The Korean Society of Pesticide Science

Editorial Board

The Korean Journal of Pesticide Science - Vol. 25 , No. 2

[ ORIGINAL ARTICLES ]
The Korean Journal of Pesticide Science - Vol. 25, No. 2, pp.82-98
Abbreviation: Korean J. Pestic. Sci.
ISSN: 1226-6183 (Print) 2287-2051 (Online)
Print publication date 30 Jun 2021
Received 19 Mar 2021 Revised 28 Apr 2021 Accepted 30 Apr 2021
DOI: https://doi.org/10.7585/kjps.2021.25.2.82

잔류농약 분석 정도관리를 위한 상향식 측정불확도 추정방법 제안
정원태1 ; 박상원2 ; 노현호1 ; 임흥빈3 ; 경기성4 ; 류송희1, *
1국립농업과학원 잔류화학평가과
2농촌진흥청 연구운영과
3충북대학교 특용식물학과
4충북대학교 환경생명화학과

Proposal of the Bottom-up Approach in Estimating the Measurement Uncertainty for Quality Control of Pesticide Residue Analysis
Won Tae Jeong1 ; Sang Won Park2 ; Hyun Ho Noh1 ; Heung bin Lim3 ; Kee Sung Kyung4 ; Song-Hee Ryu1, *
1Residual Agrochemical Assessment Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea
2R&D Cordination Dvision, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Jeonju 54875, Korea
3Department of Industrial Plant Science & Technology, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea
4Department of Environmental and Biological Chemistry, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Korea
Correspondence to : *E-mail: songhee5958@korea.kr

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초록

측정불확도는 측정량에 기인한 값이 통계적 분산을 표현한 것이다. 농약 잔류허용기준(maximum residue limit, MRL)에 측정불확도의 적용은 분석적 오류로 인해 초래할 수 있는 사회적 파장을 예방할 수 있는 수단이 될 수 있다. 하향식 측정불확도 추정은 단순화된 절차를 지향하고 잔류농약 분석에 실용적이면서 적합한 접근방식으로 인식되고 있으나 분석절차의 모든 요소의 불확실성을 추정하는 상향식접근법과 병행도 필요하다. 이 총설에서는 ISO-GUM 기반의 상향식 접근에 따라 잔류농약 분석단계별 불확도가 발생할 수 있는 요인(샘플링, 표준물질, 회수율, 크로마토그래피, 검량선, 무게 및 부피계)을 판별하고 그에 따른 측정불확도 추정 방법에 대해 기술하였다. 또한, 식품공전의 유기염소계 시험법을 통해 대두 중 알파-엔도설판이 검출되었다는 가정하에 측정불확도를 추정하고 이에 따른 확장불확도가 최종 잔류량에 미치는 영향을 나타내었다. 이 절차의 주요 불확도 요인은 어골도를 통해 시료칭량, 부피계, 표준용액조제, 검량선 및 회수율로 판별되었고 각각의 상대표준불확도를 산출한 후 합성하여 포함인자와 함께 확장불확도를 산출하였다. 이 총설에서 제시한 잔류량은 0.945 mg/kg으로 대두의 MRL인 1.0 mg/kg를 초과하지 않지만 산출된 확장불확도인 0.155 mg/kg을 적용할 때 대두의 잔류량이 최대 1.1 mg/kg으로 MRL을 초과하는 결과가 도출될 수 있음을 보여준다. 따라서 측정불확도 추정 방법을 확립하여 분석 결과의 오차와 분석과정의 불확도 요인 저감을 통해 잔류농약 분석 역량 강화 및 신뢰성 있는 분석결과를 도출하여 강화된 MRL에 선제적으로 대응할 필요가 있을 것으로 판단된다.

Abstract

Measurement uncertainty is the expression of the statistical dispersion of the values attributed to the measurement value. The application of measurement uncertainty to the maximum residue limit (MRL) can be a means of preventing social repercussions caused by analytical errors. The estimation of “top-down” approaches for analysis of residual pesticides is recognized by practical and suitable approaches based on assumptions that simplify the process. However, the opposite approach, “bottom-up” is also needed to estimate the uncertainty of all individual components of the analytical procedure. This review delineated the method of estimating measurement uncertainty along with the determination of the need for uncertainty in each analysis process (sampling, standard, recovery, chromatography, linearity, weighting and Volumetric system) according to the ISO-GUM-based bottom-up approach. Furthermore, the measurement uncertainty was estimated assuming that alpha-endosulfate was detected in soybeans through the test method of organochlorine pesticides in Food Code. Consequently, it was shown the effect of the estimated expansion uncertainty on the residual acceptance criterion. The main uncertainties of the procedure were determined to be sample weight, volumertic apparatus, standard solution, linearity, and recovery through the fishbone diagram, the extended uncertainty is obtained from each relative standard uncertainty by multiplying the combined standard uncertainty by coverage factor.


Keywords: Pesticide residues, Quality control, Measurement uncertainty, ISO
키워드: 잔류농약, 정도관리, 측정불확도, 국제표준화기구

서 론

잔류농약분석은 인간 및 환경에 농약의 노출 정도를 추정하고 농식품 안전에 대해 소비자의 신뢰를 강화하는데 중요한 역할을 하고 있다(Stefanelli et al., 2013). 농산물로부터 섭취할 수 있는 잔류농약의 안전성을 확보하기 위해 각국에서는 잔류허용기준(Maximum Residue Limit, MRL)을 설정하여 관리하고 있으며, 농촌진흥청에서는 농약 사용 횟수 및 시기 등의 안전사용기준을 설정하고 잔류허용기준을 초과하지 않도록 관리하고 있다. 또한 2019년 1월 농약허용물 질목록관리제도(Positive List System, PLS)가 도입되면서 농산물 중 잔류농약에 대한 허용 기준이 더욱 강화되었다(Chang et al., 2018). 강화된 MRL에 부합하는 잔류농약 분석법을 개발하기 위하여 다양한 분석기술이 활용되고 있다. 특히 2003년 처음 도입된 QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) 방법(Anastassiades et al., 2003)은 신속하고 경제적인 분석이 가능하다는 장점을 앞세워 가장 널리 사용되고 있는 분석법이며, 이 방법을 활용하기 위하여 탠덤질량분석기 및 고분해능질량분석기 같은 정밀분석기기가 잔류농약분석에 도입되었다. 이로 인해 복잡한 매질에서 극미량의 잔류농약을 검출하고 정량할 수 있게 되었다(Lehotay, 2011; Mol et al., 2011; Cervera et al., 2012). 최근에는 잔류농약 분석실험실의 분석적 역량 및 신뢰성 보증 향상을 위해 국제적으로 통용되는 인정 제도를 도입하고 이에 따른 내·외부적 정도관리체계를 유지하고 있다(Zilli, 2013). 국제표준화기구(International Organization for Standardization, ISO)는 교정/시험기관의 일반적인 요구사항을 표준화한 국제표준규격 ISO/IEC 17025를 제정하여 배포하였으며, 이 가이드라인에서는 정도관리를 위한 숙련도 평가 및 분석결과에 측정불확도를 적용하여 신뢰성 있는 결과를 제공하고 평가하도록 권고하고 있다(Lombard, 2006; Desimoni and Brunetti, 2011; Lee et al., 2015; ISO, 2017). 특히, 측정불확도는 실험과정 중에 발생할 수 있는 오차의 요인을 추출하고 이에 대한 불확도 값을 산출하여 분석결과의 정확성과 신뢰성을 향상시키는 것으로 분석결과의 오차 또는 오류를 예측하고 저감할 수 있는 대안이 될 수 있다(ISO, 2007).

국제측정학 용어집에서는 측정불확도를 “사용된 정보를 기초로 하여, 측정값에 대한 분산 특성을 나타내는 음이 아닌 파라미터(Non-negative parameter characterizing the dispersion of the quantity values being attributed to a measured, based on the information used)”로 정의하고 있다(ISO, 2007). 즉, 측정값을 합리적으로 추정한 분산범위까지 포함하여 표현한 정량적 측정값이 측정불확도인 것이다(CCPR, 2004). 측정불확도는 ISO에 의해 최초 확립된 후 여러 국제기구들은 다양한 측정 분야에 적용할 수 있도록 세분화하였다(ISO, 2017). 그 과정에서 접근 방식이 크게 상향식과 하향식으로 나뉘었으며, 의학, 미생물학, 임상학 등 적용범위가 점차 확대되었다(Lombard, 2006; Martinello et al., 2020). 상향식 접근은 분석절차의 모든 단계에 대한 불확실성을 추정하는 것이며, 하향식 접근은 method validation, 내부품질관리 데이터 등을 활용한다. 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC) 및 EUROLAB에서는 잔류농약분석에 초점을 맞춘 측정불확도 가이드라인을 설정하였고 하향식 접근방식을 적용하고 있다(EUROLAB, 2007; Medina-Pastor et al., 2011; Omeroglu et al., 2012). 유럽의 경우 잔류농약분석 실험실들의 분석결과에 대한 재현성을 조사하고 하향식 접근으로 불확도를 추정하는 가이드라인을 마련하였으며, 이 가이드라인에서는 측정값의 50%를 확장불확도로 적용한 결과가 MRL을 초과하지 않아야 한다고 제시하였다(European Commission, 2017).

