Editorial Board

본 연구에 사용한 시험물질은 천연제초활성 소재 AN-2064 배양여액으로 건조된 분말상태를 한국화학연구원으로부터 제공받아 사용하였다. AN-2064 배양여액은 토양방선균 균주(Streptomyces achromogenes)로 GSS 액체배지(Glucose 2%, soluble starch 1%, soybean meal 2.5%, beef ext. 0.1%, yeast ext. 0.4%, NaCl 0.2%, K₂HPO₄ 0.025%, CaCO₂ 0.2%)에 접종하여 27°C에서 7일간 진탕배양(160 rpm)하였다.

급성독성 및 자극성시험에 사용한 SPF 랫드(Sprague Dawley rat, 8주령 암컷)와 토끼(New Zealand White rabbit, 12주령 암컷)는 한림실험동물센터(경기도 화성 소재)에서 구입 후 7일 이상의 순화기간을 거쳐 정상적인 동물만을 실험에 사용하였다. 독성실험은 국립농업과학원 동물실험윤리위원회 승인 후(승인번호: NAS-202103) 국립농업과학원 동물사육시설(전북, 완주군)에서 수행되었으며, 동물보호법을 준수하였다.

동물사육실은 온도 20 ± 3°C, 상대습도 50 ± 10%, 환기횟수 10~15회/시간, 조명시간 12시간(형광등 조명 오전 8시~오후 8시), 조도 200~300 Lux로 유지하였다. 랫드의 경우 랫드용 스테인레스 망사육장(300 W× 500 L × 200 H mm)에 개별 사육하였다. 토끼는 토끼용 스텐레스 사육상자(380 W× 500 D × 300 H mm)에 1마리씩 넣어 사육하였고, 랫드와 토끼 모두 음수와 사료는 자유로이 급여하였다. 사료는 랫드용 고형사료(5053 Pico Lab Rodent Diet, Richmond, USA)와 토끼용 고형사료(38302 Purina rabbit Diet, Seoul, Korea)를 각각 자유 섭취시켰으며, 음수는 상수도수를 자유섭취시켰다.

랫드에 대한 급성경구독성시험은 OECD TG423 (OECD, 2001) ‘Acute oral toxicity - acute toxicity class method’ 및 농촌진흥청 고시(RDA, 2021) ‘농약 및 원제의 등록기준, [별표12] 인축 독성 시험기준과 방법’의 급성경구독성시험에 준하여 시험하였다. 순화기간을 거친 후 건강한 암컷 랫드 12마리를 4단계로 나누어 시험하였으며, 단계별로 300, 300, 2,000, 2,000 mg/kg bw 용량을 순차적으로 투여하였다. 투여액량은 10 mL/kg으로 하였고, 개체별 투여용량은 절식 후(투여당일)의 체중을 기준으로 산출하였다. 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 단회 강제 투여하였다. 모든 동물은 투여 전 약 16시간 이상 절식하였으며, 투여 후 4시간 후에 사료를 급여하였다. 시험물질 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4시간에, 그리고 14일 동안 1일 1회씩 일반증상의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유·무를 관찰하였으며 시험물질 투여 전과 투여 후 2일, 7일 및 14일에 개체별 체중을 측정하였다. 실험종료 후, 모든 동물은 이산화탄소 흡입마취 후 개복하여 랫드의 복대동맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액 검체는 animal blood counter (scil Vet ABC, France)를 활용하여 complete blood count (CBC) 항목으로서 total leukocyte count (WBC), RBC count, hematocrit (HCT), (HGB), mean cell volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH), mean cell hemoglobin concentration (MCHC), RBC distribution width (RDW), platelet (PLT), mean platelet volume (MPV), hemoglobin (Hb), lymphocyte (LYM), monocyte (MON), 및 glanulocyte (GRA)을 측정하였다.

랫드에 대한 급성경피독성시험은 OECD TG402 (OECD, 2017) ‘Acute dermal toxicity’ 및 농촌진흥청 고시 농촌진흥청 고시(RDA, 2021) ‘농약 및 원제의 등록기준, [별표12] 인축 독성 시험기준과 방법’의 급성경피독성시험에 준하여 시험하였다. 순화기간을 거친 후 건강하고 깨끗한 피부를 지닌 암컷 랫드 5마리를 4단계로 나누어 시험하였으며, 단계별로 200, 1,000, 2,000, 2,000 mg/kg bw 용량을 순차적으로 투여하였다. 투여전일 제모기((주)조아스, 경기 남양주)를 이용하여 등쪽 피모를 넓게 제모하였으며(약 6 × 6 cm), 제모부위의 5 × 5 cm 넓이를 투여부위로 하였다. 시험물질을 거즈에 도포한 후 투여하였으며 비자극성 의료용 테이프(Tegarderm, 3M)로 부착하고, Coban^TM tape ((주)한국쓰리엠, 서울)으로 고정하였다. 첩포 24시간 경과 후, 시험물질 첩포를 제거하고 피부에 남은 잔류물을 멸균미온수를 이용하여 닦아내었다. 시험물질 첩포 제거 후 30분, 1, 2, 3, 4시간에, 그리고 14일 동안 1일 1회씩 일반증상의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유·무를 관찰하였으며 시험물질 투여 전과 투여 후 2일, 7일 및 14일에 개체별 체중을 측정하였다. 실험종료 후, 모든 동물은 이산화탄소 흡입마취 후 개복하여 랫드의 복대동맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액 검체는 animal blood counter (scil Vet ABC, France)를 활용하여 complete blood count (CBC) 항목으로서 total leukocyte count (WBC), RBC count, hematocrit (HCT), (HGB), mean cell volume (MCV), mean cell hemoglobin (MCH), mean cell hemoglobin concentration (MCHC), RBC distribution width (RDW), platelet (PLT), mean platelet volume (MPV), hemoglobin (Hb), lymphocyte (LYM), monocyte (MON), 및 glanulocyte (GRA)을 측정하였다.

