Editorial Board

참다래 궤양병원균에 항세균능력을 나타내는 방선균을 분리하기 위해 참다래를 채집하였다. 농촌진흥청 국립원예특작과과학원(34°48′56.8″N 127°55′42.7″E)에서 참다래의 근권을 50mL 튜브(SPL, Republic of Korea)에 채집하였다. 근권은 균분리를 위해 20% glycerol는 1:1로 혼합하여 -20^oC에 보관하였다.

근권 1 g은 멸균수 9mL와 희석하여 1/5 PDK (potato dextrose, 2 g; peptone, 2 g; agar, 20 g per L) 배지에 100 μL 분주, 도말을 진행하였다. 도말을 진행한 배지는 28^oC에서 5일 간 배양하였다. 배양한 배지에서 방선균 표현형을 나타내는 colony는 96-well plate (SPL, Republic of Korea)에 보관균주를 제작하였다. 보관균주 제작은 96-well plate에 TSB 150 μL를 분주 후, 방선균의 colony를 접종하였고 28^oC 진탕 배양기에서 5일 간 배양하였다. 배양한 plate에는 50% glycerol 150 μL을 분주하여 -20^oC에 보관하였다.

참다래 궤양병원균을 억제하는 방선균을 선발하기 위해 대치배양을 총 3차로 진행하였다. Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar 3 (Psa) 균주는 1/5 TSA (Tryptic soya broth 6 g, agar 20 g per L) 배지에 획선도말하여 20^oC에서 3일간 배양하였다(Lee at al., 2021). 배양 후, 생성된 단일 colony는 1/5 TSB (Tryptic soya broth 6 g per L) 배지 10 mL에 접종하였다. 접종한 배지는 20^oC에서 3일간 배양하였고 OD₆₀₀을 0.3로 희석하여 모든 대치배양 실험에 사용하였다. 1차 대치배양은 96-well plate에 분리된 방선균을 사용하여 실험을 진행하였다. 방선균은 96-pin microplate replicator (Boekel Scientific, USA)를 이용해 tray plate TSA 배지에 접종하였다. 접종한 배지는 28^oC에서 5일간 배양하였으며, OD₆₀₀를 0.3으로 조절한 Psa 균주를 5mL 분주하여 20^oC에서 3일간 키웠다. Psa 병원균을 억제하는 방선균은 2차 대치배양에 사용하였다. 2차 대치배양은 9 cm petri dish PDK 배지에 1차로 선발된 균주를 배양하였다. 균주들은 배지의 중심에서 3 cm 떨어진 위치와 직각을 이루도록 약 3 cm 길이의 선을 그어주었다. 그 후, 1차와 동일한 조건으로 배양한 Psa 균주를 분주하여 대치배양을 진행하였다. 항세균능력을 나타내는 균주들은 3차 대치배양을 하였다. 3차 대치 배양은 9 cm petri dish PDK 배지의 Paper disc에 균주를 동일한 농도로 접종하였다. 각 방선균들은 OD₆₀₀을 0.6로 조절하였고 8 mm paper disc에 20 μL 접종되었다. 분주한 plate는 28^oC에서 5일간 배양하였고 Psa를 분주하여 항균 능력을 나타내는 균주가 선발되었다(Clean zone 길이 5 mm 이상). 선발된 균주와 Psa만 처리한 처리구는 Wilcoxon rank-sum test를 이용해 통계적 차이를 나타내었다. Wilcoxon rank-sum test는 각 처리구들의 표본이 서로 독립적이고 정규분포를 만족하지 않을 때 사용하는 분석방법으로 p 값이 0.05보다 작을 때, 통계적 차이가 유의미함을 나타낸다. 방선균은 보관균주 제작을 위해 MS (Mannitol Soya; Mannitol 20 g, Soya 20 g, Agar 20 g per 1 L) 배지에 4방향 전면도말하여 28^oC에서 5일간 배양하였다. 배양된 방선균은 20% glycerol 1 mL을 적신 멸균솜으로 모아 syringe (10 mL)에 넣었으며 밀대를 밀어 추출물로 보관균주를 제작하였다. 추출물은 -20^oC에 보관하였다.