PSL제도가 본격 도입되어 MRL이 강화됨에 따라 분석 역량뿐만 아니라 실험실 유지 및 관리 등 전반적인 정도관리체계 역시 중요시되고 있기 때문에 측정불확도의 활용은 분석에 대한 신뢰성과 정확성을 향상시킬 수 있는 수단이 될 수 있다. 하지만 국내 잔류농약 분석 분야에서 ISO 17025를 인정받은 시험기관을 제외하고 아직까지 측정불확도가 적용되고 있지 않다. 잔류농약 분야에서 하향식 측정불확도 추정을 위해서는 분석실험실 간의 재현성을 측정하고 불확도 요인을 추출해야 하는데 아직 이러한 체계가 확립되어 있지 않기 때문에 이를 적용하기에는 다소 제한적이다. 상향식 측정불확도의 경우 각 분석기관에서 독립된 방법의 측정불확도 추정이 가능하여 이에 대한 불확도 요인 추출이 가능하다. 따라서 본 총설에서는 측정불확도에 대해 소개하고 상향식 측정불확도 접근방식을 이용하여 잔류농약 측정 절차에 따른 불확도 요인을 파악하고 불확도 추정방법을 제안하였다. 또한, 가상의 시나리오를 이용하여 상세한 불확도 추정방법을 제시하였다.


측정불확도의 배경
측정불확도의 개념과 확립

측정불확도의 개념은 측정에 항상 불확실성이 존재하고 참값을 정확히 알 수 없기 때문에 모든 측정값은 추정값이라는 것에서 기인되었다. 이러한 불확실성을 표현하기 위해 오차(측정값에서 참값(협정값)을 뺀 값 )가 사용되지만 우연적 및 계통적 효과에 대해 완전히 보정할 수 없고 이를 통합한 정량적 표현이 명확하지 않았다. 국제도량형국(International Committee for Weights and Measures, BIPM)은 광범위한 측정 스펙트럼에서 불확실성을 평가 및 표현 할 수 있는 측정불확도의 표준화 확립을 ISO에 건의하였고 이에 따라 ISO는 국제전기기술위원회(International Electrotechnical Commission, IEC), 국제임상화학회(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, IFCC), 국제시험기관인정기구협력체(International Laboratory Accreditation Cooperation, ILAC), 국제순수응용화학연합(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC), 국제순수 및 응용물리학연맹 (International Union of Pure and Applied Physics, IUPAP), 국제법정계량기구(International Organization for Legal Metrology, OIML)와 협력하여 1993년 측정불확도 표현지침 초판인 “Guide to the Expression of Uncertainty Measurement (GUM)”을 발간하였다(ISO, 2008). 또한, GUM은 현재 ISO Guide 98-3로 재발간 되었으며, 화학측정의 국제적 추적성 및 품질관리 시스템 구축을 위해 설립된 EURACHEM은 분석화학의 국제소급성 협력회(Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry, CITAC)와 공동으로 ISO의 GUM을 기반으로 분석화학에 적용할 수 있는 불확도 측정 가이드라인을 확립하였다. 또한 여러 국제기구들은 해당 분야에 적합한 측정불확도 추정에 대한 가이드라인을 제정하고 지속적으로 개정하고 있다(EURACHEM, 2000; CCPR, 2004). 국내의 경우 ISO Guide 98-3을 기반으로 한국인정기구(Korea Laboratory Accreditation Scheme, KOLAS)에서 한국형 지침인 “측정결과의 불확도 추정 및 표현을 위한 지침(KOLAS-G-002)”을 고시하였으며, 이를 국제인증과 관련된 시험 및 교정기관에서 활용하고 있다.

측정불확도의 접근법

ISO에 의해 측정불확도가 도입된 후 다양한 분야에 적합하도록 최적화되고 현재는 측정불확도의 추정 방식을 크게 상향식(bottom-up)과 하향식(top-down)으로 구분하여 활용하고 있다(Martinello et al., 2020). 상향식 접근법은 GUM 방법으로 ISO Guide 98-3 및 EURACHEM에서 제시한 방법을 의미한다. 이 방법은 수학적 측정모델을 기반으로 측정결과에 반영되는 대부분의 매개변수(교정, 측정기구, 온도 등)에 대한 불확도 요인을 추정하는 것이며, 추가적인 실험이 필요 없고 실험실내 현실적인 불확실성의 추정값을 제공할 수 있다는 장점이 있다(Alder et al., 2001). 하지만 고려해야 하는 불확도 요인이 많아 시간적 소모가 크고 복잡하며 화학적 특성으로 유발될 수 있는 다른 요인을 판별하기 어려운 단점도 있다.

하향식 접근법은 내부품질관리 데이터 및 method validation을 기반으로 불확도를 추정하는 것을 의미하며, 일반적으로 수학적 모델식의 확립이 어렵거나 불확도 요인에 대해 정확하게 판별하기 어려운 경우에 사용되고 있다(Lee et al., 2015; Martinello et al., 2020). Method validation은 동일한 시료에 대해 서로 다른 실험실에서 분석한 결과에 대한 재현성, 인증표준물질의 인증값, 숙련도시험의 결과들을 보정하여 활용할 수 있다. 하향식 접근과 관련된 측정불확도 추정에 대한 국제표준지침으로 ISO 21748과 ISO 5725가 제정되어 있다. 이 방법은 복잡한 단계를 거치지 않아 실용적이고 경제적이라는 장점이 있지만 계통적 오차가 발생되기 쉽고 그에 따라 발생한 오차를 식별하기 어려운 단점이 있다(Sundaram, 1990).

상향식 접근이 하향식보다 활용 빈도가 높으며, 두 접근 방식에 대한 통계적 유의미한 차이는 없다고 보고되었다(Martinello et al., 2020). 이에 따라 CAC를 비롯한 일부 국가 당국의 지침들은 상향식 방식이 수 많은 농약에 대한 개별적인 측정불확도 추정이 어렵기 때문에 프로세스가 간소화된 하향식 접근 방식을 권장할 뿐 아니라 잔류농약분석 관련 문헌에서도 하향식 접근법에 초점을 둔 사례가 꾸준히 보고되고 있다(Medina-Pastor et al., 2011). 한편, Ratola et al. (2008)는 heptachlor 및 lindane 분석에 대해 상향식과 하향식 방법을 활용하여 측정불확도를 비교하였는데 상향식은 검출한계 부근의 농도에 한하여 불확도가 증가했지만 하향식은 저농도부터 고농도까지 불확도는 상향식보다 높게 추정된다고 보고하였다. 또한 실험실간 재현성을 이용하여 하향식 방식의 불확도를 추정할 때는 대상 물질의 특성, 매질 및 전처리 방법 등을 상호 협의하여 획일화된 방법으로 분석한 결과를 얻는 것이 중요하다고 보고하였다(Ratola et al., 2008). 현재까지 잔류농약 분석에서의 측정불확도 추정에 대한 문헌 및 지침은 대부분 하향식 접근에 초점을 맞추며 프로세스가 간소화 된 것은 분명하다. 그러나 이런 사례들로 볼 때 수 많은 농약에 대한 인증표준물질, 숙련도시험자료 및 재현성 관련 데이터 같은 명확한 기준을 확보하기 어려운 경우도 발생될 수 있기 때문에 상향식 접근법의 적용도 고려해야한다고 판단된다.

측정불확도의 추정방법

일반적인 상향식 측정불확도 추정에 대한 일반적인 흐름을 Fig. 1에 제시하였으며, 본 항목에서 흐름도에 따라 최종적인 측정값의 불확도 산출에 기여하는 요소들의 정의 및 평가방법은 아래 항목에 기술하였다.


Fig. 1. 
Flow chart to calculate measurement uncertainty approached by bottom-up method.

1) 측정모델 및 어골도

측정모델은 최종 측정값(Y)을 산출하기 위한 매개변수 또는 입력량의 수학적 관계를 의미한다. KOLAS-R-002에 의하면 측정결과의 측정값은 직접적으로 측정되지 않고 함수관계 f를 통해 입력량 XN으로부터 결정되며(식 1), 계통효과에 대한 보정값 및 보정인자를 포함하여 함수관계가 더 복잡해질 수 있음을 명시하고 있다. 잔류농약분석에서 측정모델은 잔류량을 산출하는 방정식을 측정모델로 사용할 수 있으며, 측정모델을 통해 불확도 요인들을 구별하여 표준불확도를 평가하고 합성 할 수 있다.

Y=fX1,X2,,XN(식 1) 

또한 불확도가 발생할 수 있는 매개변수들을 구체적으로 식별하기 위해 어골도(fish-bone diagram)가 활용되고 있다(Lee et al., 2010). 어골도는 분석과정에서 발생할 수 있는 불확도 요인을 추출하고 이를 시각화 하는데 유용하다. Fig. 2는 잔류농약 분석과정에서의 불확도 요인을 추출하기 위한 어골도 사용의 예시를 보여준다(Cuadros-Rodrıguez et al., 2002).


Fig. 2. 
Fish bone diagram to obtain uncertainty factors in pesticide residue analysis (Cuadros-Rodrıguez et al., 2002).

