Editorial Board

3개 이상의 건강한 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 봉군에서 무작위 선발한 일벌을 국립농업과학원 곤충산업과에서 공급받아 시험을 진행하였다.

시험에 사용한 약제는 dimethoate (Dr. Ehrenstorfer, Germany)를 사용하였다.

서양뒤영벌의 먹이 공급 및 약제를 공급하기 위해 2 mL 주사기(Henke-Sass Wolf, Germany)를 사용하였다. 먹이용 주사기는 팁을 제거하여 먹이 공급이 용이하게 하였으며 약제용 주사기는 팁을 제거하지 않았다(Fig. 1A). 시험용기는 환기가 되고 세척이 가능한 약 15 cm³ 이상의 왕대보호기(roller queen cage, 메인양봉원)를 사용하였으며 주사기와 고정 될 수 있도록 주문 제작한 고무 마개를 조립하여 사용하였다(Fig. 1B). 시험용기는 주문 제작한 시험대에 일렬로 고정하여 서양뒤영벌이 후각과 시각적으로 접촉 할 수 있게 배치하였다(Fig. 1C). 뒤영벌은 개체간 영양교환(trophallaxis)을 하지 않는 습성이 있어 개체당 섭식량 차이로 인해 시험결과에 영향을 준다(Van der Steen, 2001). 또한 서로 다른 봉군으로부터 선별될 경우 뒤영벌간에 물리적 충돌이 일어날 수 있으며 이는 대조군의 높은 치사율과 LD₅₀ 값에 영향을 준다고 알려져 있다(Hanewald et al., 2015). 따라서 꿀벌독성시험법과는 다르게 한 마리씩 개별적인 케이지에 사육되는 방법이 반영되었다.

Fig. 1. 
Photographs of trial materials for acute toxicity tests: A, feeding devices ((left) a syringe with a tip, (right) a syringe without a tip); B, a single housing cage; C, a trial setup (the rack is inclined to the syringes for ad libitum feeding).

급성 접촉 및 섭식독성시험의 시험 전 처리 과정은 다음과 같다. 봉군으로부터 무작위 수집한 서양뒤영벌을 마취시키지 않고 적색조명 아래 한 마리씩 조립이 완료된 시험용기에 넣어 시험대에 고정한 후 최소 8시간 이상 시험조건에 순응시켰다. 서양뒤영벌을 시험용기에 넣기 전 무게를 측정하였으며 너무 작거나 큰 것은 시험에 사용하지 않았다. 한 처리군 당 1마리씩 30반복으로 시험을 진행하였다. 50% 자당용액을 먹이로 사용하였으며 먹이용 주사기로 급여하였다. 순응기간 및 시험기간 동안 서양뒤영벌이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 급성 섭식독성시험의 경우, 처리한 약제를 충분히 섭취할 수 있도록 약제를 처리하기 전 4시간 동안 먹이를 공급하지 않았다.

시험이 진행되는 동안 실험실 환경은 온도 25 ± 2^oC, 상대습도 60 ± 20%, 암조건을 유지하였으며 관찰을 위해 조건을 이탈한 시간이 2시간을 넘지 않도록 하였다.

순응기간이 끝난 서양뒤영벌은 약제 처리 전 CO₂ 가스로 마취하였으며 W 형태로 접은 종이 사이에 등쪽을 보이도록 한 마리씩 배치하였다(Fig. 2B). 시험물질인 dimethoate는 증류수로 용해하였으며, 시험용액의 균등한 도포를 위해 계면활성제 triton X-100(Sigma Aldrich, USA)을 사용하였으며 시험 용액 중 함량은 0.1%로 하였다. Dimethoate 최종 처리양이 각각 10, 12, 15 μg a.i./bumblebee가 되도록 stock solution을 제조하였다. 각 처리군 당 최종 처리양이 동일하게 각각 2 μL, 5 μL로 용량을 달리하여 처리하였다. 정량적인 약제처리를 위해 multipette M4 pipette (Eppendorf, Germany)를 사용하였으며(Fig. 2A), 시험약제는 Fig. 2C와 같이 서양뒤영벌의 등쪽 흉부(thorax)에 도포하였다. 약제를 처리한 후, 시험용기에 옮겨 최소 48시간 또는 최대 96시간 동안 치사율 및 이상증상을 관찰하였다.

Fig. 2. 
Photographs of trial materials and procedure for acute contact toxicity test: A, multipette M4 pipette; B, bumblebees placed on W-folded papers; C, individual treatment on the dorsal side of the thorax of bumblebees.

급성 섭식독성시험은 제공된 시험용액을 충분히 섭취하지 않는 개체군(non-feeder)을 시험에서 제외하여야 하기 때문에 순응이 끝난 서양뒤영벌을 한 처리군 당 1마리씩 45반복으로 시험하였다. 약제처리기간 동안 제공된 시험용액을 80% 미만으로 섭취한 개체를 non-feeder로 정의하였으며, 섭식량의 판단 기준은 Fig. 3과 같이 설정하였다. 시험용액인 dimethoate 2000 mg/L을 제조하여 50% 자당용액으로 20배 희석한 후, 약제용 주사기 팁에 40 μL씩 넣어 최종 처리양이 4 μg/bumblebee 되게 처리하였다. 약제는 4시간 노출하였으며 섭취한 먹이의 양을 기록하였다. 45마리 중 non-feeder를 제외한 후 최종 30마리를 선정하여 시험을 진행하였다. 약제 노출 후 먹이용 주사기로 교체하였으며 관찰 기간 동안 먹이를 자유롭게 공급하였다. 최소 48시간 또는 최대 96시간 동안 치사율 및 이상증상을 관찰하였다.

