Editorial Board

본 연구는 Kim et al. (2017)의 연구 수행과 동시에 진행하였던 연구로 선충 분리와 씨스트선충의 알 분리는 Kim et al. (2016) 방법으로 수행되었다. 선충의 분리지역은 강원도 정선군 임계면(N 37°26’23.20”, E128°51’23.80”)과 태백시 삼수동(N 37°25’58.26”, E128°98’30.96”)의 씨스트선충 감염 배추포장에서 뿌리주변 토양을 채취한 뒤 토양에서 씨스트를 분리하여 이용하였는데 실험 이후에 두 지역의 선충종을 확인 한 결과 정선지역은 클로버씨스트선충으로 동정되었고, 태백지역은 사탕무씨스트선충과 클로버씨스트선충이 혼재하였다(Mwamula et al., 2018). 씨스트선충 유충은 씨스트선충의 알의 부화 촉진을 위해 배추뿌리 삼출물에 씨스트를 침지시켜 유충을 부화시켜 사용(Kabir et al., 2015)하였는데 부화 24시간 이내의 유충들만 이용하여 실험에 이용하였다. 배추 뿌리 삼출액은 Kim et al. (2016)의 방법으로 조제하여 사용하였는데 뿌리와 함께 채취한 배추의 뿌리 부분을 물에 씻어 흙을 제거 한 다음, 물 1 L에 20 포기의 배추를 뿌리가 잠기게 24시간 동안 담가 둔 후 뿌리 침출수를 만들었다. 침출수는 부유물이나 잔재물을 제거하기 위하여 여과지(ADVANTEC #2)를 깐 깔때기로 걸러 낸 후 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

실험에 사용 된 한련초(Eclipta prostrate) 추출물은 Shin et al. (2016)이 소나무재선충에 대한 활성 검정을 위해 사용하였던 방법으로 추출하였는데 약재상에서 건조된 한련초 전초를 구입하여 100 g을 분쇄한 후 500 ml의 메탄올을 넣어 80^oC에서 4시간씩 3회 반복하여 추출하였으며, 추출물을 여과지(Sanyo No.2, Japan)에 거른 후 회전식 감압농축기(N-11, Japan)를 사용하여 40^oC에서 농축시킨 다음 건조시켜 추출물을 얻었다.

위의 방법을 사용하여 얻은 건조한 메탄올추출물을 증류수에 현탁시킨 후 Song et al. (2015)이 사군자 추출물 분획물 제조 방법에 사용한 방법과 동일한 방법으로 단계적으로 극성을 높여 가면서 용매 분획하였는데 n-butanol(n-BuOH), 클로로포름(CHCl₃), 에틸아세테이트(EtOAc), n-hexane, 메탄올(MeOH), 증류수로 순차적으로 분획하였다. 그 결과 부탄올, 클로로포름(CHCl₃) 에틸아세테이트(EtOAc), 헥산, 메탄올 분획물과 물층 분획물을 얻었고, 메탄올을 이용하여 10,000 ppm으로 현탁시킨 후 증류수를 사용하여 1,000, 100, 10, 1 ppm 농도로 희석시켜 사용하였다.

살선충 효과검정은 Kim et al. (2016)의 선행실험과 동일하게 12 well multi-well plate (SPL, Korea)를 이용하여 각각의 well에 농도별로 희석한 한련초 추출물 0.5 ml를 처리하고, 살선충 효과 검정에서는 씨스트선충 유충 50마리를 0.5 ml 피펫으로 넣어주었으며 부화 억제율 검정에서는 알 50개를 0.5 ml 넣어주었다. 한 well을 한 반복으로 하여 4반복 처리하였는데 메탄올 희석농도별량을 처리한 대조군과 증류수만을 처리 한 무처리구를 두었다. 접종 후에 각각의 plate는 알루미늄호일(Lotte Alminum Co., Korea)로 감싸서 빛이 들어가지 않게 해 주고, 25^oC 항온기(HB 303 DH-0, HanBaek, Korea)에 보관하였다. 살선충 효과 검정은 접종 12시간과 24시간 후 선충의 치사여부를 해부현미경(Nikon SM1000, Japan)을 사용하여 조사하였는데 핀으로 충체를 건드려 움직임이 없는 것을 죽은 것으로 판정하였다.

살선충 효과 검정에서는 증류수를 사용하였고, 부화억제 효과 검정에서는 배추 뿌리 삼출액을 사용하였다. 부화 억제율 검정은 살선충 효과 검정과 동일한 방법으로 각각의 분획별 물질을 12 well multi-well plate (SPL, Korea)에 처리 한 뒤 7일간 매일 선충의 누적 부화수를 해부현미경(Nikon SM1000, Japan)을 사용하여 조사하였다. 한 well을 한 반복으로 4반복 처리하였다.

포트실험은 직경 14 cm × 높이 10 cm 크기의 플라스틱 포트에 살균한 밭 토양 800 g 씩을 넣은 뒤, 육묘장에서 구입 한 파종 20일 된 춘광 배추묘를 이식하고, 물을 충분히 관주하였다. 다음날 물이 적당히 rect마른 것을 확인 한 후 Griffin (1981)이 제시 한 경제적 피해허용 수준인 토양 1 g 당 씨스트선충 알 2개의 밀도로 각 포트 당 1,600개의 알을 접종하였다. 접종은 옮겨 심은 배추의 뿌리 주변 네 방향에 10 ml 피펫팁으로 2 cm 깊이의 구멍을 내고, 피펫을 이용하여 접종하였다.