2) 표준불확도

어골도를 통해 측정불확도 요인을 파악하였다면 각 매개변수에 대해 표준불확도를 평가하여야 한다. 표준불확도는 입력값(xi)의 추정된 표준편차로 표현된 불확도를 의미하며, u(xi)로 표현한다(Farrance and Frenkel, 2012). ISO 및 EURACHEM은 표준불확도를 추정하기 위해 A형과 B형으로 분류하며 이는 얻은 정보의 데이터가 다른 절차에 의해 획득됨을 강조하기 위해 다르게 정의하고 있지만 본질적으로 동일하다(Farrance and Frenkel, 2012). A형은 반복적인 측정에 대한 통계분석을 기반으로 수행되며 입력값의 분산이 반복 측정에 따라 우연 효과로 인해 정규분포의 형태로 분산되어 있다고 가정하고 있으며, A형 표준불확도는 식(2)로 산출한다.

uxi=sn(식 2) 

n은 반복수이며, s는 입력값의 실험 표준편차이다.

반면, B형은 비통계적 절차로 얻은 값으로 추정한다. 일반적으로 장비 및 기구의 교정 성적서 또는 규격, 인증표준물질의 불확도, 저울의 분해능 등을 활용한다. 기기의 규격, 교정 성적서 등 인용된 불확도가 표준편차의 특정배수(σ 또는 σ2)라는 것이 표현되어 있다면 인용된 값을 그 배수 나눈 값으로 표준불확도를 평가할 수 있고 신뢰수준으로 주어진 경우(예, 95% 등) 정규분포로 인용된 불확도를 계산한 것으로 가정하고 정규분포의 적절한 포함인자(k)로 나누어 평가한다. 입력량에 대한 상한 및 하한만이 추정되는 경우(저울의 분해능 및 표준물질의 허용오차 등) Fig. 3의 (b)와 같이 입력량이 직사각형 분포 a-와 a+ 구간에 어디에나 있다고 가정할 수 밖에 없고 이 때 표준불확도는 식(3)을 이용하여 산출한다.

uxi=α3(식 3) 

Fig. 3. 
Distribution functions. (a) Normal distribution with standard uncertainty u(x) = standard deviation s(x). The area of x¯ ± s(x) covers 68% of the data. (b) Rectangular distribution with standard uncertainty u(x) = 0.6a. The shaded area of x¯ ± u(x) covers 58% of the data. (c) Triangular distribution with standard uncertainty u(x) = 0.4a. The shaded area of x¯ ± u(x) covers 65% of the data (Meyer, 2007).

Fig. 3의 (c)와 같이 중앙 근처의 값을 가질 수 있는 확률이 높을 때 삼각형분포로 가정하고 표준불확도는 식(4)로 산출한다.

uxi=α6(식 4) 
3) 합성표준불확도 및 상대표준불확도

측정결과의 매개변수에 대한 표준불확도는 제곱합의 제곱근법(root sum square method, RSSM)을 이용하여 합성하며, 이를 합성표준불확도(uc(y) 또는 uc2y)라고 한다. 각각의 표준불확도를 상관관계에 따라 감도계수 및 공분산의 항을 포함하여 산출하지만 분석화학 분야의 합성 표준불확도는 감도계수가 포함된 식(5)을 통해 산출된다(Meyer, 2007).

uc2y=i=1Nfxi2u2xi(식 5) 

감도계수는 입력량에 대한 불확도의 서로 다른 단위를 맞추기 위해 사용되는데 이는 편미분을 통해 계산된다. 그러나 편미분을 통한 계산은 복잡하여 이를 간소화하기 위해 상대표준불확도 ur(y)를 이용하고 있다. 상대표준불확도는 식(6)으로 산출되는데 이는 단위가 제거된 상태이기 때문에 감도계수의 영향을 고려하지 않아도 되며, 상대표준불확도는 합성표준불확도와 동일한 방법으로 합성하여 상대합성표준불확도로 산출할 수 있다(Meyer, 2007).

ury=i=1Nuxixi2(식 6) 
4) 확장불확도

KOLAS-R-002에서는 확장불확도를 ‘측정량의 합리적인 추정값이 이루는 분포의 대부분을 포함할 것으로 기대되는 측정결과 주위의 어떤 구간을 정의하는 양’으로 정의하고 있다. 즉, 확장불확도는 측정값이 될 수 있는 더 많은 범위로 확장시키는 것으로 바꾸어 표현할 수 있다. 표준불확도의 표준편차는 68% 범위내 존재하는 것으로 간주하기 때문에 이를 95%(k = 2), 또는 99%와 같은 신뢰수준으로 확장시키는 것이며, 이 신뢰수준의 범위를 결정하는 것이 포함인자(k)인 것이다. 확장불확도는 U로 나타내며, 식(7)에 제시한 바와 같이 합성표준불확도 또는 상대표준불확도에서 포함인자를 곱하여 산출한다. 확장불확도와 함께 최종 측정결과는 Y = y ±U 또는 y - U ≤ Y ≤ y + U로 표현하며, 이때 Y는 y의 구간에 포함되는 것으로 간주할 수 있다.

U=kucy(식 7) 
5) 유효 자유도

포함인자는 유효자유도(Veff)의 수에 따라 결정되며, 유효 자유도는 식(8)에 제시한 Welch-Satterthwaite 공식을 이용하여 산출할 수 있으며 정수로 표현한다.

veff=uc4yi=1Nciuxi4Vi=uc4yi=1Nui4Vi(식 8) 

유효자유도는 합성표준불확도가 측정값(Y)의 표준편차를 반영하는 정도에 대한 척도라 할 수 있다. 이러한 이유는 포함인자를 결정할 때, 유효자유도가 11이상이라면 95% 신뢰수준에서 2로 설정할 수 있지만 10이하인 경우 t-분포표를 이용하여 포함인자를 결정하기 때문이다. 또한, 유효자유도를 구하기 위해 각각의 표준불확도의 자유도(V)가 필요하다. A형 표준불확도의 자유도는 n개의 독립된 입력값에서 계산되는 단순한 경우 n-1, 회귀식에 대한 절편 또는 기울기에 대한 표준불확도의 자유도는 n-2로 산출된다. 반면 B형 표준불확도는 식(9)를 통해 산출되지만 인용된 정보(표준불확도 또는 추정범위)에서 자유도가 명시되지 않았다면 상대불확도 R(불확도에 대해 불확신할 확률을 나타냄)을 100%로 신뢰한다고 가정하기 때문에 자유도는 무한대(∞)가 된다.

V12uxux212100R2(식 9) 

잔류농약 분석의 측정불확도 요인

잔류농약분석은 일반적으로 시료 채취, 추출, 정제, 기기 분석 순으로 수행되며 정량분석을 위해 대상 성분의 표준물질이 사용된다(Narenderan et al., 2020). 추출, 정제 및 기기 분석은 대상 농약 및 시료의 형태에 따라 세분화되며, 전반적인 분석 효율을 평가하기 위해 회수율 시험도 수행되고 있다. 상향식 접근방법은 각 단계에 발생될 수 있는 불확도 요인을 추정하는 것을 권고하기 때문에 개별적인 불확도 요인을 판별하고 적용되어야 한다. 따라서, 본 항목에서 추출, 회수율, 표준물질, 회수율, 분석기기 및 검량선에서 발생될 수 있는 불확도 요인을 살펴보고 불확도 산출에 적용 방법을 기술하였다.

샘플링

화학 분석에서 측정불확도의 추정은 실험실 단계에서만 수행되었으나 1999년 ISO/IEC 17025가 제정된 후 샘플링 단계에서 측정불확도 추정이 도입되었다(Zorzi et al., 2002). 샘플링 과정에서의 불확도를 추정은 분석성분의 손실, 오염, 잘못된 샘플링 계획, 이질성 등을 파악할 수 있는 수단이며(Thompson, 1998, Glaeser, 2002), CAC는 샘플링에서 발생할 수 있는 상대불확도가 25-33%라고 보고하였다(Ambrus, 2009). 샘플링을 수행하기 위한 채취 지점이 확보되고 직접적인 샘플링을 수행한 경우 가변성(variability)에 대한 충분한 정보를 얻기 위해 최소 8-20개의 대상 지점을 채취하여 반복 측정하는 것을 권고한다(Hill, 2000; ISO, 2003; Ramsey and Ellison, 2007). 샘플링의 표준불확도는 분산분석(ANOVA)을 통해 산출할 수 있으며, 표본의 크기가 클수록 불확도 기여량은 감소된다(Ambrus and Soboleva, 2004). 그러나, CAC의 잔류농약분석 측정불확도 지침에는 유통 농식품 중 잔류농약의 안전성 조사를 목적으로 할 경우에 시료채취에 대한 측정불확도는 “0”으로 간주하고 샘플링의 측정불확도를 추정하는 가이드라인인 EURACHEM Measurement uncertainty arising from sampling에서는 직접 샘플링하지 않은 시료에 대해 불확도 산출을 하지 않는다(EURACHEM, 2019). 이는 명확한 샘플링 방법을 알 수 없기 때문인 것으로 판단된다(CCPR, 2004). 결론적으로 잔류농약 분석에서 샘플링에 대한 측정불확도의 추정은 상황에 따라 적용여부를 결정할 수 있다고 판단되었다.

