Editorial Board

실험에 사용한 소나무재선충은 경북 구미의 소나무재선충 자연발생지에서 소나무재선충에 감염된 나무의 가지를 절단하여 실험실로 가져와 전정가위 및 손도끼를 이용하여 1 cm² 크기로 자른 후 Schlinder (1961)의 깔때기법을 응용하여 분리하였다. 분리한 소나무재선충은 Kishi (1995)의 방법으로 PDA배지에서 증식시킨 잿빛곰팡이병균(Botrytis cyneria)에 접종시켜 증식하여 사용하였다.

소나무재선충의 증식 억제 활성을 검증하기 위한 기주목 가지를 이용한 실험을 위해 야외 소나무 개체의 가지를 절단하여 소나무재선충을 접종한 후, 증식효과를 검정하는 방법을 이용하였다(Shin et al., 2015). 실험에 사용된 소나무 가지는 경북 상주의 소나무 자연림에서 소나무재선충에 감염이 되지 않고, 나무주사 처리가 되지 않은 나무를 대상으로 가지를 절단하여 실험실로 가져와 사용하였다.

살선충 활성 및 선충 활동 억제 검정을 위해 실험에 사용한 약제들은 우리나라에서 소나무재선충 방제제로 등록된 에마멕틴벤조에이트에 살충제를 혼합한 합제 5종(RDA, 2020)과 혼합제에 포함된 살충제를 작물보호제 회사나 농약 판매점에서 구입하여 사용하였는데 각 시험약제의 정보는 Table 1과 같다.

살선충 활성 검정은 합제 자체와 합제에 포함되어 있는 살충제 성분을 일정 희석농도 단계로 희석하여 실험을 수행하였다. 희석농도 단계는 기준량을 중심으로 8단계내외의 농도단계로 구분하여 설정하여 실험하였는데 각각의 농도단계 설정은 치사반응의 추이를 검토하여 시험 약제별로 농도단계를 추가로 조정하여 반복적으로 검정을 수행하였다.

실험은 Lee et al. (2015)에서 수행한 소나무재선충에 대한 방선균의 살선충 활성 검정과 동일하게 12 multi-well plate(SPL, Pocheon, Korea)를 이용하였으며, 각 well에 증류수에 희석한 약제 0.5 mL를 피펫(Finnpipette F1, Thermo, China)으로 채워 넣고, 감염목으로부터 분리한 소나무재선충 100마리/0.5 mL를 피펫으로 접종하였다. 약제와 선충이 고루 섞이게 하기 위해 피펫으로 피펫팅과 분사를 10회 실시하였다. 실험은 하나의 well을 한 반복으로 8반복 처리하였고, 무처리구는 증류수 0.5 mL 처리 후 선충을 접종하였다. 접종을 완료한 각 plate는 가정용 알루미늄 호일(Lotte Alminum Co., Seoul, Korea)로 싸서 암조건을 유지시켜 주었고, 25°C 항온기(LGC-5201, DAIHAN LABTECH, Namyangju, Korea)에 24시간 보관 후 선충의 치사 유무를 해부 현미경(SM2 1000, Nikon, Tochigi-ken, Japan)에서 조사하였다. 선충의 치사 여부는 핀으로 자극하였을 때 반응이 없는 것을 죽은 것으로 간주하였다.

살선충 활성 실험에 사용한 동일한 약제를 이용하여 선충의 활동 억제 실험을 수행하였다. 희석농도 단계는 기준량(1K=1/2000배)을 중심으로 6농도 단계 내외로 설정하여 실험하였는데 각각의 농도 단계별에 대한 마비율을 고려하여 농도 단계를 추가적으로 조정하여 반복적으로 검정을 수행하였다.

실험 방법은 소나무재선충 살선충 활성 검정법과 동일한 방법으로 12 multi-well plate을 이용하여 수행하였는데 처리 24시간 후에 선충의 활동성을 조사하였다. 살선충 물질에 노출된 선충들의 치사는 시간의 경과에 따라 운동성이 소실되면서 경직 상태가 오고, 이후 치사가 진행된다. 활동성을 소실한 선충들은 일자형, J자형, S자형 또는 코일형 등의 체형상태를 유지하다 치사가 이루어지는데 선충의 종류나 노출된 약제의 종류에 따라 반응의 형태는 다양하게 나타난다(Kong et al., 2006; Taniwiryono et al., 2009; Nguyen et al., 2013).

