Editorial Board

콩 시료는 2016년부터 2021년까지 전국의 콩 재배지에서 채집하였다. 매년 8월부터 10월 사이에 경기 화성, 충북 제천 등지의 콩 포장에서 고사한 콩을 채집하고, 채집한 콩을 지제부, 원뿌리, 곁뿌리로 구분하여 병원균을 분리하였다. 콩의 각 부위에서 병든 조직을 길이 5 mm 정도로 잘라내어, 70% 에탄올과 1% 차아염소산나트륨 용액에서 30초간씩 표면살균하고, 멸균수로 1분간 세척한 후, 멸균한 여과지에 올려 수분을 제거하였다. 표면 살균한 병든 조직은 1% 물한천배지(water agar, WA)에 치상하여 암 조건에서 일정 기간 동안 배양하였다. 병든 조직으로부터 자라나온 균사를 해부 현미경에서 관찰하며 단균사의 끝 부분의 조각을 떼어 300 μg/mL의 streptomycin을 첨가한 PDA 배지(potato dextrose agar; Becton, Dickinson and Company, Difo^TM)에 접종하고, 다시 암 조건에서 배양하였다. M. phaseolina는 35^oC에서 분리를 실시하였으며, M. phaseolina 이외 병원균의 균주는 25^oC에서 분리하였다. 분리한 병원균은 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역을 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') 를 사용하여 증폭하여 동정하였다(White 등, 1990).

살균제 선발 실험을 위해서 콩균핵마름병균인 M. phaseolina ASH20-001, 미라병균인 D. longicolla DI20-001, 검은뿌리썩음병균인 C. ilicicola CA20-008, 시들음병균인 F. oxysporum FO20-001 등 콩의 주요 병의 원인이 되는 4종의 병원균 균주를 실험에 사용하였다. 선발한 7종의 살균제에 대한 감수성의 변화를 조사하기 위해서 단균사 분리한 M. phaseolina는 2016년부터 2018년까지 화성을 비롯한 전국 재배지에서 분리한 37균주와 2020년에는 24균주, 2021년에는 13균주를 사용하였다. 분리한 균주는 2020년 콩 균핵마름병을 처음 보고한 연도를 중심으로, 2016년과 2018년에 분리한 균주와 2020년과 2021년에 분리한 균주로 나누어 살균제에 대한 감수성 정도를 비교하였다. 또한 2021년 9월에 제주도의 균핵마름병 발생 지역에서 분리한 20균주는 2021년 제주도를 제외한 지역에서 분리한 균주와 감수성 정도를 비교하였다.

고사한 콩에서 분리한 4종의 병원균에 대한 살균제의 효과를 검정하기 위하여 작용기작이 다른 29종의 살균제를 선발하여 실험에 사용하였다(Table 1). 세포 분열을 억제하는 B1, 세포 호흡을억제하는 C2, C3, C4, C5, 신호 전달을 저해하는 E2, E3, 스테롤 생합성을 저해하는 G1, G3 그룹과 다작용점을 억제하는 보호살균제(M 그룹)를 선발하여 균사생장 억제효과를 조사하였다.

연도 별로 분리한 M. phaseolina의 살균제에 대한 감수성 변화는 병원균에 대한 EC₅₀값이 0.5 μg/mL 이하인 살균제 중에서 적용 병원균의 범위가 넓은 7종의 살균제를 우선으로 선발하여 조사하였다. 선발한 7종의 살균제는 B1 그룹인 benomyl, C3 그룹인 pyraclostrobin, C5 그룹인 fluazinam, E2 그룹인 fludioxonil, G1 그룹인 metconazole, prochloraz, tebuconazole 등이었다.

선발한 살균제의 효과는 병원균에 대한 균사생장 억제효과를 한천희석법으로 조사하였다. 공시한 살균제 중에서 5종의 살균제는 PDA 배지에 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0 μg/mL가 되도록 첨가하였으며, 살균제를 첨가하기 전에 세균에 의한 오염을 방지하기 위해서 300 μg/mL의 streptomycin을 첨가하였다. 다만 fluazinam과 fludioxonil의 경우는 최종 농도가 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0 μg/mL가 되도록 첨가하였다. M. phaseolina는 30^oC의 PDA배지에서 3일간 배양하여 접종원으로 사용하였다. 균총 선단에서 직경 3 mm의 균사 조각을 떼어내어 살균제를 첨가한 PDA 배지에 균사 면이 배지 쪽으로 가도록 뒤집어서 접종하고, 30^oC에서 2일간 배양하였다. 살균제의 균사생장 억제효과는 살균제 첨가 및 무첨가 PDA배지에서 병원균의 균총 직경을 조사하여 아래 식으로 계산하였다.