부피 및 계량기

모든 분석실험실에서 측정에 사용되는 기본적인 용적 및 계량기인 부피플라스크, 피펫 및 전자저울은 상향식 접근방식에서 반드시 포함시키는 불확도 요인이다. 특히 부피 및 계량기에서 교정(calibration), 반복성(repeatability), 허용차(tolerance) 그리고 온도(temperature)는 불확도의 주요 원인이다. 교정성적서에는 교정에 대한 확장불확도가 제시되므로 신뢰수준의 포함인자를 나누는 B형 표준불확도를 산출할 수 있고 자유도는 무한대로 가정할 수 있다. 반복성은 용매를 부피 측정기구에 채우거나 피펫팅하여 무게를 측정 후 부피로 환산하여 측정함으로 A형 표준불확도로 평가할 수 있다. 또한 액체는 온도 변동에 따라 부피 변동을 식(10)과 같이 부피변동을 초래하기 때문에 온도에 대한 불확도를 평가하여 부피팽창계수로 이용할 수 있다.

UV=VγuT(식 10) 

여기서 y는 부피 팽창계수이며, 물(20oC)의 경우 γ = 2.1 × 10-4K-1, 유기 용매의 경우 γ ≈ 1 × 10-3K-1를 직사각형 또는 삼각형 분포(공조시설이 갖춰진 실험실)로 가정하고 평가할 수 있다(Meyer, 2007). 부피플라스크 허용차의 불확도는 제조사가 측정기구에 제시한 허용오차(예, 10 ± 0.025 mL)를 활용하며, 직사각형 또는 삼각형 분포로 가정한 B형 표준불확도 평가방법으로 산출할 수 있다. 이들의 표준불확도는 식(11)에 제시한 방법으로 합성된다.

uvolum flask=ucal2+urep2+utem2+utol2(식 11) 

반면에, 폴리 프로필렌, 폴리 메틸필렌 같은 플라스틱의 재질의 도구는 액체와 유사한 계수를 갖기 때문에 온도에 영향을 무시할 수 있다(Meyer, 2007).

계량은 모든 분석실험실에서 가장 흔하게 이루어지는 작업이며 대부분의 불확도 요인과 연관되어 있다(Reichmuth et al., 2004). 특히 저울은 반복성, 비선형성, 민감도의 허용오차, 온도 계수 부력 같은 기술적 사양에서 발생될 수 있는 매개변수를 포함하고 있다. 전자 저울의 불확도 수준은 무시할만한 수준이지만 휘발성, 분진 및 수분 흡착 현상으로 반복성이 저하될 수 있어 이는 불확도 요인으로 반영해야 한다(Reichmuth et al., 2004).

표준물질

크로마토그래피법을 통한 정량적 분석에는 분석대상 농약의 표준물질 또는 인증표준물질이 필요하다. 표준물질은 주로 상업적으로 판매되고 있는 것을 사용하며, 분말 및 액상 형태로 사용하게 된다. 대게 분말 형태의 표준물질은 순도(P) = x ± y% 같이 허용오차를 포함하여 제시되고 있으며, 이런 경우 허용오차를 직사각형 분포 식에 대입하여 결정할 수 있다(Meyer, 2007). 그러나 순도 표시가 ≥9X.X% 또는 ~9X.X%로 제시되어 있는 경우 ~기호는 분포함수의 범위가 매우 넓어 표준불확도를 구할 수 없지만 ≥97.0% 등과 같이 표현된 경우 발판함수(ramp function)로 표준불확도 평가가 가능하다(Zilli, 2013). 인증표준물질은 표준물질과 다르게 확장불확도에 대한 정보를 포함하기 때문에 분석자의 불확도 요인을 쉽게 파악 할 수 있지만 농약 인증표준물질의 개발은 제한적이므로 허용오차를 제공하는 표준물질의 사용을 권장한다.

회수율

분석물질은 매질과의 상호작용, 추출 효율 등 분석과정에서 소실될 수 있기 때문에 회수율 시험을 통해 분석법의 적합성을 검증해야 한다(Linsinger, 2008). 회수율 시험은 일반적으로 매질에 농약 표준물질을 일정 농도로 처리하여 분석한 후 처리량 대비 회수량으로 산출하는데 이때 표준용액을 제조하는 과정에서 불확실성이 발생할 수 있다. 또한 인증표준물질의 인증값 대비 측정값으로 회수율을 산출할 수 있으며, 측정값을 도출하는 과정에서도 불확실성이 발생하게 된다(Zilli, 2013). 분석화학에서 70-110% 범위의 회수율을 유효한 것으로 판단하고 있으며, 잔류농약분석에서도 처리한 농도에 따라 다르지만 일반적으로 70-120% 범위의 회수율을 보이는 경우 분석법은 적합하다고 판단하고 있다(European Commission, 2019; FAO, 2002; Hund et al., 2001). 대부분의 농약 잔류량 산출식에는 회수율 결과를 보정하지 않기 때문에 이 결과에 대한 불확도 추정은 현재까지는 고려대상이 아니다(von Holst et al., 2002). 하지만 최근 국제기구에서 회수율 결과를 잔류량 산출에 보정하는 것을 논의하고 있으며, 회수율 시험 결과의 합리적인 불확도 추정과 요인을 선별하기 위해 회수율 결과를 잔류량 산출에 보정하는 것이 필요하다고 판단된다(Linsinger, 2008).

회수율 시험은 일반적으로 A형 표준불확도 평가로 산출할 수 있지만 EURACHEM은 측정된 회수율에 대해 비례적 편향을 통계적으로 유의성을 식(12)을 통해 통계적으로 검증할 것을 제안한다. EURACHEM 및 일부 문헌들은 측정된 회수율이 1(또는 100%)과 유의성 있게 차이가 있는지에 대해 t검정을 통해 확인해야 한다고 제안하였다(식 12).

t=1-R¯muR¯mtcrit:n-1(식 12) 

R¯m은 농약 표준물질을 처리하여 분석한 회수율의 평균값이며, uR¯m는 반복성에 대한 표준불확도이다. t는 95% 신뢰수준에서 자유도(n-1)에 대한 임계치(2-tail critical value)와 t-분포표를 참고하여 비교할 수 있으며, 보정계수1/R¯m를 모델식에 적용하여 산출한다. Maroto et al. (2001)Barwick and Ellison (1999)식(12)에서 산출된 t 값이 임계값보다 같거나 작다면 회수율 결과를 측정값에 보정 할 필요 없다고 보고하였다.

EURACHEM은 회수율의 t검정까지 제안하는 반면, 일부 문헌들에서 t값이 임계치와 유의한 차이(t값이 임계치보다 크거나 같음)가 발생될 때 아래의 식 (13-14)로 불확도를 산출해야 한다고 제안한다(Hund et al., 2001; von Holst et al., 2002; Linsinger, 2008).

R¯m=C¯obsCspike(식 13) 
uR¯m=R¯m×sobs2n×C¯obs2+UCspikeCspike2(식 14) 

C¯obs는 처리한 농약을 측정한 값의 평균 농도, Cspike는 처리한 농약의 농도, sobsC¯obs의 표준편차 그리고 u(Cspike)는 처리한 표준물질의 표준불확도이다. Linsinger (2008)Barwick and Ellison (1999)는 위의 식(14)을 기반으로 인증표준물질 및 매질 효과 등 다양한 상황과 매개변수에 의한 정보로 불확도를 추정하는 방법을 보고하였다. 식 (14)의 경우, 인증표준물질을 사용하면 수월하게 불확도를 산출될 수 있으나 분석자가 직접 표준물질을 처리하는 회수율은 처리 농도로 제조하는 과정의 불확도까지 산출되어야 하는데 이는 많은 시간과 비용이 소모된다. 한편, 일부 문헌들에서 상향식 접근의 측정불확도를 추정할 때 회수율 t-검정을 하지 않고 단순히 A형 표준불확도로 평가 후 확장불확도에 반영하는 방법을 사용할 수 있다. 특히 다성분동시분석과 같이 적용해야 하는 불확도가 많은 경우 복잡한 t-검정을 생략하기도 한다. Jiménez and Pastor (2012)는 침전물(segiment)에 유기염소계 농약을 포함한 유기화합물 39종을 동시분석하는 과정에서 회수율에 대한 불확도를 A형 표준불확도로 산출한 후 상대표준불확도로 변환된 값을 사용하여 측정하였다. 공식화된 회수율의 불확도 산출방법이 없고 상향식 접근은 다른 고려해야할 매개변수가 많기 때문에 인증표준물질이 아닌 표준물질로 회수율의 불확도를 산출하는 경우 EURACHEM에서 제시한 검정방법으로 검정 후 유의성이 발생한 경우에만 A형 표준불확도를 산출하여 확장불확도에 적용하는 방법이 가장 이상적이라고 사료된다.

