인 CH₃I과 반응할 때 친핵체로 작용하여 propineb의 정상적인 methylation 반응을 방해하는 것으로 판단된다(Yong and Sohn, 1993; Cho et al., 2002; Kim and Kim, 2016). 따라서 단백질 함량이 높은 팥 시료 중 propineb를 분석하기 위하여 유도체화 이전에 제단백 과정이 필수적으로 요구된다.

제단백은 식품 등에 포함되어 있는 저분자물질을 분석하기 위하여 방해물질인 고분자물질을 제거하는 조작으로 화학적방법과 물리적방법이 있다. Chloroform-gel method는 화학적 제단백의 일종으로 1934년 M.G. Sevag가 고안하였으며, 단백질을 포함하는 수용액에 chloroform을 가해 단백질 분자를 변성시키는 방법이다(Sevag et al., 1938). 이 때 amyl alcohol을 함께 가해 주는데, amyl alcohol은 소포제로서 특히 제단백 과정에서 파포작용을 하는 것으로 알려져 있다(Sevag et al., 1938). 본 연구에서는 제단백을 위하여 추출액에 chloroform 50 mL, amyl alcohol 10 mL를 첨가하여 shaking한 후 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 시료 추출액 중의 단백질을 제거하고자 하였다. 가장 아래층에는 투명한 chloroform 층, 중간층은 단백질을 포함하는 백색 겔층, 가장 위는 수용액으로 나뉘게 된다(Fig. 5).

Fig. 5. 
Separatory layers after deproteinization process for red bean sample.

이 때 피펫으로 수용액 층만 취한 뒤 앞서 기술한 방법을 0회, 1회, 2회, 3회, 4회 반복하고 유도체화한 뒤 회수율을 산출한 결과 Table 4와 같았다. 제단백을 진행하지 않고 유도체화 하였을 때(0회), 회수율은 약 40%를 상회하는 수준이었으나 제단백을 1회 수행할 시 약 72%의 회수율을 보였으며, 제단백을 3회 수행할 시 평균 90% 이상의 회수율 나타내었고, 제단백을 4회 수행할 시 평균 98%의 높은 회수율이 산출되었다(Fig. 6). 제단백 과정을 1회만 수행하였을 경우에 회수율 상승효과는 약 28%로 확인하였으며, 이후 매 횟수가 증가할 때 마다 약 9%, 9%, 7%의 회수율이 상승하는 결과를 나타내었다. 최종적으로 제단백 과정을 4회 수행하였을 때 회수율은 평균 98%로 산출되어 0회(대조구) 대비 약 55%가 증가하였다. 이는 제단백 단계를 거듭할 때마다 단백질 제거가 효과적으로 이루어져 원활한 methylation이 가능해 지는 것으로 판단하였다. 또한 본 연구에서 수행한 제단백 횟수 실험에서 4회의 회수율 상승률이 3회 대비 약 7%로 산출된 것으로 보아 제단백 횟수는 3회 수행하였을 때 가장 효율적으로 이루어진다고 판단하였다. 따라서 본 연구에서는 제단백 횟수 별 회수율 데이터, 분석시간과 효율 등을 고려하여 보았을 때 평균 90%의 양호한 회수율이 산출되었으며, 4회와 비교하였을 때 상대적으로 짧은 분석시간, 적은 용매 사용량 등의 이유로 제단백 횟수는 3회가 적절하다고 판단하였다.

Fig. 6. 
Chromatograms of control, standard (2.0 mg L⁻¹) and recovery (0.4 mg L⁻¹ and 2.0 mg L⁻¹) samples of propineb in red bean.

분석기기의 검출한계(limit of detection, LOD)는 분석물질을 검출 할 수 있는 가장 낮은 농도로 정량한 값의 정확성을 보장할 수는 없으나 시료 중 분석물질의 존재 가능성을 측정 할 수 있는 최소한의 농도를 뜻한다. 또한 크로마토그램 상에서 S/N (signal/noise)비가 3~5배인 값을 의미한다. 다양한 농도의 표준 용액을 분석하여 S/N비를 구한 결과, propineb의 검출한계는 0.2 ng이었다.

정량한계(limit of quantitation, LOQ)는 시료 중 분석물질을 정량할 수 있는 가장 낮은 농도로 무처리 시료에 표준품을 처리하여 분석한 크로마토그램 상 S/N비가 6~10배 이상인 값으로 하며, 정량한계수준에서 회수율 및 회수율 평균값의 상대표준편차(RSD)가 기준을 만족할 수 있어야 한다. 식품의약품안전처에서는 0.01 mg L⁻¹ ~ 0.05 mg L⁻¹의 수준으로 정량한계를 설정하도록 추천하고 있다(MFDS, 2017). 식 (1)에 의하여 산출한 propineb의 정량한계는 0.04 mg L⁻¹(식 (2)) 수준으로써 잔류분석법 기준에 적합하였다.

A: 최소 검출량 B: 시료의 부피 C: 시료의 양 G: 기기 주입량 D: 최종 부피 E: 시료의 부피 F: 희석 배수

다만 향후 국내에서 Positive List System (PLS) 제도가 본격적으로 시행된다면 분석법의 정량한계는 0.01 mg L⁻¹로 개선이 필요한 바 있으며, LC-MS/MS 등을 활용한 기기분석법 정립이 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서 개선된 분석과정의 검증을 위하여 propineb의 회수율 시험을 수행한 결과 Fig. 6과 같았으며, propineb의 분석 대상 무처리 시료의 크로마토그램에서 간섭물질은 관찰되지 않았다. Propineb의 단백질을 함유한 농산물 팥 무처리 시료에 propineb를 정량한계 수준의 10배와 50배 수준으로 3반복으로 처리한 후 확립한 분석과정을 수행한 결과 Table 5와 같았으며, 처리수준에 관계없이 분석오차는 10% 미만이었다(Table 5). 이는 상기 분석법이 propineb의 국내외 농산물의 잔류농약분석 및 안전성 검사에 실용적으로 적용 가능하다고 판단하였다.

본 연구에서 개선된 propineb 잔류분석법의 정성적 재확인을 위하여 triple quadrupole 방식의 LC-MS/MS를 이용한 재확인용 기기분석법을 확립하였다. Propineb의 경우는 ESI Ion source와 negative ion mode에서 검출할 수 있었다. Propineb의 precursor ion은 [M-H]+ ion, m/z = 254.400, product ion은 m/z = 61.060, 206.710으로 선정하였다. Selective reaction monitoring (SRM)을 통해 팥 시료 중 propineb peak가 관찰되지 않았으며, 인위적으로 표준물질이 첨가된 시료에서는 정확하게 propineb의 잔류분만을 확인할 수 있었다(Fig. 7). 따라서 본 연구의 대상약제인 propineb의 경우 LC-MS/MS SRM 조건을 이용하였을 때, HPLC/UVD를 이용한 정량법과 더불어 propineb의 잔류분의 추가적 분석법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 7. 
SRM chromatograms of control and recovery (2.0 mg L⁻¹) samples of propineb in red bean.

본 연구를 통하여 단백질 함량이 높은 팥 시료 중 propineb의 잔류분석을 위하여 제단백 과정을 적용하는 방법이 적절함을 최초로 확인하였다. 향후 본 연구에서 시도한 방법이 보편적인 두류시료에 적용이 가능한지를 확인, 다양한 물리화학적 제단백 방법 적용을 통하여 최적화된 제단백 방법을 선정, 난분석 성분으로 알려진 dithiocarbamate계 살균제의 잔류분석에 확대 적용 가능성을 확인하는 등의 추가적인 연구가 필요하다.