참다래 궤양병원균에 항세균 능력을 나타낸 방선균은 분자생물학적 동정을 하였다. 방선균 후보군 들은 각각 MS 배지에 4방향 전면도말을 시행한 후, 분자생물학적 동정을 위해 DNA 정제 및 16S rRNA 영역을 이용한 PCR을 진행하였다. 배양한 방선균은 CTAB 방법을 사용하여 DNA를 추출하였다(Graham et al., 2003). CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide; 2.0% (w/v) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide; 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mMEDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl) 500 μL에 방선균과 Lysozyme solution Lysozyme solution (50 mg/mL)을 15 μL 첨가한 후 37^oC에서 1시간 동안 배양하였다. 배양한 균주는 Protease K solution (20 mg/mL)을 8 μL를 넣어 65^oC Heating block에서 30분간 반응시켜주었다. 단백질 변성 과정을 거친 후, PCI (Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol, 24:25:1) 700 μL를 넣고 혼합하였다. 혼합액은 12,470 × g에서 10분 동안 원심분리를 통해 단백질을 분리해주었다. 분리 과정을 거친 상층액은 새로운 microcentrifuge tube에 넣어 400 μL Isopropanol을 첨가하였다. 첨가된 tube는 5~7회 좌우로 흔들어서 혼합하였으며 12,470 × g에서 5분 간 원심분리를 하였다. 침전 외 남은 용액은 제거하였으며, 70% ethanol 500 μL를 이용하여 동일한 속도로 5분 동안 원심분리를 통해 이물질을 제거하였다. 원심분리 후, tube의 상층액을 제거하여 1~2시간 동안 완전히 건조하였다. 추출한 DNA는 Nano-Drop^TM 2000c (Thermo scientific, USA)를 이용해 DNA 양을 측정하였다. DNA 측정 시 A260/280 비율은 1.8 미만으로 A260/230 비율이 1.8~2.2인 DNA를 이용하여 PCR을 진행하였다.

PCR은 16S ribosomal RNA (16S rRNA), ATP synthase subunit beta (atpD), RNA polymerase beta subunit (rpoB) 영역을 증폭하였다. 16S rRNA 영역에 대해 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)/1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’), atpD 유전자에 대하여 atpDF (5’-GTCGGCGACTTCACCAAGGGCAAGGTGTTCAACACC-3’)/atpDR (5’-GTGAACTGCTTGGCGACGTGGGTGTTCTGGGACAGGAA-3’), rpoB 유전자에 대해 rpoBPF (5’-GAGCGCATGACCACCCAGGACGTCGAGGC3’)/ rpoBPR (5’-CCTCGTAGTTGTGACCCTCCCACGGCATGA-3’) primer (Rong and Huang, 2014)를 사용하였다. PCR은 Genomic DNA 1 μL (100 ng/μL), primer (10 pmol) 1 μL, dNTP (2 mM) 4 μL, 2 × PCR buffer 20 μL, KOD FX Neo 0.3 μL (0.1 U/μL), ddH₂O로 최종 40 μL으로 맞추어 진행하였다. PCR 과정은 98^oC 5분간 pre-denaturation을 수행한 후, 98^oC denaturation 30초, 56^oC (16S rRNA)/63^oC (atpD)/65^oC (rpoB) annealing 30초, 72^oC elongation 1분 30초 과정을 30회 반복하였고 final-elongation 72^oC에서 10분과정을 진행하였다. PCR 후 산물은 1% agarose gel에 전기영동을 하였고 gel elution 진행하였다. 전기 영동을 통해 얻어진 약 1.5 kb (16S rRNA)/1 kb (atpD)/0.8 kb (rpoB) band는 elution을 위해 소독한 메스로 잘랐다. 절단된 agarose 절편은 Expin^TM Gel SV kit (GeneAll, Republic of Korea)를 이용하여 정제하였다. Microcentrifuge tube에 절편과 300 μL GB buffer를 첨가해 50^oC에서 10분간 반응하였다. 반응한 tube는 상온에서 식힌 후, column tube에 모두 옮겨 원심분리를 해주었다. 원심분리한 column은 80% ethanol을 이용해 불순물을 제거하였으며 건조시켜 EB buffer로 genomic DNA를 column에서 분리하였다. 분리된 DNA는 전기영동을 통해 단일 밴드 여부를 확인하였다.