검량선

검량선은 기기분석에서 정량적 측정을 하기 위해 대상 물질의 농도(x)에 대해 얻은 반응값(y)이 회귀식을 통해 선형으로 시각화한 것을 의미한다. 잔류농약분석을 포함한 대부분의 기기분석에서 선형회귀식(최소제곱법)이 사용되고 그 밖에 능선 회귀, 주성분 회귀 등이 사용된다(Reis and Saraiva, 2005). 검량선의 불확도는 측정된 분석 대상 물질의 반응값이 x와 y로 구성된 직선에 있지 않는 것, 즉 잔차에 대한 요인으로 간주할 수 있다(Mashkina and Oldham, 2015). EURACHEM에서는 검량선의 불확도는 y에 대한 우연적 오차로 발생되며 y로부터 발생되는 불확도의 추정 방법을 제시하였으며(EURACHEM, 2000), 검량선의 불확도를 산출하는 방법을 아래 식(15-18)에 나타내었다.

uC0=SB1×1p+1n+C0-C¯2Sxx(식 15) 
Ai=ciB1+B0+ei(식 16) 
S=j=1nAj-B0+B1Cj2n-2(식 17) 
Sxx=j=1nCj-C¯2(식 18) 
  • B1 : 기울기
  • B0 : 절편
  • p : 1개 시료당 분석 횟수
  • n : 전체 측정 횟수
  • C0 : 시료농도의 측정값
  • C : 표준용액 평균농도
  • S : 잔차의 표준편차
  • Sxx : 표준편차 제곱의 합(표준물질 입력량들의 변동값)
크로마토그래피

크로마토그래피는 잔류농약의 농도를 직접적으로 결정하는 중요한 요인이다. Barwick (1999)는 크로마토그래피의 불확도 요인을 주입방법 및 검출기의 종류 같은 하드웨어뿐만 아니라 머무름 시간, 피크 면적 및 높이 등 획득된 결과까지 불확도 요인이 될 수 있다고 주장하였으며, 기체크로마토그래피(gas chromatography, GC) 및 액체크로마토그래피(high performance liquid chlromatography, HPLC)에 따라 세분화된 불확도 요인을 제시하였다(Barwick, 1999). 또한 Soboleva et al. (2004)는 잔류농약 다성분동시분석에서 GC 및 HPLC의 주요 불확도 요인은 매트릭스 효과 및 분석 물질의 대사이며, 크로마토그래피의 불확도 평가는 검량선과 분석 표준물질의 불확도를 같이 합성해야 한다고 제안했다(Soboleva et al., 2004). 그러나 EURACHEM은 상향식 접근 방식에서 크로마토그래피를 측정불확도 요인으로 포함하지 않았는데 이는 직선성 또는 회수율을 통해 충분히 불확도 요인이 고려되었기 때문인 것으로 판단되었다. 일부 문헌들 중 회수율 측정불확도 결과를 반영하지 않거나 또는 하향식 접근방식을 통한 분석법 검증에서 대상 물질의 반복된 측정값을 크로마토그래피의 측정불확도 추정에 사용하고 있다(Walorczyk, 2014).


측정불확도 추정 예시

본 항목은 예시를 통해 잔류농약분석에서 측정불확도 추정방법을 쉽게 응용할 수 있도록 기술하고자 하였다. 이 예시는 가상의 시나리오를 설정하고 그에 따라 상세한 추정 절차를 기술하였으며, MRL 준수여부를 측정하는 것으로 설정하였다. 또한 시료의 대상 작물은 대두이고 alpha-endosulfan이 검출된 것으로 설정하였으며, 이에 따라 샘플링은 불확도 요인으로 포함시키기 않았다. 측정불확도 추정은 식품공전 잔류농약분석법에 제시된 유기염소계 농약 분석법과 회수율 시험 결과를 이용하여 불확도를 산출하였다. 분석 절차에서 측정기구(부피 및 저울), 표준물질, 회수율 및 검량선을 불확도 요인으로 추출하였으며, 수학적 모델식에 따른 어골도 표현방법, 측정 잔류량에 대한 불확도 표현 및 불확도 기여량에 대한 활용도 기술하였다. 각각의 매개 변수의 입력값들은 불확도 산출을 위해 임의로 설정하였다.

측정모델 및 어골도

잔류량을 산출식은 Jiménez and Pastor (2012)에 제시된 식(19)를 사용하였다.

CONCng/g=OCPsmg/L×VmLWg×Rec×1000(식 19) 

CONCng/g은 잔류량이며, OCPsmg/L는 검량선을 통해 계산된 농약의 농도, VmL은 최종 용매의 부피, Wg는 시료무게, Rec은 회수율을 의미한다. 식품공전 잔류농약분석법 실무해설서의 분석절차는 Fig. 4에 제시하였으며, 불확도 요인을 시료무게, 추출용매의 부피, 회수율, 표준물질조제 및 검량선으로 선별하였으며 이를 어골도로 표현하여 Fig. 5에 제시하였다.


Fig. 4. 
Procedures for the analysis of organochlorine pesticides presented in Food Code.


Fig. 5. 
Fish bone diagram for obtaining uncertainty factors during residual analysis of alpha-endosulfan.

시료 처리의 불확도

시료 처리에 대한 측정불확도는 시료 무게를 측정하는 저울과 추출 용매를 가하는 측정기구를 매개변수로 삼고 각각의 표준불확도를 평가한다. 시료 무게의 측정불확도(u(Sweight))는 저울의 불확도(u(blancex))이며, 저울의 불확도는 교정성적서, 분해능 및 반복성을 표준불확도로 합성하여 산출하는 데 저울 교정성적서의 확장불확도가 0.0001 g (신뢰수준 약 95%, k = 2)이면 교정성적서에 대한 표준불확도(u(blancecal))는 포함인자(k)로 나누어 0.00005 g이 된다. 또한 저울 제조사에서 제시하는 분해능이 0.0001 g 일 때, 분해능의 표준불확도(u(blanceres))는 식(3)을 적용하여 산출한다. 반복성에 따른 표준불확도(u(blancerep))는 표준 분동을 이용할 수 있는데 예를 들어 10 g의 표준분동을 10회 반복 측정하였다면 그에 따라 얻게 된 측정값의 평균 및 표준편차를 이용하여 식(2)에 적용하여 산출하였으며, Table 1에 측정값 예시를 제시하였다. 또한 Table 1에 칭량에 대한 자유도와 표준 불확도를 제시하였다. 3가지 요인의 표준불확도를 불확도 전파의 법칙에 따라 합성하여 시료 무게에 대한 합성표준불확도(uc(Sweight))를 식(20)과 같이 산출할 수 있다.

ucSweight=ubalancecal2+ublanceres2+ublancerep2(식 20) 
Table 1. 
The mean and standard deviation of the weight measured 10 times using 10 g of count weight, and the resulting degree of freedom and standard uncertainty
No. Measuring value (g) Degree of freedom Standard uncertainty
Individual Mean ± SD
1 10.00005 10.000014 ± 2.67E-05 9 8.45E-06
2 10.00004
3 10.00001
4 9.99998
5 10.00002
6 10.00000
7 9.99997
8 10.00003
9 10.00004
10 10.00000

산출된 합성표준불확도는 추후 다른 매개변수와 합성되기 위해 상대표준불확도로 변환해주며 상대표준불확도(ur(Sweight))는 시료의 측정된 무게로 나눔으로써 산출할 수 있다. 측정된 시료의 무게가 25.0021 g이라면 합성표준불확도인 0.0000768 g로 나누고 단위가 제거되어 0.00000307이 된다. 그 다음 유효자유도를 산출하는데 유효자유도는 각각의 표준불확도의 자유도를 식(8)에 적용함으로써 산출한다. 저울의 교정 및 분해능 표준불확도의 경우 100% 신뢰한다고 가정하기 때문에 무한대(∞)이며, 표준분동으로 측정한 반복성의 불확도의 자유도는 n-1이기 때문에 9가 된다. 따라서 식(21)과 같이 계산되며 위의 과정에서 산출된 표준불확도, 합성표준불확도 및 상대표준불확도를 Table 2에 요약하였다.

