Editorial Board

2020년도 3월 말부터 4월 초 경남 거창, 강원도 정선, 영월 등 7개 지역에서 대나무 소통 트랩을 설치하여 뿔가위벌류를 채집하였다. 뿔가위벌류를 분류한 다음 뿔가위벌(O. pedicornis)의 수컷 고치를 국립농업과학원 양봉생태과에서 5^oC 저장고에 보관한 후 2021년 5월에 25^oC에서 우화시켰다. 섭식독성시험용 개체는 먹이를 24시간 동안 공급하지 않고 시험조건에서 순응시킨 후 사용하였다.

시험에 사용한 약제는 ICP-PR ring test 시험법에서 양성대조군으로 사용한 dimethoate 유제(46%)를 사용하였다(Roessink et al., 2016).

급성 접촉독성 시험용기는 플라스틱 사각케이지(15.4 cm (L) × 10.3 cm (W) × 6.7 cm (H))를 사용하여 10마리씩 한 케이지어 넣어 처리군 당 3개의 용기를 사용하였다. 사각케이지 뚜껑 일부는 환기가 될 수 있도록 망사로 덮었으며(Fig. 1C) 바닥에는 자당용액을 공급할 수 있는 플라스틱 먹이통을 배치하였다. 또한 뿔가위벌류는 특성상 숨을 수 있는 장소를 좋아하기 때문에 필터 종이(110 mm, Advantec, Japan)를 그림과 같이 접어서 숨을 수 있는 공간을 제공하였다(Fig. 1B).

Fig. 1. 
The test supplies and set-up for acute contact toxicity tests: A, individual treatment (application) on the dorsal side of the thorax of solitary bees using the multipette M4 pipette; B, Groups of 10 bees were placed in the test cage with 50% sucrose feeders and a piece of filter paper; C, the overall testing setup.

급성 섭식독성 시험용기는 환기가 되고 세척이 가능한 왕대보호기(밑 지름 2.1cm×윗지름 2.6cm×높이 7.3 cm, 메인양봉원)를 사용하였으며 컵 홀더를 아크릴로 제작한 받침대 위에 부착하였다(Fig. 2A, 2B). 먹이 공급용 갈색 컵(CNE/3, Nicotplast, France)을 컵 홀더에 꽂아 사용하였다(Fig. 2C). 시험 처리군별로 한대의 아크릴 받침대를 사용하였으며 받침대에 시험케이지를 고정할 수 있는 홀더를 40개씩 제작하여 총 40개의 시험케이지를 배치할 수 있도록 하였다(Fig. 2D).

Fig. 2. 
The test supplies and set-up for acute oral toxicity tests: A, a single housing cage and feeding devices (cell cup and cup holder); B, fixation of the cage and cup holder on the plate (40 replicates/plate); C, Individual solitary bee was kept in a single cage with the test solution.; D, the overall testing setup.

시험이 진행되는 동안 실험실 환경은 온도 22 ± 2^oC, 상대습도 60 ± 10%, 명암주기(16 : 8 h)를 유지하였으며 관찰을 위해 조건을 이탈한 시간이 2시간을 넘지 않도록 하였다.

무처리군과 dimethoate 처리양에 따라 5개 처리군을 구성하였으며 처리군 별 벌은 10마리씩 3반복으로 처리하였다. 시험물질인 dimethoate 유제는 증류수로 용해하였으며 최종 처리양이 각각 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 μg a.i./bee가 되도록 하였다. 시험용액의 균등한 도포를 위해 계면활성제 Triton X-100 (Sigma Aldrich, USA)을 사용하였으며 시험 용액 중 함량은 0.1%로 하였다.