정제된 PCR 산물은 Cosmogenetech (Seoul, Korea)에 high throughput DNA sequencing을 통해 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 동정을 진행하였다. 동정 된 방선균은MEGA 10 program의 maximum likelihood 방법을 사용하여 16S rRNA phylogenetic tree와 각 해당 영역(16S rRNA, atpD, rpoB)을 모두 합하여 Multiple sequence alignment을 진행하여 phylogenetic tree를 제작하였다.

선발된 방선균은 cellulase, chitinase, protease, siderophore 생성 활성을 확인하였다. 선발된 균주는 해당 배지의 8 mm filter disk (Advantec, Taiwan)에 접종하여 cellulase, chitinase 활성 실험을 진행하였다. Cellulase (yeast extract 1 g, CMC 1 g, KH₂PO₄ 4 g, MgSO₄ 1 g, MnSO₄ 0.05 g, FeSO₄ 0.05 g, CaCl₂ 2 g, NH₄Cl 2 g, Agar 18 g per L; pH 7.0~7.4) 배지, Chitinase 배지(Chitin 5mL, Yeast 5 g, KH₂PO₄ 0.7 g, K₂HPO₄ 0.05 g, MgSO₄ 0.3 g, FeSO₄ 0.1 g, NaCl 0.1 g, Agar 20 g per L; pH 6.5~7.0) 배지는 다음과 같이 제작하였다. 방선균의 량은 OD₆₀₀에서 0.6 (6 × 10⁸ cfu/mL)값으로 조절하였다. 농도를 조절한 방선균은 filter disk에 10 μL 접종하여 28^oC에서 7일 동안 배양하였다(Carder, 1986). 배양한 plate는 Congo Red 0.1%, 0.2% 2 mL 분주하여 plate의 투명한 영역 길이를 측정하였다(Hwang et al., 2016). Protease 활성은 protease (skim milk 10 g, Agar 20 g, per L) 배지에 OD₆₀₀ 0.6으로 접종하였다. 접종한 plate는 5일 후에 투명한 영역 길이를 쟀다(Berg et al., 2005). Siderophore (MM9 salt solution 100 mL, ddH₂O 750 mL, PIPES 32.24 g, Agar 15 g; pH 6.5 autoclave에서 멸균 후, 50^oC에서 casamino acid solution 30 mL, 20% glucose solution 10 mL, blue dye solution 100 mL) 배지에 균주 OD₆₀₀에서 0.6 (6× 10⁸ cfu/mL)값으로 10 μL 접종하여 siderophore 합성 실험을 진행하였다(Louden et al., 2011).

참다래 궤양병을 억제하는 방선균을 선발하기 위해 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 참다래의 근권을 채집하였다. 참다래의 근권에서 분리된 방선균은 총 288개의 보관균주로 제작되었다. 1차 대치배양에서는 96-well plate에 제작된 균주들을 이용하여 방선균을 선발되었다. Psa를 분주한 결과로 선발된 46개 방선균은 2차 대치배양을 진행하였고 항균 능력을 나타낸 16개의 방선균을 2차적으로 선별하였다. 3차 대치배양은 filter disk에 실험을 진행함으로써 Psa에 대하여 가장 뛰어난 항세균능력을 나타내는 1-1 9D 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 5.5~6.5 mm의 뛰어난 활성효과를 확인하였다(Fig. 1B). Wilcoxon rank-sum test를 통해 Untreated와 처리구의 clean zone 길이를 비교하였을 때, 통계적 차이가 유의미함을 알 수 있었다(Fig. 1A).

Fig. 1. 
Antibacterial ability of selected bacteria. (A): Comparison of untreated and 1-1 9D treatment after overlay of Psa. Wilcoxon rank-sum test is used to statistical analysis between the group. (B): Antibacterial assay against Psa. The selected bacteria 1-1 9D was cultured to OD₆₀₀ 0.6 in PDK media and incubated in 28^oC. Psa is overlaid to OD₆₀₀ 0.3 after 8 days and plate is incubated in 20^oC. Clear zone is measured after 2 days (n = 3).