Table 2. 
A summary of various uncertainty factor estimated from organochlorine pesticide analysis procedure
OCPs uncertainty factor Uncertainty expression Standard uncertainty Degree of freedom Effective degree of freedom Combined uncertainty Related standard uncertainty Related combined standard uncertainty (uc(OCPCONC α-endosulfan)) Effective degree of freedom (Veff(OCPCONC α-endosulfan)) Expend uncertainty (U)
Weight of sample
(u(Sweight)
Calibration
(u(balancecal)
0.00005 g 56 0.0000768 0.00000307 0.0671 mg/kg 8 0.155 mg/kg
Resolution
(u(balanceres)
0.0000577 g
Repeatability
(u(balancerep)
0.00000845 g 9
Volume for extract solvent
(u(Svolume))
Tolerance
(u(volumetol)
0.122 9.0 × 1014 - 0.00395
Repeatability
(u(volumerep)
0.000124
Temperature
(u(volumetemp)
0.375 9
Recovery u(rec) 1.386 2 - 0.0149
Standard solution
(u(STDconcentration range))
u(STD1.0.-9.0 ug/mL) - 15 - 0.0259
Calibration curve
u(Cal Curve)
u(Cal Curve1.0.-9.0 ug/mL) 0.165 7 - 0.0647

부피의 표준불확도(u(Svolume))는 측정기구에 대한 측정불확도이며, 측정기구의 불확도 요인으로 기구 제조사에서 제시한 허용차(tolerance), 교정성적서, 반복성 및 온도가 적용된다(Jiménez and Pastor, 2012). 유기염소계 농약의 시료처리에서 다양한 유기용매가 사용되지만 본 항목에서 100 mL의 매스실린더로 acetone을 가하는 과정만 불확도 요인으로 선정하였고 그에 따른 허용차(u(volumetol), 반복성(u(volumerep) 및 온도(u(volumetemp)의 표준불확도를 산출하는 과정을 Table 2에 제시하였다. 먼저, 허용차의 표준불확도는 매스실린더에 인쇄된 허용차가 100±0.3mL이라면, 이는 B형 표준불확도 중 삼각형분포인 식(4) a에 0.3을 대입하여 계산한다. 또한 부피의 반복성에 대한 표준불확도는 증류수로 부피 기구의 공칭 부피까지 채워 무게를 측정한 후 부피로 환산하여 얻는 표준편차를 이용하는데 Table 3에 이에 대한 임의 값을 나타내었고 식(2)에 대입하여 산출한 값을 Table 2에 나타내었다. 온도의 표준불확도는 측정기구의 용량, 실험실 온도차, 부피팽창계수를 이용하여 산출할 수 있다. 여기서 부피는 100mL, 실험실의 온도범위 23 ± 5oC, 부피팽창계수는 γ ≈1 × 10-3K-1을 적용하며, 이 3가지 정보를 직사각형 분포로 식(3)에 대입하고 계산 과정은 아래 식(21)와 같다(Jiménez and Pastor, 2012). 부피의 합성표준불확도, 상대표준불확도 및 유효자유도는 시료 무게의 산출 방식과 동일하게 산출되었고 이를 Table 2에 요약하였다.

ucvolumetemp=100×5×0.00133=0.375mL(식 21) 
Table 3. 
The value obtained by converting the measured weight into volume after filling distilled water to the nominal volume to evaluate the uncertainty of a volumetric apparatus
No. Measuring
value (g)
Volume of distilled water
converted from weight (mL)
Mean ±SD Degree
of freedom
Standard
uncertainty
1 100.00055 100.29713 100.29671 ±0.0003945 9 0.0001248
2 99.99966 100.29624
3 100.00039 100.29697
4 99.99981 100.29639
5 100.00044 100.29702
6 99.99969 100.29627
7 100.00074 100.29732
8 99.9998 100.29638
9 100.00029 100.29687
10 99.99996 100.29654

회수율의 불확도

회수율은 식품공전 잔류농약분석법 실무해설서에 제공된 대두의 alpha-endosulfan의 회수율 결과를 활용하였다. alpha-Endosulfan의 처리농도가 0.25 mg/kg일 때 회수율은 92.7 ± 2.4%, 반복수는 3이며 이를 기반으로 회수율에 대한 표준불확도는 1.386%이었으며, Table 2에 결과를 제시하였다. 회수율에 표준불확도를 식(12)에 대입하고 회수율의 t-검정하면, 계산된 t값은 5.268이고 t분포표에서 자유도 2일 때 95% 신뢰 수준의 임계값은 4.303로 이 두 값은 유의적으로 다르다. 따라서, t값이 임계값보다 크므로 계산된 회수율은 1(또는 100%)로 볼 수 없고 불확도 요인으로 간주해야 한다. 일부 문헌들은 식(14)를 통해 회수율의 불확도를 산출하도록 제안하지만 본 예시에서는 Jiménez and Pastor (2012)에 의해 제시된 회수율의 표준불확도 산출방법을 활용하였다. 이들은 반복성의 A형 표준불확도 산출 후 회수율의 평균값으로 나누는 상대표준불확도를 산출하여 적용하는 방법을 선택하였다. 이에 따라 본 예시에 회수율의 표준불확도과 상대표준불확도를 동일하게 산출하여 Table 2에 나타내었고 다른 매개변수의 불확도와 합성하였다.

표준용액의 불확도

표준용액의 불확도(u(STDconcentration range)는 정량에 사용되는 검량선 표준용액의 농도에 대한 불확도(u(STD1.0-9.0 ug/mL)이며, 이 불확도에는 표준물질의 순도 및 희석 과정에 필요한 측정기구의 불확도까지 포함된다. 본 예시의 대상농약인 alpha-endosulfan은 표준물질을 이용하여 1,000ug/mL의 stock solution으로 제조하고 이를 희석하여 100 ug/mL의 working solution으로 제조한다. 이 후 검량선 작성을 위해 1, 5, 9 ug/mL의 표준용액으로 희석하는 과정에서의 표준불확도, 합성표준불확도, 상대표준불확도 및 유효자유도의 산출 방법을 제시하였으며, 이 과정을 Table 4에 나타내었다. 또한 제조 과정에 사용되는 피펫, 부피플라스크 및 저울 같은 측정기구의 표준불확도 산출에 필요한 정보들은 임의로 지정하여 Table 5에 나타내었고 모든 표준불확도는 상대표준불확도로 변환하여 합성하였다.

Table 4. 
Summary of the process of calculating the uncertainty of the standard solution for preparing a calibration curve
Procedure Uncertainty
factor
Standard
uncertainty
Related standard
uncertainty
Combined
uncertainty
Effective degree of
freedom
Step 1.
Uncertainty in the preparation of
1,000 mg/L standard solution
Purity 0.00462% 0.00466 0.0230 Approximately 10
Balance 0.00221 g 0.0221
Flask 0.422 mL 0.00422
Step 2.
Uncertainty in the preparation of
100 mg/L standard solution
Pipette 0.0731 mL 0.00731 0.0245 Approximately 12
Step 3.
Uncertainty in the preparation of
standard solution for calibration
Pipette 0.0365 mL 0.00731 0.0259 Approximately 15
Flask 0.211 mL 0.00422

Table 5. 
Parameters of apparatus arbitrarily assumed to calculate the uncertainty associated with the preparation of standard solutions for calibration curves
Parameters Calibration Tolerance Temperature Standard deviation
of repeatability
Purity - 99.2 ±0. 8% (0.008)* - -
Pipette
5 mL - ±0.05 0.00021 0.0003a)
10 mL - ±0.1 0.00021 0.0002a)
Volumetric flask
50 mL - ±0.5 0.00021 0.004a)
100 mL - ±1.0 0.00021 0.007a)
Balance 0.000 1 (95%, k=2) 0.0001 (resolution) - 0.000003b)
a) is the assumption that the repeatability of the device was measured using distilled water.
b) is the assumption that the repeatability of the balance was measured using a 0.1 g standard weight.

검량선을 위한 표준용액의 불확도(u(STD1.0-9.0 ug/mL) 산출 과정의 첫번째 단계는 표준물질 0.1 g을 취해 100mL 부피 플라스크에 넣어 1,000 ug/mL의 alpha-endosulfan 표준용액을 제조하는 과정에서 합성표준불확도(uc(STD1000 ug/mL)) 산출이며, 표준물질의 순도에 대한 허용차(u(STDpurity)), 저울(u(STDbalance)) 및 100mL 부피플라스크(u(STD100 mL flask))의 표준불확도가 상대표준불확도로 합성되었다. 두번째 단계는 100 ug/mL 표준용액 제조에 대한 불확도 산출과정이다. 100 ug/mL 표준용액은 1,000 ug/mL 표준용액을 10배 희석하여 제조되기 때문에 상위 농도의 상대합성표준불확도(uc(STD1000 ug/mL))를 포함하며 피펫과 부피플라스크가 사용됨에 따라 측정기구의 상대표준불확도인 ur(STD10 mL pippette) 및 ur(STD100 mL flask)와 함께 합성하여 100 ug/mL 표준용액의 상대합성표준불확도(uc(STD10 ug/mL))를 산출하였다. 세 번째 단계는 검량선에 직접적으로 사용되는 농도의 불확도를 산출하는 과정이다. 일반적으로 검량선의 농도에 따라 개별적인 합성불확도를 산출하고 이를 상대합성표준불확도로 합성하지만 본 예시에는 하나의 농도만 최종 적인 표준용액의 상대합성표준불확도(uc(STD1.0-9.0 ug/mL))로 가정하고 사용하였다. 이 산출된 불확도를 다른 시료처리 과정의 불확도와 합성하였다.

검량선의 불확도

검량선의 표준불확도는 제조된 표준용액의 측정값을 회귀분석하여 얻을 수 있으며, SAS, SPSS 및 Excel 같은 통계 프로그램을 활용하여 식(16-18)의 파라미터들을 수월하게 도출할 수 있다. alpha-endosulfan의 검량선 표준용액을 3반복 측정하여 얻은 값들과 그에 따라 회귀분석으로 얻은 파라미터는 Table 6에 제시하였다. 또한 검량선의 표준불확도를 산출하기 위해서는 기기상의 대상물질 농도가 포함되는데 여기에서의 농도는 2.55mg/L로 가정하여 표준불확도와 상대표준불확도를 산출한 결과 각각 0.165와 0.0647였으며, Table 2에 제시하였다.