에마멕틴벤조에이트는 GABA-R 수용체에 작용하여 근육 마비 작용을 하는 것으로 알려져 있어(Takai et al., 2000) 본 조사에서는 현미경상에서 선충의 움직임이 있는 개체를 활동성 개체로 간주하였고, ‘1’자 혹은 ‘C’, ‘J’와 같이 활동성이 현저히 떨어져 죽은 것처럼 보이는 개체의 경우 핀으로 자극 시 움직임이 있는 개체들을 비활동 개체, 자극 시 반응이 없는 개체들의 경우 치사한 개체로 간주하였다. 한 개의 well내에 전체 조사 선충들 수에서 활동성 개체와 비활동성 개체, 치사개체의 수를 백분율로 나타내었다. 한 개의 well을 한 반복으로 8반복 실험하였다.

소나무 가지를 이용한 소나무재선충 증식 억제 활성을 위한 실험 약제는 살선충 활성 검정과 동일하게 에마멕틴벤조에이트 합제 5종을 이용하였다(Table 1). 실험을 위한 소나무재선충은 잿빛곰팡이병원균을 이용한 실험과 동일한 방법으로 준비하였다. 소나무 가지에 대한 소나무재선충 접종은 실험실로 운반한 가지를 15 cm 내외가 되도록 자른 후 절단면에 파라핀으로 도포하여 수분의 손실을 방지해주었으며, 처리 후 각 가지의 중심부인 7.5 cm 부위를 10 mm 드릴을 이용하여 1 cm 천공을 만들어 주었다. 천공 후 해당 부위에 솜을 넣은 후 1000마리/0.5 mL의 소나무재선충을 피펫으로 접종하였으며, 천공 부위의 건조를 방지하기 위해 파라필름을 이용하여 싼 뒤 가정용 호일로 감싸 암조건을 유지해주었다. 접종이 완료된 가지는 25°C의 항온기에 가지의 윗부분이 위로 향하도록 세워 보관하였고, 30일 후 천공부위를 중심으로 9 cm에 해당하는 부위를 대상으로 전정가위를 사용하여 작은 파편으로 만들어 깔때기법으로 선충을 분리하여 해부현미경으로 조사하였으며 실험은 각 약제 별 3반복을 진행하였다. 한 개의 가지를 한 반복으로 3반복 처리하였다.

소나무재선충에 대한 혼합제의 살선충 반수치사농도를 구하기 위해 Probit 분석하였다(PROC PROBIT, SAS 9.4 user’s guide, 2021).

활동억제율은 동일 제조사에서 생산되는 단제 제품이 있을 경우 해당 제품과 살충제 성분을 혼합제의 활동억제율과 각 농도별에 따라 처리 평균간 차이를 Duncan’s multiple range test로 처리평균간 차이를 분산분석 하였다(PROC ANOVA, SAS/STAT® 9.3 user’s guide, 2011). 만일 동일 제조사에서 생산된 단제 성분이 없는 경우에는 원제사의 제품과 효과를 비교하였다. 단제 제품들에 대한 자료는 Lee et al. (2022)의 자료와 비교하였다.

증식 억제 실험의 경우 reproduction factor (Rf)를 통해 증식율을 검정하는 방법(Rajasekharan et al., 2017)으로 수행하였는데 reproduction factor는 ‘최종 증식선충수/접종시 선충수’로 계산하였다. Rf값은 농도에 따른 처리 평균간 차이를 Duncan’s multiple range test로 처리평균간 차이를 분산분석 하였다.

실험에 사용 한 에마멕틴벤조에이트 성분의 합제 제품은 제조사별로 치사 농도 값(LC_{10, 20, 50, 90, 95})에 유의한 차이를 나타내었다(Table 2, Fig. 1).

Fig. 1. 
Lethal concentration of different emamectin benzoate mixed compound products against the pine wood nematode in multi well plate.

에마멕틴벤조에이트를 기반으로 제조된 합제들의 소나무재선충에 대한 LC₅₀값은 MA처리에서 0.0789 mg/mL이었고, ME처리에서 0.737 mg/mL로 9.46배의 차이를 보였다(Table 1).

각각의 처리별로 LC₅₀ 값을 기준으로 0.05~0.07 mg/mL대와 0.1~0.13 mg/mL대, 0.7 mg/mL대의 세 개의 그룹으로 대별되는 경향을 보였으며 LC₉₀ 이상에서는 0.07 mg/mL대와 0.15~0.2 mg/mL대, 0.9 mg/mL대의 세 개 그룹으로 대별되는 경향을 보였다(Fig. 1).

실험에 사용된 에마멕틴벤조에이트와 살충제 성분의 합제는 제품사별에 따라 선충 활동 억제력에 차이를 보였다(Table 3). 에마멕틴벤조에이트 합제의 경우 희석배수가 증가할수록 선충 활동 억제력은 감소하였으며, 에마멕틴벤조에이트 단제에 비하여 기준량 처리에서 낮은 활동 억제력을 보였다(Table 3).