메탄올로 추출한 한련초 추출물 100,000 ppm을 에탄올에서 녹여 증류수를 이용하여 1,000 ppm으로 희석하여 실험에 사용하였다. 한련초 추출물 처리는 Table 1에서 같이 정식직후(0), 정식 10일후(10), 20일후(20), 30일후(30)로 구분하여 처리하였는데 처리 횟수를 4회(0, 10, 20, 30), 3회(10, 20, 30), 2회(10, 30일 후와 10, 20일 후) 처리로 나누어 처리를 하였다(Table 1).

에탄올을 처리한 대조 처리구와 증류수를 처리한 무처리구를 두었고, 하나의 pot를 한 반복으로 하여 10 반복으로 처리하였다. 한련초 추출물은 2 L/m² 양으로 처리 하였는데 실험에 사용한 비닐 pot는 지름이 14 cm여서 pot당 30.8 ml씩 처리하였다. 접종 한 pot는 실내온도 25 ± 2^oC에서 식물 생육대에 올려 식물재배용 형광램프(FL 40PG EAGLITE, NAMYUNG, Korea) 하에서 생육시켰다. 40일묘 까지는 pot당 30 ml씩 관수하였고, 이후부터 조사일 전까지는 60 ml씩 관수 하였으며, 흙의 습한 정도를 확인 한 후 물의 양을 조절해 주었다.

효과 조사는 처리 40일 후에 하였는데 pot 토양과 배추뿌리의 암컷 씨스트선충 수와 씨스트 수 및 알 수를 조사하였다. 씨스트선충은 씨스트선충의 분리 및 씨스트 선별에서와 같은 방법으로 체를 사용하여 분리한 후 해부현미경 하에서(Nikon SM1000, Japan) 암컷 씨스트선충 수와 씨스트 수를 조사하였다.

씨스트 내에 있는 알 수 조사는 1.5 ml 코니칼튜브(conical tube, SPL, Korea)에 씨스트를 넣고, Homogenizer(PT 1300 D, Kinematica, USA)를 이용하여 8000 rpm으로 3초간 씨스트껍질을 깬 다음 해부현미경(Nikon SM1000, Japan) 하에서 수를 조사하였다.

한련초 추출물 야외 검정은 사전조사로 토양 내 씨스트 감염여부를 확인 후 태백시 삼수동(N 37°25’58.26”, E128°98’30.96”)에서 수행하였는데 한 처리구를 10 m² 크기로 하였는데 폭 50 cm ×길이 20 m의 두둑을 만들고 육묘장에서 구입한 20일묘 배추(춘광)를 30 cm 간격으로 심었다. 한련초 추출물 pot실험에서 사용한 동일한 한련초 추출물을 1,000 ppm으로 희석하여 관주 처리하였는데, 2 L/m²로 처리하여 각 배추당 50 ml씩 처리하였다. 처리시기는 정식 당일 처리와 정식 40일 후 처리로 구분하여 처리하였다. 물만 처리한 무처리구를 두었고, 처리구는 난괴법으로 배치하였으며 처리구당 배추 10포기를 한 반복으로 하여 3반복 조사하였다.

씨스트선충 조사는 정식 전 토양 내 씨스트 수와 씨스트 내 알 수를 조사하였고, 정식 70일 후에 토양과 배추뿌리에서 암컷 씨스트선충 수와 씨스트 수 및 알 수를 각각 조사하였다. 조사는 각각의 고랑에서 배추 10포기를 조사하였는데 각 배추별로 씨스트와 씨스트 내 알 수를 조사하였고, 토양 내 씨스트선충 조사는 각 반복 내에서 배추 뿌리 채취 시 주변에 붙어 있던 흙들을 모두 모아 고루 섞은 뒤 300 cc를 취하여 씨스트선충 수와 씨스트 수 및 알 수를 조사하였다.

각 처리별 자료들은 Tukey’s Studentized Range (HSD) Test를 이용하여 처리 평균간 차이를 분산분석 하였는데 알 수는 log 변환하여 분석하였다(SAS 9.3 user’s guide, 2011). 알 수 자료의 결과는 log 변환전의 값으로 표기하였으며 모든 자료는 평균 ± 표준편차로 표기하였다.

부화억제율 검정결과 분획물의 농도가 낮을수록 부화율이 증가하는 경향을 보였으며 분획물별로는 헥산과 부탄올층에서는 10 ppm 농도까지 통계적으로 유의한 낮은 부화율을 보였고, 메탄올층의 경우 1000 ppm 농도에서만 통계적으로 유의한 차이를 보였다(df = 7, 16, F = 47.6, P=0.0001) (Table 2).

살선충 효과 검정에서는 클로로포름 분획의 활성이 12시간 24시간 모두 100 ppm 농도까지 낮은 생충율을 보였는데(12시간 후: df = 7, 24, F = 20.83, P = 0.0001, 24시간 후: df = 7, 24, F = 34.53, P = 0.0001) 헥산층 분획물은 24시간 처리 시 1000 ppm 농도에서 17.0%의 낮은 생충율을 보였다(Table 3).

한련초 추출물의 처리시기에 따른 방제효과 검정을 pot에서 수행한 결과 씨스트 수(df = 4, 45, F = 0.72, P = 0.6122)나 알 수(df = 4, 45, F = 2.24, P = 0.064) 모두 4회 처리구에서 가장 낮게 나타났으나 통계적인 차이는 없었다(Table 4).

야외 방제효과 시험 결과 정식 직후 처리 시 전체 씨스트 수는 한련초 추출물 처리구에서 감소하였으며(df = 2, 6, F = 8.29, P = 0.0187) 전체 알 수는 무처리와 비교했을 때 감소하였다(df = 2, 6, F = 5.68, P = 0.0413)(Table 5).