Table 6. 
Summary of parameters for calculating the response values and standard uncertainty of the calibration curve according to the concentration of the standard solution measured for linear regression
STD number Concentration (ug/mL) Response value (area)
STD 1 1 28
1 29
1 29
STD 2 5 135
5 131
5 133
STD 3 9 215
9 230
9 216
Parameter input value
Average concentration of standard solution (C) 5
Number of observations (n) 9
Degree of freedom 7
Residue standard deviation or standard error (S) 6.4789
Variation value of input quantities of standard solution (Sxx) 96
Coefficient of determination (r2) 0.994696
Slope (B1) 23.95833
Intercept (B0) 7.541667
Determined pesticide concentration of the leached solution (C0) 2.65a) + 0.315b) (n=5c)
a) is the average value of the concentration of residual pesticide detected in the sample (soy bean), b) is the standard deviation, and c is the number of repetitions (assumed as endosulfan here).

불확도의 기여량

잔류농약 분석 과정에서 불확도 요인인 무게, 추출 용매의 부피, 회수율, 표준물질 및 검량선의 상대합성표준불확도를 불확도 전파 법칙에 따라 재합성하여 최종 합성불확도(uc(OCPCONC α-endosulfan))를 산출하였으며, 이를 Table 2에 나타내었다. 또한 Fig. 6에 각각 매개변수의 상대표준편차를 비교하여 측정불확도 기여량을 나타내었다. 본 예시에서 산출한 측정불확도는 임의값이지만 각각의 기여량을 살펴보면, 검량선, 표준용액 및 회수율 순으로 불확도가 높게 나타내었다. 검량선의 불확도는 직선성의 결정계수가 “1”이 될 수록 감소하며, 표준용액의 경우 희석단계를 줄이고 저울 및 부피 측정기구를 교정하여 불확도를 줄일 수 있다(Pindado Jiménez and Pérez Pastor, 2012). 또한 회수율은 반복수를 늘리고 반복에 따른 평균의 표준편차를 줄여 불확도를 감소시킬 수 있다. 본 총설에서 판별한 불확도 요인뿐만 아니라 실험과정에 포함되는 매개변수(희석배수, 정제, 분석법 검증 등) 요인을 확대하고 그에 따른 측정불확도를 추정함으로써 기여량을 산출하면 이는 실험실 내부정도관리 체계를 고도화 및 분석 역량을 향상시키는 수단이 될 수 있다.


Fig. 6. 
Contribution of measurement uncertainty by factors in residual analysis of alpha-endosulfan.

확장 불확도

최종 산출된 상대합성표준불확도(uc(OCPCONC α-endosulfan)), 유효자유도(Veff(OCPCONC α-endosulfan)) 및 확장불확도(U)는 Table 2에 제시하였다. 단위가 없는 합성불확도에 잔류량과 동일한 단위를 부여할 수 있도록 잔류량과 곱함으로써 단위를 부여하였으며, 식(19)를 이용하여 산출한 대두 중 alpha-endosulfan의 잔류량은 0.945mg/kg이었다. 합성표준불확도를 95% 신뢰수준으로 확장하기 위해 t-분포표의 유효자유도 8일 때 포함인자인 2.306을 곱하여 확장불확도를 산출하였다. 이렇게 산출된 확장불확도를 잔류량과 함께 표현하면 대두 중 alpha-endosulfan의 잔류량은 0.945 ± 0.155 mg/kg(95% 신뢰수준, k = 2.306)이다. 이러한 결과는 분석과정의 불확도 요인을 추청하여 이 결과를 분석결과에 반영한다면 대두 중 alpha-endosulfan의 잔류량이 MRL (1.0 mg/kg)을 초과할 수도 초과하지 않을 수도 있는 것을 보여주는 것이다.

유럽 가이드 SANTE / 12682 / 2019 “식품 및 사료의 잔류 농약 분석을 위한 분석 품질 관리 및 방법 검증 절차”에서는 농식품 잔류농약분석에 대한 실험실들의 상대표준편차가 20-25%로 추정되며 이를 기반으로 일괄적으로 50%의 확장불확도를 적용하여 잔류량에 적용하도록 요구하고 있다. 예를 들어 MRL이 0.1mg/kg이고 잔류량이 0.078mg/kg인 경우 확장불확도는 ±0.039 mg/kg로 추정하고 잔류량에서 불확도를 고려한 최대값은 0.117mg/kg으로 MRL을 초과하게 된다. 아직까지 힙ÇX국내는 하향식 측정불확도를 적용하는 자세한 지침과 활용 가능한 참고자료가 부족하지만 상향식 측정불확도를 적용하여 자체 정도관리를 평가하고 추후 MRL 준수 여부까지 적용한다면 농식품의 안정성 확보에 도움이 될 것으로 사료된다.


결 론

측정불확도 추정은 분석결과의 신뢰성을 입증하는 수단이며, 이미 국제 인증실험실에서는 이미 필수사항으로 요구되고 있다. 또한 전반적인 실험과정에 대한 불확도 요인을 파악하여 측정결과에 영향을 미치는 불확실성을 줄이는 것은 정도관리를 통한 분석역량 향상을 위해서도 필요하다고 판단된다. 잔류농약 분석은 목적 및 인정 범위에 따라 역할이 다르며, 그에 따라 실험 절차 또한 다양하다. 최근 비교적 전처리 과정이 간소화 된 QuEChERS법 활용이 증가하면서 불확도 요인도 감소된 것으로 보여질 수 있으나 강화된 MRL을 고려하면 여전히 측정불확도의 추정은 필요하다고 판단된다. 하향식 방법은 인증표준물질 또는 숙련도 시험결과 등 여러 실험실의 분석 결과만 있다면 쉽게 불확도 요인을 추정할 수 있다는 장점이 있지만 국내 잔류농약 분석 분야에 적용하기에 아직까지 한계가 있다. 반면에 상향식 방식은 전 실험과정의 불확도 요인을 판별하고 확장불확도를 추정하기 때문에 그 과정이 복잡하지만 분석과정에서 발생하는 대부분의 불확도 요인에 대한 불확도를 추정하기 때문에 분석결과에 대한 오차를 저감할 수 있는 대안이 될 수 있다. 또한 EURACHEM에서도 상향식 방식에 하향식 방식을 적용한 하이브리드형 접근 방식을 제안하고 있다. 잔류농약 분석은 극미량을 정량하는 분석화학이며, 잔류허용기준이 존재하기 때문에 미미한 분석 오류도 분석결과에 크게 영향을 미칠 우려가 있다. 따라서 이 총설에서 제안한 측정 불확도 산출방법을 이용하여 분석결과에 적용한다면 분석 오류를 저감할 수 있으며, 이로 인해 국내 잔류농약에 대한 안전성 조사 결과의 신뢰성은 더욱 확보될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 제안한 측정불확도 추정 방법을 더욱 고도화하여 한국형 잔류농약 분석 분야의 측정불확도 추정법을 확립해야 한다고 판단되었다.


Acknowledgments

본 연구는 2021년도 농촌진흥청 국립농업과학원 전문연구원 과정 지원사업에 의해 이루어진 것임. 본 성과물은 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ1594402)의 지원에 의해 이루어진 것임.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.