각 살균제의 처리 농도에서 병원균에 대한 균사생장 억제효과를 구한 후, 엑셀 프로그램을 이용하여 살균제 농도와 억제효과 간의 회귀식을 구하였다. 회귀식을 이용하여 병원균의 균사생장을 50% 억제하는 농도를 구하여, 각 살균제의 효과를 비교하였다.

제주도를 포함하여 2016년부터 2021년까지 채집한 94개 균주의 살균제에 대한 EC₅₀값을 가지고 실험에 사용한 7종의 살균제 간의 감수성에 대한 상관 관계를 회귀 분석을 통하여 조사하였다. 상관계수의 통계적 유의성을 계산하여 살균제 간에 교차 저항성 관계가 성립하는 지를 분석하였다.

이 논문에서의 모든 실험 데이터는 IBM SPSS Statistics 26 통계처리 프로그램을 이용하여 일원분산분석을 실시하였으며, 분산분석 후 사후 검정으로 DMRT를 실시하였다. 또한 살균제에 대한 M. phaseolina의 교차 저항성 가능성을 확인하기 위하여 상관 분석을 실시하여 상관계수를 구하고 비교하였다.

본 연구에서는 콩균핵마름병균 뿐만 아니라 콩이 고사하는 유사한 병징을 보이는 미라병균, 검은뿌리썩음병균, 시들음병균에 대한 억제효과도 우수한 살균제를 선발하기 위해서, 4종의 콩 병원균에 대한 살균제의 균사생장 억제효과를 조사하였다. Metconazole과 prochloraz는 M. phaseolina ASH20-001, D. longicolla DI20-001, C. ilicicola CA20-008, F. oxysporum FO20-001 모두에 대해서 EC₅₀값이 0.5 μg/mL 이하로, 우수한 균사 생장 억제효과를 보였다. 특히 M. phaseolina ASH20-001에 대한 EC₅₀값은 metconazole이 0.18 μg/mL, prochloraz가 0.4 μg/mL이었다. Benomyl, fluazinam, fludioxonil, tebuconazole 등은 4종의 병원균 중에서 3종의 병원균에 대한 EC₅₀값이 0.5 μg/mL 이하였지만, benomyl과 fluazinam은 F. oxysporum FO20-001에 대해서 EC₅₀값이 1.91과 0.63 μg/mL이었으며, fludioxonil과 tebuconazole은 C. ilicicola CA20-008에 대한 EC₅₀값이 1.67과 0.79 μg/mL로. 0.5 μg/mL 이상이었다. 하지만 M. phaseolina ASH20-001에 대한 benomyl, fluazinam, fludioxonil, tebuconazole의 EC₅₀값은 0.15, < 0.01, 0.01, 0.24 μg/mL로 우수하였다. Pyraclostrobin은 M. phaseolina ASH20-001과 D. longicolla DI20-001에 대한 EC₅₀값은 0.02와 <0.01 μg/mL로 매우 우수하였으나, C. ilicicola CA20-008과 F. oxysporum FO20-001에 대해서는 14.10과 3.56μg/mL로 저조하였다. 병원균 4종 모두에 대해서 우수한 균사생장 억제효과를 보인 metconazole과 prochloraz는 식물병원곰팡이의 에르고스테롤 생합성을 저해하는 살균제이다. 특히 metconazole은 Fusarium에 의한 붉은곰팡이병 방제를 위해서 사용하는 살균제로서(Magan et al., 2002; Paul et al., 2008; Tateishi et al., 2010; Spolti et al., 2012), 에르고스테롤 생합성 과정의 효소인 C14-demethylase의 활성을 저해한다(Ito et al., 1999). 본 연구를 통해서 metaconazole의 M. phaseolina에 대한 균사생장 억제효과가 처음 보고되지만, 실험실 내에서 병원균을 가지고 실험한 결과이기 때문에, 병 방제에 실제 적용하기 위해서는 온실과 포장에서 효과 검정해야 할 뿐만 아니라, 작물에 대한 약해 여부까지도 조사되어야 한다.