기준량 처리에서의 제품들 간 선충 활동 억제력에 차이는 2개 제품(MB, ME)의 경우 80% 이상의 활동 억제력을 보였으나 50%대 이하의 활동 억제력을 보이는 제품도 2종류(MC, MD)가 있었다(df=4, 36, F=546.39, P<0.0001)(Table 3).

10배(df=4, 36, F=314.66, P<0.0001)와 40배(df=4, 36, F=141.92, P<0.0001) 희석 농도에서는 기준량에서 활동 억제력이 높았던 제품들의 경우 활동 억제력에 급격한 변화가 없었으나, 효과가 낮았던 그룹에 속하는 제품들은 활동 억제력이 급격히 감소하였다(Table 3). 전체적으로는 80배 희석 시 MB와 ME제품를 제외한 모든 제품에서 무처리와 통계적 유의성이 없었으며(df=4, 36, F=35.97, P<0.0001), 100배 희석에서는 MB를 제외한 나머지 제품들이 무처리 대비 통계적 유의성을 나타내지 않았다(df=4, 36. F=38.20, P<0.0001)(Table 3).

실험에 사용된 에마멕틴벤조에이트와 살충제 성분의 합제는 제품사별에 따라 선충 증식율에 차이를 보였다(Fig. 2, 3). 증식 실험 결과 기준량과 10배 희석한 농도에서는 증식이 되지 않아 그래프로 제시하지 않았으며, 기준량의 100배 희석한 농도에서부터 제품별로 증식수에 차이를 보였다. 전체적으로 배지 접종의 경우(Fig. 2)가 가지 접종(Fig. 3)보다 소나무재선충의 증식율이 상대적으로 높았다. 약제를 권장량의 100배로 희석하여 가지에 접종했을 때 ME제품이 가장 낮은 증식 억제 효과를 보였다(Fig. 3A)(df=4, 10, F=54.2, P<0.0001). 배지에서도 ME제품이 가장 낮은 증식 억제 효과를 보였으나 모든 처리구에서 무처리와 유의한 차이를 보였다(Fig. 3B) (df=4, 20, F=92.65, P<0.0001).

Fig. 2. 
Rate of reproduction in pine twigs after treatment with different emamectin benzoate mixed compound formulations.

(A); 200,000 fold dilution, (B); 2,000,000 fold dilution.* MA has different dilution (recommended rate was 3000 fold); thus, it couldn’t be analyzed together with other emamectin benzoate mixed compound formulations.

Fig. 3. 
Rate of reproduction on Botrytis cinerea after treatment with different emamectin benzoate mixed compound formulations.

(A); 200,000 fold dilution, (B); 2,000,000 fold dilution.* MA has different dilution (recommended rate was 3000 fold); thus, it couldn’t be analyzed together with other emamectin benzoate mixed compound formulations.

권장량의 1000배로 희석하여 처리하였을 경우, 각 접종 방식에 따른 증식 억제율은 무처리구 대비 억제되었으나 100배 희석농도에 비해 상대적으로 높은 증식 수를 보였다(Fig. 2, 3). 가지 접종에서는 ME제품이 가장 낮은 억제 효과를 보였다(df=4, 10, F=7.82, P=0.0040). 배지 접종 실험에서도 유사한 결과를 보여 ME제품이 가장 낮은 억제 효과를 보였다(df=4, 20, F=7.35, P=0.0008).

MA제품은 희석배수를 3000배로 수행하여 다른 처리구와 같이 통계 분석할 수 없어 reproduction factor로 비교하면 100배나 1000배 희석 시 0.181~2.075로 희석배수가 타 제품들에 비해 높게 희석했음에도 불구하고, 가장 우수한 증식 억제 효과를 나타내었다(Fig. 2, 3).

동일 기업에서 제조되어 등록된 에마멕틴벤조에이트 합제의 경우 MC제품을 제외한 MB제품(에마멕틴벤조에이트+아세타미프리드)과 MD제품(에마멕틴벤조에이트+아세타미프리드), ME제품(에마멕틴벤조에이트+디노테퓨란) 모두 에마멕틴벤조에이트 단제 제품들에 비해 LC₅₀값과 LC₉₅값이 높아 단제에 비하여 효과가 낮았다(Table 4).

선충 활동 억제 효과의 경우도 실험에 사용한 전 희석 배수(1/2,000~1/2,000,000배) 처리에서 합제가 단제에 비해 선충 활동 억제 비율이 낮았으며, 살선충 효과가 더 좋았던 MC제품 또한 단제보다 활동 억제 비율이 낮았다(Table 4).

증식 억제 실험의 경우 증식이 이루어진 농도대인 1/200,000, 1/2,000,000배에서 합제가 단제에 비해 선충 증식 억제 효과가 낮았으며, MC제품 또한 단제보다 증식 억제가 낮았다(Table 4).