Fig. 3. 
Consumption amount of test solution after 4 hour exposure: A, ≥30 μL; B, 20 μL-30 μL; C, 10 μL-20 μL; D, <10 μL.

뒤영벌 급성 접촉 및 섭식독성시험법은 실험실 조건에서 뒤영벌 일벌을 사용하여 약제를 노출한 뒤 48시간 또는 최대 96시간을 관찰하여 반수치사량(Lethal dose, LD₅₀)를 산출하여 독성을 평가하는 시험법이다. 약제 노출 후 4시간, 24시간, 48시간의 치사개체 및 이상증상을 관찰하였으며 약제 처리군에서 24시간과 48시간 사이의 치사율이 10% 이상 증가할 경우 72시간 및 96시간까지 관찰한 후 시험을 종료하였다. 약제 노출 후 관찰사항으로는 이상행동이 관찰되지 않는 상태(unaffected, U), 움직일 수 있지만 감소된 신체 조정력을 보이는 상태(affected, A), 걷지 못하고 다리와 더듬이의 움직임이 매우 약하며, 자극에 대한 반응이 매우 약한 상태(moribund, M), 벌이 죽은 상태(dead, D)로 구분하여 관찰한 뒤 기록하였다(Table 1). 급성 접촉 및 섭식독성시험법의 시험 진행과정을 도식화하여 Fig. 4에 나타내었다.

Fig. 4. 
Procedure of acute toxicity tests for bumblebees.

OECD TG 246에 따르면 약제처리 용량을 2 μL로 제시하고 있으나 필요시 처리 용량을 달리 할 수 있다고 기재되었다(OECD 2017a). 또한 ICP-PR non-Apis working group의 ring test에서는 처리 용량을 5 μL로 하여 처리 후 96시간에서 dimethoate의 평균 LD₅₀ 값을 5 μg a.i./bumblebee로 보고하였다(Hanewald et al., 2015). 하지만 처리 용량에 따른 독성영향에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 서양뒤영벌의 약제처리 용량에 따른 독성영향을 확인하기 위해 각 처리군 당 2 μL와 5 μL로 처리하여 이상증상 및 치사율을 관찰하여 기록하였다(Table 4).

약제처리 후 4시간이 경과한 뒤 dimethoate 15 μg a.i./bumblebee를 제외한 10, 12 μg a.i./bumblebee 처리군에서는 치사개체가 관찰되지 않았다. 관찰 후 24시간과 48시간 사이에서 치사율이 10% 이상 증가하였기에 96시간까지 관찰하였다. 무처리군은 관찰 기간 동안 치사개체가 관찰되지 않았다. 약제 처리 후 24시간에서 2 μL 용량 처리군의 경우 10, 12, 15 μg a.i./bumblebee dimethoate 처리군에서 치사개체가 각각 20, 21, 24 마리로 50% 이상의 치사율이 관찰되었다. 5 μL 용량 처리군의 경우 15 μg a.i./bumblebee 처리군에서 치사개체가 17마리로 50% 이상 치사율을 보였으나 10, 12 μg a.i./bumblebee에서 50% 미만의 치사율이 관찰되었다. 약제처리 48시간 경과 후에는 5 μL 용량 처리군의 10, 12, 15 μg a.i./bumblebee 처리군 모두에서 70% 이상의 치사율을 나타냈다. 이는 24시간 관찰시점에서 affected 상태였던 뒤영벌들이 48시간 후 치사 상태가 되어 나타난 결과로 판단된다. 시험 종료 시점인 96시간에서는 5 μL 용량 처리군의 10 μg a.i./bumblebee 처리군에서 치사율이 73.3%였고 나머지 처리군에서는 모두 90% 이상의 치사율을 나타냈다.

OECD TG 246에서는 뒤영벌의 감수성과 시험결과의 신뢰성을 검증하기 위해 용매대조군의 치사율(≤10%)과 양성대조군(10 μg a.i./bumblebee) 치사율(≥50%)의 기준을 제시하였다(OECD 2017a). 본 시험 결과 급성 접촉독성시험에서 양성대조군으로 dimethoate 10 μg a.i./bumblebee 2 μL를 처리하면 48시간 후에 50% 이상의 치사율을 나타내어 양성대조군의 기준에 부합하였다. 양성대조군의 급성 접촉독성시험의 경우 48시간 또는 96시간 기준으로 독성 값을 산정할 때 시험약제 처리용량(2 μL, 5 μL)에 따른 독성영향 차이가 없음을 확인할 수 있었다

OECD TG 247에서는 시험의 유효성 검증 기준으로 양성대조군 dimethoate 4 μg/bumblebee에서 관찰기간 동안 50% 이상의 치사율을 제시하고 있다(OECD 2017b). 시험 결과 무처리군의 경우 관찰기간 동안 치사 개체는 관찰되지 않았다. Dimethoate 처리군에서는 초기 4시간에 뒤영벌이 20%가 치사되었으며 48시간 후 90% 이상의 치사율을 나타내었다(Table 5). 본 시험 결과 양성대조군에서 관찰기간 동안 50% 이상의 치사율을 나타내어 OECD 급성 섭식독성시험의 기준에 부합하였다.

본 연구에서는 OECD 시험 유효성 기준에 부합하도록 서양뒤영벌 급성 접촉 및 섭식독성시험법을 구축하였다. 앞으로 이 시험법을 활용하여 최근 이슈가 되고 있는 네오니코티노이드계 농약 및 다양한 농약에 대한 뒤영벌의 독성 정보를 제공할 수 있을 것이라고 생각된다.