병원균은 콩 균핵마름병에 대한 포장 방제 실험을 시작하여 살균제를 등록하기 이전인 2016년부터 2018년까지 채집한 병원균 그룹과 2020년 이후에 채집한 그룹으로 나누어, 7종 살균제의 균사생장 억제효과를 비교하였다(Table 3). 그 결과, 채집 시기가 달랐던 두 집단의 benomyl과 fludioxonil, 그리고 tebuconazole과 metconazole에 대한 EC₅₀값의 차이가 통계적으로 유의하였으며(P<0.01), 2020년 이후 그룹이 2018년까지 그룹과 비교하여 평균 EC₅₀값이 2배 이상 증가하였다. 작용기작이 동일한 prochloraz는 tebuconazole과 metconazole과는 다르게 시기별 집단 간에 유의차 있는 EC₅₀값의 변화가 인정되지는 않았다. 연도 별 그룹에 대한 prochloraz, pyraclostrobin, fluazinam의 EC₅₀값 변화는 통계적으로 유의하지 못하였다.

2018년까지 채집한 M. phaseolina의 집단과 2020년 이후에 채집한 집단에 대한 EC₅₀값의 분포를 비교하였다. Benomyl의 EC₅₀값 분포는 0.5 - 0.6 μg/mL의 구간에서 2020년 이후 채집한 M. phaseolina 균주의 수가 증가하면서 2018년까지 집단에서 보여주던 단봉 분포가 쌍봉 분포의 형태로 변화하기 시작하였다(Fig. 1A). EC₅₀값이 상승한 M. phaseolina 균주의 β-tubulin 유전자를 분석한 결과, 특정 위치에서 아미노산의 치환은 발견되지 않았다(결과 미발표). Fludioxonil의 경우 살균제에 대한 병원균의 감수성이 저하하면서, EC₅₀값의 분포가 전체적으로 고농도 쪽으로 이동하여, 0.01 – 0.03 μg/mL이었던 최빈값 구간이, 2020년 이후 균주 집단에서는 0.05 – 0.07 μg/mL로 상승하였다(Fig. 1G). 에르고스테롤 생합성을 저해하는 prochloraz, tebuconazole, metconazole에서는 0.7 μg/mL 이상인 EC₅₀값을 갖는 균주의 수가 증가하며, 고농도 구간의 균주 수가 전체적으로 조금씩 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1B, 1C와 1D). Fig. 1C에서 보면 2020년 이후 M. phaseolina 균주 중에서 tebuconazole에 대한 EC₅₀값이 1.0μg mL 이상인 균주는 5균주이었으며, 그 중 4균주는 2021년에 분리한 균주로, M. phaseolina ASH21-025와 ASH21-027은 충북 제천에서, M. phaseolina A SH21-030과 ASH21-032은 경기 화성에서 분리하였다. Tebuconazole에 대한 EC50값은 1.098, 1.232, 1.327, 1.389 μg/mL이었으며, prochloraz에 대해서는 ASH21-025와 ASH21-032가 1.211과 1.193 μg/mL, ASH21-027과 ASH21-030은 0.856과 0.775 μg/mL이었고, metconazole에 대해서는 21-025, 210-027, 21-030이 1.135, 1.346, 1.447 μg/mL, 그리고 21-032가 0.94 μg/mL이었다. Tebuconazole에 대한 감수성이 떨어진 4균주는 동일한 작용기작을 갖는 prochloraz와 metconazole에 대해서도 감수성이 저하되며 EC₅₀값이 증가하였다.

Fig. 1. 
Distribution of sensitivity of two populations of Macrophomina phaseolina to several fungicides. For the two populations of pathogens, the first was the population collected from 2016 to 2018, and the other was the one collected in 2020 and 2021. Isolates were randomly collected from soybean fields across Korea. A; benomyl, B; prochloraz, C; tebuconazole, D; metconazole, E; pyraclostrobin, F; fluazinam, and G; fludioxonil.