References
1. Alder L, Korth W, Patey AL, van der Schee HA, Schoeneweiss S, 2001. Estimation of measurement uncertainty in pesticide residue analysis. J AOAC Int. 84(5):1569-1578.
2. Ambrus A, Soboleva E, 2004. Contribution of sampling to the variability of pesticide residue data. J AOAC Int. 87(6):1368-1379.
3. Ambrus A, 2009. Estimation of sampling uncertainty for determination of pesticide residues in plant commodities. J Envir Sci Health B. 44(7):627-639.
4. Anastassiades M, Lehotay SJ, Štajnbaher D, Schenck FJ, 2003. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce. J AOAC Int. 86(2):412-431.
5. Barwick VJ, Ellison SL, 1999. Measurement uncertainty: approaches to the evaluation of uncertainties associated with recovery. Analyst. 124(7):981-990.
6. Barwick VJ, 1999. Sources of uncertainty in gas chromatography and high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 849(1):13-33.
7. Codex Committee on Pesticide Residues (CCPR), 2004. Estimation of Uncertainty of Measurements and Confirmation of Results, Codex alimentarius commisssion. Vienna, Austria.
8. Cervera MI, Portolés T, Pitarch E, Beltrán J, Hernández F, 2012. Application of gas chromatography time-of-flight mass spectrometry for target and non-target analysis of pesticide residues in fruits and vegetables. J Chromatogr A. 1244:168-177.
9. Chang HR, You JS, Do JA, 2018. Residue dissipation patterns of neonicotinoid acetamiprid and thiamethoxam in Swiss chard for the harvest periods under greenhouse conditions. Korean J Environ Agric. 37(2):97-103.
10. Cuadros-Rodrıguez L, Torres MH, López EA, González FE, Liébanas FA, et al., 2002. Assessment of uncertainty in pesticide multiresidue analytical methods: main sources and estimation. Anal Chim Acta. 454(2):297-314.
11. Desimoni E, Brunetti B, 2011. Uncertainty of measurement and conformity assessment: a review. Anal Bioanal Chem. 400(6):1729-1741.
12. EURACHEM, 2000. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurements-2nd ed, Laboratory of the Government Chemist. London, U.K.
13. EURACHEM, 2019. Measurement uncertainty arising from sampling-2nd ed. London, U.K.
14. EUROLAB, 2007. Technical Report-Measurement Uncertainty Revisted: Alternative Approaches to Uncertainty Evaluation, European Federation of National Associations of Measurement, Paris, France.
15. European Commission, 2017. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed. SANTE/11813/2017.
16. European Commission, 2019. Analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed, SANTE/12682/2019.
17. FAO, 2002. Submission and evaluation of pesticide residues data for the estimation of Maximum Residue Levels in food and feed, Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome.
18. Farrance I, Frenkel R, 2012. Uncertainty of Measurement: A Review of the Rules for Calculating Uncertainty Components through Functional Relationships. Clin Biochem Rev. 33(2):49-75.
19. Glaeser H, 2002. Compliance with legal requirements: definition of limits, sampling and measurement uncertainty. Accred Qual Assur. 7(10):388-391.
20. Hibbert DB, 2006. The uncertainty of a result from a linear calibration. Analyst, 131(12):1273-1278.
21. Hill ARC, 2000. Residue variability and sampling-practical problems and consequences for residues monitoring. Food Addit and Contam A. 17(7):539-546.
22. Hund E, Massart DL, Smeyers-Verbeke J, 2001. Operational definitions of uncertainty. Trends Analyt Chem. 20(8):394-406.
23. International Standard Organization (ISO), 2003. ISO 11648-1:Statistical aspects of sampling from bulk materials-part 1: general principles. Geneva, Switzerland.
24. International Standard Organization (ISO), 2017. ISO/IEC 17025:General requirements for the competence of testing and calibration laboratories, Geneva, Switzerland.
25. International Standard Organization (ISO), 2008. ISO/IEC GUIDE 98-3:Uncertainty of measurement-Part 3: Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM:1995), Geneva, Switzerland.
26. International Standard Organization (ISO), 2007. ISO/IEC Guide 99:International vocabulary of metrology-Basic and general concepts and associated terms (VIM), Geneva, Switzerland.
27. Lee JH, Choi JH, Youn JS, Cha YJ, Song W, et al., 2015. Comparison between bottom-up and top-down approaches in the estimation of measurement uncertainty. Clin Chem Lab Med. 53(7):1025-1032.
28. Lee S, Choi H, Kim E, Choi H, Chung H, et al., 2010. Estimation of the measurement uncertainty by the bottom-up approach for the determination of methamphetamine and amphetamine in urine. J Anal Toxicol. 34(4):222-228.
29. Lehotay SJ, 2011. QuEChERS sample preparation approach for mass spectrometric analysis of pesticide residues in foods. Methods Mol Biol. 747:65-91.
30. Lombard B, 2006. Estimation of measurement uncertainty in food microbiology: the ISO approach. Accredit Qual Assur. 11(1):94-100.
31. Linsinger TP, 2008. Use of recovery and bias information in analytical chemistry and estimation of its uncertainty contribution. Trends Analyt Chem. 27(10):916-923.
32. Ma YC, Wang CW, Hung SH, Chang YZ, Liu CR, et al., 2012. Estimation of the measurement uncertainty in quantitative determination of ketamine and norketamine in urine using a one-point calibration method. J Anal Toxicol. 36(7):515-522.
33. Magnusson B, Ossowicki H, Rienitz O, Theodorsson E, 2012. Routine internal- and external-quality control data in clinical laboratories for estimating measurement and diagnostic uncertainty using GUM principles. Scand J Clin Lab Invest. 72(3):212-220.
34. Maroto A, Boqué R, Riu J, Rius FX, 2001. Measurement uncertainty in analytical methods in which trueness is assessed from recovery assays. Anal Chim Acta. 440(2):171-184.
35. Martinello F, Snoj N, Skitek M, Jerin A, 2020. The top-down approach to measurement uncertainty: which formula should we use in laboratory medicine?. Biochem Med (Zagreb). 30(2):187-195.
36. Mashkina E, Oldham KB, 2015. Linear regressions to which the standard formulas do not apply. ChemTexts. 1(2):11.
37. Medina-Pastor P, Valverde A, Pihlstrom T, Masselter S, Gamon M, et al., 2011. Comparative study of the main top-down approaches for the estimation of measurement uncertainty in multiresidue analysis of pesticides in fruits and vegetables. J Agric Food Chem. 59(14):7609-7619.
38. Meyer VR, 2007. Measurement uncertainty. J Chromatogr A. 1158(1-2):15-24.
39. Mol HG, van der Kamp H, van der Weg G, van der Lee M, Punt A, et al., 2011. Validation of automated library-based qualitative screening of pesticides by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry. J AOAC Int. 94(6):1722-1740.
40. Narenderan ST, Meyyanthan SN, Babu B, 2020. Review of pesticide residue analysis in fruits and vegetable. Pre-treatment, extraction and detection techniques. Food Res Int. 133:109141.
41. Omeroglu PY, Boyacioglu D, Ambrus Á, Karaali A, Saner S, 2012. An overview on steps of pesticide residue analysis and contribution of the individual steps to the measurement uncertainty. Food Anal Methods. 5(6):1469-1480.
42. Pindado Jiménez O, Pérez Pastor RM, 2012. Estimation of measurement uncertainty of pesticides, polychlorinated biphenyls and polyaromatic hydrocarbons in sediments by using gas chromatography-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 724:20-29.
43. Ramsey MH, Ellison SLR, 2007. Eurachem/EUROLAB/CITAC/Nordtest/AMC guide: measurement uncertainty arising from sampling: a guide to methods and approaches, 1st edn. Eurachem, Prague. http://www.eurachem.org/guides/pdf/UfS_2007.pdf
44. Ratola N, Santos L, Herbert P, Alves A, 2006. Uncertainty associated to the analysis of organochlorine pesticides in water by solid-phase microextraction/gas chromatography-electron capture detection--evaluation using two different approaches. Anal Chim Acta. 573-574:202-208.
45. Reichmuth A, Wunderli S, Weber M, Meyer VR, 2004. The uncertainty of weighing data obtained with electronic analytical balances. Microchimica Acta. 148(3-4):133-141.
46. Reis MS, Saraiva PM, 2005. Integration of data uncertainty in linear regression and process optimization. AIChE J. 51(11):3007-3019.
47. Soboleva E, Ambrus A, Jarju O, 2004. Estimation of uncertainty of analytical results based on multiple peaks. J Chromatogr A. 1029(1-2):161-166.
48. Sundaram, A. (1990). Journal of Environmental Science and Health. Part B, Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes. J Environ Sci Health B. 25(3):309.
49. Stefanelli P, Generali T, Barbini DA, Girolimetti S, Dommarco R, 2013. Uncertainty estimation in the analysis of pesticide residues in olive oil using data from proficiency tests. J Environ Sci Health B. 48(7):523-529.
50. Thompson M, 1998. Uncertainty of sampling in chemical analysis. Accred Qual Assur. 3(3):117-121.
51. van Look G, Meyer VR, 2002. The purity of laboratory chemicals with regard to measurement uncertainty. Analyst. 127(6):825-829.
52. von Holst C, Stroka J, Anklam E, 2002. Correction of analytical results for recovery: a comparison of the method performance characteristics from recent collaborative trials studies for aflatoxin quantification using conventional and robust statistics. Food Addit Contam. 19(8):701-708.
53. Walorczyk S, 2014. Validation and use of a QuEChERS-based gas chromatographic-tandem mass spectrometric method for multiresidue pesticide analysis in blackcurrants including studies of matrix effects and estimation of measurement uncertainty. Talanta. 120:106-113.
54. Zilli M, 2013. A practical guide to the calculation of uncertainty of measurement. Open Toxicol J. 6(1):20-26.
55. Zorzi P, Belli M, Barbizzi S, Menegon S, Deluisa A, 2002. A practical approach to assessment of sampling uncertainty. Accred Qual Assur. 7(5):182-188.

Author Information and Contributions

Won Tae Jeong, Department of Industrial Plant Science & Technology, Chungbuk National University, Postdoctoral researcher, https://orcid.org/0000-0002-6880-3809

Song-Hee Ryu, Residual Agrochemical Assessment Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Researcher, https://orcid.org/0000-0003-0648-0124

Sang Won Park, R&D Cordination Dvision, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Senior Researcher, https://orcid.org/0000-0002-4354-3094

Hyun Ho Noh, Residual Agrochemical Assessment Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Researcher, https://orcid.org/0000-0002-7568-8490

Kee Sung Kyung, Department of Environmental and Biological Chemistry, College of Agriculture, Life and Environment Sciences, Chungbuk National University, Professore

Heung Bin Lim, Department of Industrial Plant Science & Technology, College of Agriculture, Life and Environment Sciences, Chungbuk National University, Professore

Conceptualization, Kee Sung Kyung, Sang Won Park and Song-Hee Ryu

Presentation of methodology, Sang Won Park

Consultation, Kee Sung Kyung and Heung Bin Lim

Writing - Original Draft Preparation, Won Tea Jeong

Writing - Review & Editing, Song-Hee Ryu, Kee Sung Kyung and Hyun Ho Noh