뿔가위벌(O. pedicornis) 수컷은 냉장고에서 30분-1시간 정도 보관하여 저온 마취하였으며 냉장고에서 꺼낸 후에도 실험실에서 분쇄된 얼음 위에 벌을 수집한 용기를 배치한 후 벌의 무게를 한 마리씩 측정하였다. 무게 측정 후 W 형태로 접은 종이 사이에 벌 등쪽이 보이도록 한 마리씩 배치하였다(Fig. 1A). 정량적인 약제처리를 위해 multipette M4 pipette (Eppendorf, Germany)를 사용하였으며 처리군 별로 2 μL씩 등쪽 흉부(thorax)에 약제를 고르게 도포하였다(Roessink et al., 2016). 약제를 처리한 후, 벌을 시험용기에 10마리씩 옮겨 50% 자당용액을 자유롭게 공급하였다. 이후 최소 48시간 또는 최대 96시간 동안 치사개체 및 이상증상을 관찰하였다.

무처리군과 dimethoate 처리양에 따라 5개 처리군을 구성하였으며 각 처리군은 뿔가위벌 1마리씩 30반복하였다. 시험물질인 dimethoate 유제는 증류수로 용해하였으며 최종 처리양이 각각 0.017, 0.05, 0.15, 0.45, 1.35 μg a.i./bee가 되도록 하였다. 급성 섭식독성시험은 제공된 시험용액을 충분히 섭취하지 않은 개체군(non-feeder)을 시험에서 제외하여야 하기 때문에 시험물질 공급시 뿔가위벌을 처리군 당 1마리씩 40반복으로 시험하였다. 섭식 노출 전 후 시험물질을 포함한 먹이 용기의 무게를 측정하여 시험용액 섭취량이 전체 평균 섭취량의 80% 미만인 경우 non-feeder로 정의하였다. 접촉 독성시험법과 마찬가지로 뿔가위벌 무게를 측정한 후 개별 케이지에 뿔가위벌을 한 마리씩 넣었다. 시험약제를 포함한 50% (w/v) 자당용액을 먹이 용기에 20 μL씩 넣어 3시간 동안 공급하였다. 40마리 중 non-feeder를 제외한 후 최종 30마리를 선정하여 시험을 진행하였다. 약제 노출 후 새 먹이 용기로 교체하여 시험 종료시까지 50% 자당용액을 자유롭게 공급하였다. 이 후 최소 48시간 또는 최대 96시간 동안 치사개체 및 이상증상을 관찰하였다.

약제 노출 후 4시간, 24시간, 48시간의 치사개체 및 이상 증상을 관찰하였으며 약제 처리군에서 24시간과 48시간 사이의 치사율이 10% 이상 증가할 경우 72시간 및 96시간까지 관찰한 후 시험을 종료하였다. 약제 노출 후 관찰사항으로는 이상행동이 관찰되지 않는 상태(unaffected, U), 움직일 수 있지만 감소된 신체 조정력을 보이거나 과잉행동을 나타나는 상태(affected, A), 걷지 못하고 더듬이 및 다리의 움직임이 매우 약하며, 자극에 대한 반응이 매우 약한 상태(moribund, M), 벌이 죽은 상태(dead, D)로 구분하여 관찰한 뒤 기록하였다.

각 시험군의 뿔가위벌 체중값은 평균 ± 표준편차로 표시하였으며 시험물질의 독성 시험 결과는 EPA probit analysis program (ver 1.5)을 사용하여 LD₅₀ 및 95% 신뢰한계를 산출하였다.