참다래 궤양병에 대해 높은 항균능력을 나타낸 1-1 9D 균주는 16S rRNA, ATP synthase subunit beta (atpD), RNA polymerase beta subunit (rpoB) 영역을 이용하여 계통학적 관계를 알아냈다. 각 해당 영역의 크기는 1.5 kb (16S rRNA), 1 k b (atpD), 0.8 kb (rpoB)인 것으로 확인되었고 해당 영역 염기서열을 통해 동정을 진행하였다. NCBI BLAST 동정 결과로 S. venezuelae와 98% 이상 일치함을 나타내었다(NCBI Accession number: OM403094). 종의 정확한 분류을 위해 다른 Streptomyces spp.들과 16S RNA 영역 비교(Fig. 2A) 및 3가지 영역(16S rRNA, atpD, rpoB) multiple alignment analysis 비교(Fig. 2B) 두가지를 동시에 진행하였다. 이는 MEGA 10 프로그램을 통해 S. venezuelae와 분리된 1-1 9D 균주가 함께 분류되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A, B). S. venezuelae에 대한 다양한 선행 연구 결과들이 존재한다. S. venezuelae ATCC 15439는 빠르게 성장하는 Streptomyces 균주 중 하나로 알려져 있으며 methymycin, pikromycin의 생산자로 보고되어 있다(He et al., 2016). S. venezuelae P10은 chitinase를 생산하여 식물병원 균들에 대해 항진균능력을 나타내었다(Mukherjee and Sen, 2006). S. venezuelae로 동정된 1-1 9D 균주는 앞서 보고된 다양한 기작을 사용하여 Psa를 억제하는 것으로 판단된다. 분리된 1-1 9D 균주를 이용하여 Psa에 대해 생물학적 방제로 보고된 사례가 처음이며 이는 효율적인 관리에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 2. 
Identification of the selected bacterium through the maximum-likelihood method in MEGA 10 program. (A): Phylogenetic tree of 1-1 9D using region of 16S rRNA region among Streptomyces spp. (B): Phylogenetic tree of 1-1 9D using combined sequences of 16S rRNA, ATP synthase subunit beta, and RNA polymerase beta subunit. Sequences were compared by multiple alignment analysis.

참다래 궤양병에 항균 능력을 나타내는 1-1 9D 균주의 cellulase, chitinase, protease, siderophore 생성 활성 실험을 진행하였다(Fig. 3). 1-1 9D 균주는 cellulase, chitinase, protease 효소 활성을 나타내었으며 siderophore 생성에도 관여하였다. 특히 protease에 비해 cellulase, chitinase 활성 및 siderophore 생성에 더 큰 효과를 나타내었다. 이전에 보고된 S. venezuelae P10와 동일하게 chitinase 생산 능력을 가지는 것이 확인되었고 chitin이 주요 세포벽 성분인 진균의 생장을 효율적으로 억제하는 능력을 가질 것으로 추측된다(Mukherjee and Sen, 2006). Cellulose, protease, siderophore 생성은 chitinase와 마찬가지로 생물학적 방제 메커니즘에 다양한 방식으로 기여를 하는 것으로 알려져 있다(Richter et al., 2011; Singh and Chhatpar, 2011; Shanmugaiah et al., 2015). 참다래에서 분리된 균주 S. venezuelae 1-1 9D는 다양한 효소에 대한 뛰어난 활성을 나타내었으나 Psa에 항세균능력에 기여하는지는 명확하지 않아 추후에 연구 해야할 부분으로 보인다.

Fig. 3. 
Enzyme assay of the selected strain. The 1-1 9D was inoculated to 0.6 value at OD₆₀₀ (6 × 10⁸ cfu/mL) in all media for 5~7 days. Congo Red of 0.1% (Cellulase), 0.2% (Chitinase) was overlaid in cellulose and chitin media after inoculation of bacteria. Clear zone was measured after inoculation (n = 12).