병원균의 살균제에 대한 EC₅₀값의 분포 양상을 가지고 저항성을 질적 저항성과 양적 저항성으로 구분한다(Brent and Hollomon, 2007). 질적 저항성은 작용점 유전자의 돌연변이가 저항성 발생 기작인 살균제에서 나타나는데, 감수성과 저항성 균주의 EC₅₀값의 차이가 뚜렷하기 때문에, EC₅₀값의 분포가 쌍봉 분포를 이루게 된다. 이에 비해서 양적 저항성은 병원균의 EC₅₀값이 전체적으로 높아지면서 EC₅₀값의 분포가 고농도 쪽으로 이동하는 양상을 보이는데, ABC transporter가 살균제를 방출하거나 또는 작용점 유전자의 과다 발현 등에 의해서 저항성이 발생할 경우 나타나게 된다(Brent and Hollomon, 2007). 본 연구 결과에서도 β-tubulin 유전자의 점 돌연변이에 의해서 저항성이 나타나는 benomyl의 경우가 질적 저항성을 보이는데, 2020년 이후 균주 집단의 분포가 쌍봉 분포 형태를 보이기 시작하였다. Fludioxonil의 작용기작은 아직까지 정확하게 규명되지 않았지만, Botrytis cinerea에서 삼투압 조절 유전자인 bos1, bcsak1, BcOS4, bos5, BRRG-1의 돌연변이와 ABC(ATP-binding cassette) transporter에 의한 다중 저항성 기작으로 설명하고 있다(Vigntelli et al., 2002; Kretschmer et al., 2009; Leroch et al., 2013). Fig. 1G에서 보는 것과 같이 fludioxonil의 EC₅₀값 분포가 양적 저항성의 특징을 보이는 것 같아, ABC transporter에 의한 다중 저항성 기작이 M. phaseolina에도 작동되는 것이 아닌가 하는 생각을 갖게 한다. 하지만 fludioxonil 저항성을 정확하게 설명하기 위해서는 포장 병원균에 대한 경시적인 저항성 모니터링과 발현 기작 연구가 더 진행되어야 한다. 양적 저항성의 발현은 Fusarium graminearum에서도 보고되어 있다(Zhou et al., 2020). 이런 결과는 fludioxonil의 방제 효과가 급작스럽게 감소하지는 않겠지만, 지속적인 사용으로 농도가 높아지면, 살균제의 사용량이 증가하면서 저항성 문제가 심화될 수도 있다.