뿔가위벌(O. pedicornis) 수컷의 dimethoate 처리량에 따른 독성영향을 확인하기 위해 각 처리군 당 2 μL로 처리하여 이상증상 및 치사개체를 관찰하여 기록하였다(Table 3). 무처리군에서는 96시간까지 30마리 중 2마리가 죽어서 10% 이하의 치사율을 나타냈다. Dimethoate 1.0 μg a.i./bee, 2.0 μg a.i./bee 처리군에서는 약제 노출 4시간 후 affected (A)와 moribund (M) 상태가 각각 12마리, 29마리였고 24시간 후에는 모두 치사하였다. Dimethoate 0.5 μg a.i./bee 처리군은 약제 노출 4시간 후에 이상증상 개체가 발견되지 않았지만 24시간 후에 모두 치사하였다. Dimethoate 0.25 μg a.i./bee 처리군에서는 24시간 후에 15마리가 죽었고 48시간에는 26마리가 치사하여 24시간과 48시간의 치사개체가 10% 이상 증가하였기 때문에 96시간까지 관찰하였다. Dimethoate 0.125 μg a.i./bee, 0.25 μg a.i./bee 처리군에서는 노출 후 96시간에는 21마리, 27마리가 죽어서 치사율이 각각 70%, 90%이었다. Dimethoate 0.125 μg a.i./bee 처리군에서는 24시간과 48시간 사이에 벌이 10% 이상 치사하지 않았지만 48시간 치사율(10%)이 96시간에는 70%로 약 60%가 증가하였다. 시험결과 dimethoate의 O. pedicornis 수컷에 대한 급성 접촉 48 h, 96 h LD₅₀ 값은 각각 0.186 (0.155-0.213), 0.093 (0.033-0.129) μg a.i./bee이었다(Table 5). 또한 벌 개별 무게는 농약의 민감도에 영향을 주기 때문에 독성값을 무게로 나누어 weight-normalised LD₅₀ 값을 Table 5에 나타내었다. 급성 접촉 weight-normalised LD₅₀ 48 h, 96 h LD₅₀ 값은 각각 2.72 (2.27-3.11), 1.36 (0.48-1.89) μg a.i./g bee이었다. UhI et al. (2019)의 O. bicornis 암컷 dimethoate 접촉독성 시험결과 48 h weight-normalised LD₅₀ 값은 13.20으로 본 시험종인 O.pedicornis 수컷이 약 5배 이상 민감하였다.

UhI et al. (2019)은 O. bicornis 암컷의 농약 16종에 대한 급성 접촉독성시험을 수행하였으며 14개 시험군은 무처리군에서 치사율이 10% 이하였으며 나머지 2개 시험군의 치사율은 15%이었다. 시험 결과 네오니코티노이드계 농약 acetamiprid, imidacloprid, thiacloprid 에서 O. bicornis가 꿀벌보다 더 민감하였으며(최대 18배) 나머지 유기인계 및 피레스로이드계 농약은 꿀벌이 O. bicornis보다 더 민감하였다(Uhl et al., 2019).

Uhl et al. (2016)은 유럽 벌 5종에 대해서 급성 접촉독성시험을 수행하여 dimethoate 독성값 48 h LD₅₀을 분석하였다. 시험결과 유럽 벌 5종 중 B. terrestris, O. bicornis는 dimethaote에 대해 가장 덜 민감하였으며 꿀벌에 비해 LD₅₀값이 각각 28.5배, 23.8 배가 컸다. 어린 꿀벌은 무독화 능력이 우화당시에는 매우 낮고 화분매개활동을 시작할때까지 증가한다고 알려져 있다(Smirle et al., 1988; Słowińska et al., 2016). 그러나 어린 단독벌류(O. bicornis)는 우화 전에 완성된 큐티클층과 항산화 효소 레벨이 증가하는 것으로 인해 꿀벌에 비해 상대적으로 독성에 덜 민감하다고 알려졌다(Elias-Neto et al., 2014; Dmochowska-Ślęzak et al., 2015).

본 연구의 시험종인 O. pedicornis 수컷의 48 h LD₅₀ 값은 0.186 μg a.i./bee으로 O. bicornis (수컷, 1.71 μg a.i./bee) 보다 약 10배 정도 민감한 것으로 나타났다. 참고문헌의 꿀벌접촉독성 48 h LD₅₀ 값은 0.16 μg a.i./bee으로 O. pedicornis와 독성 민감도가 비슷한 것으로 나타났다(Table 5). Ladurner et al. (2005)는 O. lignaria 암컷의 dimethoate 접촉독성시험을 수행하였으며 48 h LD₅₀ 값이 1.21 μg a.i./bee 으로 본 시험종인 O. pedicornis 가 독성이 약 7배 정도 민감한 것으로 나타났다.

Table 4는 dimethoate 섭식 노출량 및 관찰기간에 따른 뿔가위벌(O. pedicornis) 수컷의 이상증상 및 치사개체수를 나타낸다. 무처리군에서는 96시간까지 벌 30마리 중 4마리가 치사하여 13.33%의 치사율을 나타냈다. Heard et al. (2017)은 A. mellifera, B. terrestris, O. bicornis 3종의 벌에 대한 농약의 섭식독성시험을 10일 동안 수행하여 섭식 LD₅₀ 값을 제시하였다. 꿀벌과 서양뒤영벌은 96시간 관찰 기간 동안 무처리군에서 치사율이 10% 이하로 유지하였지만 뿔가위벌류(O. bicornis)는 48시간 무처리군 생존률이 40-80%이었으며 평균 65%였다. 이는 실험실 조건에서 다른 사회성벌과 다르게 뿔가위벌류의 무처리군 치사율이 높아질 수 있는 것을 암시한다. ICP-PR 시험방법 가이드라인에서도 뿔가위벌류 시험에서 무처리군 유효기준 치사율이 15% 또는 20%까지도 높아질 수 있다고 언급하였다.

Dimethoate 1.35 μg a.i./bee 처리군은 처리 4시간 후에 벌 20마리가 치사하여 약 70%의 치사율을 나타냈고 48시간 이후 100% 치사하였다. Dimethoate 0.45 μg a.i./bee 처리군에서는 4시간 후 치사개체는 2마리였지만 이상증상 개체가 약 70% 이었고 48시간 이후에 100% 치사하였다. Dimethoate 0.15, 0.05, 0.017 μg a.i./bee 처리군에서는 48시간 치사율이 각각 53.33%, 13.33%, 16.67% 이었고 96시간 치사율은 각각 80.00%, 33.33%, 36.67%이었다(Fig. 3). Dimethoate의 O. pedicornis 수컷에 대한 급성섭식 48 h, 96 h LD₅₀ 값은 각각 0.119 (0.090-0.164), 0.104 (0.047-0.142) μg a.i./bee이었으며 weight-normalised 48 h, 96 h LD₅₀ 값은 각각 2.02 (1.53-2.78), 1.77 (0.80-2.41) μg a.i./g bee이었다(Table 5). Ladurner et al. (2005)는 O. lignaria의 dimethoate 섭식독성시험 수행 결과 48 h LD₅₀ 값이 0.26 μg a.i./bee으로 본 시험종인 O. pedicornis가 독성이 2배 이상 민감한 것으로 나타났다. 참고문헌의 꿀벌 섭식독성 48 h LD₅₀ 값은 0.13 μg a.i./bee 으로 O. pedicornis와 독성 민감도가 비슷한 것으로 나타났다(Table 5).

Fig. 3. 
Mortality of solitary bees (O. pedicornis) exposed to different concentrations of dimethoate in the acute contact (A) and oral (B) toxicity tests.

Phan et al. (2020)은 O. cornifrons 암/수컷에 대한 thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid 3가지 농약의 급성 섭식독성시험을 수행하였다. 시험결과 수컷이 thiamethoxam에 더 민감하게 반응하였으며 나머지 두 농약은 암컷이 더 민감하였다. 시험물질 노출 후 2일, 5일, 7일에 치사율을 조사하였으며 농약에 따라 연장된(48시간부터 7일까지) 치사개체가 발생하였다. EPA와 EFSA는 꿀벌 급성독성시험 수행시 96시간까지 치사개체를 관찰하도록 되어 있지만 시험 결과상 관찰기간을 연장해야되는 것을 제안하였다. 또한 Phan et al. (2020)은 수컷 단독벌이 화분매개 활동을 하고 번식에 중요한 역할을 하기 때문에 뿔가위벌류는 암컷뿐만 아니라 수컷의 독성시험도 수행할 것을 제안하였다.

본 연구에서는 ICP-PR ring test 시험법을 기반으로 뿔가위벌류 급성 접촉 및 섭식독성시험법을 구축하였다. 앞으로 이 시험법을 활용하여 최근 이슈가 되고 있는 네오니코티노이드계 농약 등 다양한 농약에 대한 뿔가위벌류의 독성 정보를 제공할 수 있을 것이라고 생각된다.