2021년 9월에 제주 북부 지역에서 채집한 고사한 콩에서 M. phaseolina를 분리하여, 제주도 이외 지역에서 분리한 균주와 살균제에 대한 반응을 비교하였다. Fig. 2에서 보는 것과 같이 7종의 살균제 중에서 benomyl과 pyraclostrobin을 제외한 5종의 살균제에 대한 반응이 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.01). 제주도를 제외한 지역에서 분리한 M. phaseolina의 prochloraz, tebuconazole, metconazole에 대한 평균 EC₅₀값은 0.590 ± 0.344 μg/mL, 0.837 ± 0.375 μg/mL, 0.866 ± 0.434 μg/mL이었으나, 제주도 지역에서 분리한 M. phaseolina의 평균 EC₅₀값은 0.212 ± 0.163 μg/mL, 0.330 ± 0.160 μg/mL, 0.389 ± 0.522 μg/mL로, EC₅₀값이 2.2배 이상 차이가 났다. 각 지역의 콩 재배 포장에서 prochloraz, tebuconazole, metconazole의 정확한 사용량을 알 수 없었기 때문에, 살균제의 사용량이 병원균의 감수성 변화에 영향을 미쳤다고 이야기할 수는 없지만, 제주도 지역에서 분리한 M. phaseolina가 살균제와 접촉할 기회가 적었기 때문에, 살균제에 대한 감수성이 높았을 것으로 추정하였다. 붉은곰팡이병을 일으키는 Fusarium graminearum도 tebuconazole을 연속적으로 처리한 후 살균제에 대한 감수성이 감소하였다는 보고가 있다(Becher et al., 2010). Benomyl의 경우, 제주 지역 집단은 제주 지역 이외 집단과 감수성에 차이가 없었다. 또한 제주 이외 지역의 집단에서 높은 EC₅₀값을 보이는 균주를 선발하여 β-tubulin 유전자 염기서열을 분석한 결과, 점 돌연변이가 발생하지 않았던 점을 보면, 제주 이외 지역과 동일하게 제주 지역에서 채집한 M. phaseolina 균주는 점 돌연변이에 의한 살균제 저항성의 발생은 없었던 것으로 생각하였다. Pyraclostrobin도 Fig. 1E에서 보는 것과 같이 시기 별 두 집단 간의 감수성에 차이가 없음을 보여 줄 뿐만 아니라, 2021년에 채집한 제주 이외 지역과 제주 지역 균주 집단 간에도 감수성이 변화하지 않았다. 하지만, 정확한 저항성 모니터링을 위해서 작용점인 cyt b 유전자에 대한 분석이 필요한 상태이다. 이상의 결과에서 보면, 제주도에서 분리한 M. phaseolina 균주는 제주도 이외에서 채집한 균주에 비하여 일부 살균제에 대한 감수성이 큰 것으로 나타났다. 최근 콩 균핵마름병의 방제를 위해서 fludioxonil과 pyraclostrobin이 등록되었다. 두 살균제 중에서 fludioxonil은 Fig. 1G와 같이 제주도 이외 지역 균주 집단에서 감수성이 낮았으나, pyraclostrobin의 감수성 간에는 통계적인 유의차가 없었다. 하지만 pyraclostrobin은 특이적인 작용점을 가지며, 저항성 발현 기작도 작용점 유전자의 점 돌연변이에 의해서 나타나기 때문에, 포장에서 사용하는데 주의 깊은 관리가 필요하다. 특히 제주도처럼 살균제에 대한 노출이 적었을 것으로 예상되는 지역에서는 살균제 사용에 대한 적극적인 관리가 필요할 뿐만 아니라, 저항성 관리를 위해서 사용하는 살균제에 대한 지속적이며 정확한 모니터링이 필요하다.

Fig. 2. 
Distribution of EC₅₀ values of Macrophomina phaseolina against each fungicide. X marks mean EC₅₀ values of all isolates of M. phaseolina tested for each fungicide. The EC₅₀ value was obtained with the inhibitory effect on the mycelial growth of M. phaseolina investigated by the agar dilution method in the PDA medium to which the fungicide was added at a predetermined concentration.

균핵마름병의 각 살균제에 대한 감수성의 변화가 서로 관계가 있는 지를 조사하였다(Table 4).

Fig. 3. 
Regression analysis between fungicides that inhibit ergosterol biosynthesis of M. phaseolina. Regression analysis between each fungicide was performed with EC₅₀ values of 94 isolates of M. phaseolina. R² is the coefficient of determination. Red symbols indicate four isolates as M. phaseolina 21-025, 21-027, 21-030, and 21-032, in ascending order of EC₅₀ values for tebuconazole.

Prochloraz, tebuconazole, metconazole은 각각 0.650 이상의 아주 높은 상관관계(p<0.01)를 보이며 교차 저항성 관계에 있음을 보여 주었다. Tebuconazole에 대한 감수성이 떨어진 M. phaseolina ASH21-025, ASH21-027, ASH21-030, ASH21-032 등 네 균주는 prochloraz와 metconazole에 대해서도 감수성이 감소하였다.

또한 benomyl에 대한 병원균의 감수성과 prochloraz, tebuconazole, metaconazole에 대한 감수성 간에도 0.5 이상의 뚜렷한 상관관계를 가지며 통계적으로 유의하였다(p<0.01). Benomyl은 작용기작이 다른 살균제에 대해서도 높은 상관 관계를 보이며 교차 저항성 관계에 있음을 보여주었다. Puccinia graminis f. sp. tritici의 경우에도 작용기작이 다른 triadimefon과 carbendazim 간에 높은 상관계수를 보이며, 교차 저항성이 인정되었다(Wu et al., 2020). 작용기작이 다른 살균제 그룹 간에 교차 저항성이 인정되는 것은 저항성의 기작이 살균제 작용점 유전자에서 발생하는 점 돌연변이가 아닌 다른 기작일 가능성이 높기 때문에 포장에서 더 많은 균주를 대상으로 모니터링과 기작 연구를 진행할 필요가 있다. Benomyl은 fluazinam과 fludioxonil에 대한 감수성과도 0.235와 0.290의 약한 상관관계가 통계적으로 인정되었으나, pyraclostrobin과는 상관관계가 통계적으로 인정되지 않았다.

본 연구에서는 M. phaseolina의 방제를 위해서 우수한 균사생장 억제효과를 보이는 살균제를 선발하고자 하였다. 그런데 포장에서 채집한 고사한 콩에서는 다양한 병원균이 분리되었고, 높은 빈도로 분리된 병원균이 균핵마름병균인 M. phaseolina, 미라병균인 D. longicolla, 검은뿌리썩음병균인 C. ilicicola, 시들음병균인 F. oxysporum 등 4종이었다. 따라서 M. phaseolina를 방제하기 위해서 선발한 살균제가 다른 병원균에도 효과가 있다면, 콩이 시들어 죽는 증상을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 생각하였다. 다만 살균제를 병원균에 대한 균사생장 억제효과를 가지고 선발하였기 때문에, 선발한 살균제는 포장 검정을 통하여 방제 효과를 정확하게 조사하여야 한다.

본 실험의 결과를 보면 2021년에 균핵마름병 방제를 위해서 새롭게 등록한 fludioxonil에 대한 감수성이 저하되었던 반면에, pyraclostrobin에 대한 감수성에는 변화가 없었다. 국내에서 콩에는 237개 품목의 살균제가 등록되어 있다. 그중에서 fludioxonil은 콩 균핵마름병의 방제를 위해서만 20개의 품목이 한꺼번에 등록되어 사용되고 있는 상황이기 때문에, 포장에서 사용을 관리할 수 있어야 한다. Pyraclostrobin이 속한 다3 군의 살균제는 단제 122품목와 합제 17품목이 등록되어 전체 등록된 살균제의 58.6%를 차지할 정도로 많지만, 본 실험에서는 시기 별로 채집한 집단 간에 감수성 저하 양상은 나타나지 않았다. 그런데 다3군의 살균제는 균핵마름병 이외에도 노균병, 자주무늬병 점무늬병, 탄저병 등을 방제하기 위해서 등록되어 사용되고 있으며, 무인항공기 방제용으로도 사용되고 있을 정도로 사용처가 많다. 따라서 병원균의 감수성 저하 양상이 나타나지 않았다고 할지라도, pyraclostrobin이 특이적인 작용점을 지니며 저항성 발현 위험도가 높은 살균제이니 만큼, 지속적인 저항성 모니터링이 필요하다. 에르고스테롤 생합성을 저해하는 사1군 살균제는 단제 11품목, 합제는 16품목이 등록되어 탄저병과 자주무늬병의 방제에 사용되는데, 균핵마름병에는 등록되어 있지는 않다. 하지만, 사1군에 속하는 metconazole과 tebuconazole에 대한 M. phaseolina의 감수성이 떨어지고 있기 때문에 균핵마름병균 뿐만 아니라, 자주무늬병균과 탄저병균에 대한 저항성 발생 여부도 지속적으로 모니터링하여야 한다.

대부분의 살균제 저항성 검정 연구에서는 당해 연도에 채집한 병원균의 균주를 사용하거나, 연도별로 균주를 채집한다고 해도 채집하는 기간이 제한적인 경우가 대부분이다. 하지만 본 연구에서는 2016년부터 2021년까지 6년간의 기간 동안 병원균을 채집하였으며, 균핵마름병 방제용 살균제를 등록하여 사용하기 전과 후로 나누어 살균제에 대한 반응을 비교하였기 때문에, 병원균의 살균제에 대한 감수성 정도의 경시적인 변화를 관찰할 수 있었다. 이런 경시적 변화에 대한 정보는 병 방제를 위해서 살균제를 선발할 때나, 살균제 저항성 문제를 관리할 때에는 매우 유용한 역할을 할 것으로 생각한다.