토끼에 대한 피부자극성시험은 OECD TG404 (OECD, 2015) ‘Acute Dermal Irritation/Corrosion’ 및 농촌진흥청 고시(RDA, 2021) ‘농약 및 원제의 등록기준, [별표12] 인축 독성 시험기준과 방법’의 피부자극성시험에 준하여 시험하였다. 순화기간을 거친 후 시험물질 투여 24시간 전에 전기 제모기((주)조아스, 경기 남양주)를 이용하여 토끼의 배부 피부에 상처가 나지 않도록 15 cm× 15 cm 넓이로 제모하여, 건강하고 깨끗한 피부를 지닌 암컷 토끼 3마리를 1군으로 구성하였다. 토끼 1마리를 이용한 초기시험에서 피부부식성을 나타나지 않아, 토끼 2마리를 추가로 이용해 확인시험을 수행하였다. 시험물질은 시험물질 5 g에 멸균증류수를 이용하여 총량을 5 mL로 맞추고 교반하여 현탁시킨 후 투여부위 당 0.5 mL씩을 사용하였다. 시험물질 처치 후 비자극성 의료용 테이프(Tegarderm, 3M)로 부착하였으며, Coban^TM tape ((주)한국쓰리엠, 서울)으로 고정하였다. 첩포 4시간 경과 후, 시험물질 첩포를 제거하고 피부에 남은 잔류물을 멸균미온수를 이용하여 닦아내었다. 피부반응은 첩포를 제거한 후 홍반과 가피형성, 부종의 정도를 관찰하여 농촌진흥청 고시 ‘피부반응평가표’에 따라 평가한 후 1차 자극지수(P.I.I., primary irritation index)를 산출하였으며, 피부반응의 평가는 농촌진흥청 고시 ‘피부반응평가기준’에 준하여 실시하였였다.

피부반응의 정도는 첩포를 제거한 후 1, 24, 48, 및 72시간에 관찰하였다. 24시간과 72시간의 자극정도를 시험물질 첩포 제거 후 3일까지 일반증상의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였으며, 시험물질 투여 전과 투여 후 1일, 2일 및 3일 후의 개체별 체중을 측정하였다.

토끼에 대한 안점막자극성시험은 OECD TG405 (OECD, 2021) ‘Acute Eye Irritation/Corrosion’ 및 농촌진흥청 고시(RDA, 2021) ‘농약 및 원제의 등록기준, [별표12] 인축 독성 시험기준과 방법’의 안점막자극성시험에 준하여 시험하였다. 순화기간을 거친 후 안구에 각막, 결막 및 홍채 등에 손상이 없는 건강한 암컷 토끼 3마리를 1군으로 구성하였다. 토끼 1마리를 이용한 초기시험에서 눈 부식성 또는 심각한 자극성이 나타나지 않아, 토끼 2마리를 추가로 이용해 확인시험을 수행하였다. 시험물질은 시험물질 5 g에 멸균증류수를 이용하여 총량을 5 mL로 맞추고 교반하여 현탁시킨 후 사용하였다. 시험물질의 투여는 토끼를 고정한 후 우안의 하안검을 가볍게 잡아당기고 결막낭 내에 시험물질 0.1 mL씩을 투여하였으며, 좌안은 대조로 투여하지 않았다. 시험물질 투여 후 시험물질의 누출을 방지하기 위해 양안검을 잡아 약 1초간 폐안시켰으며, 세안을 실시하지 않았다. 안점막 반응의 평가는 농촌진흥청 고시 내 ‘안반응 평가표’에 준하여 실시하였고, 시험물질 투여 후 실험종료일까지 각막, 홍채 및 결막 등의 이상 유무를 관찰하였다. 각 관찰시기의 개체별안점막자극지수(0~110점 범위, The individual Index of Ocular Irritation (I.O.I)를 산출하였고, 이를 이용하여 각 시기별 평균안점막자극지수(M.O.I., Mean Ocular Irritation Index)를 산출하여 평균안점막자극지수 중 최고치를 급성안 점막자극지수(A.O.I., Acute Ocular Irritation Index)로 하였다. 시험물질 투여 후 9일까지 일반증상의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였으며, 시험물질 투여 전과 투여 후 1일, 2일 및 3일 후의 개체별 체중을 측정하였다.

8주령 암컷 랫드에 시험물질 AN-2064 배양여액을 약량 수준 300 및 2,000 mg/kg bw으로 경구투여 결과, 4단계 시험까지 사망한 개체는 없었으며, 모든 실험동물에서 특이한 일반증상 또는 시험물질과 관련된 이상 증상은 관찰되지 않았다(Table 1). 체중측정 결과, 2000 mg/kg 용량으로 투여된 3단계와 4단계 시험에서 시험물질 투여 후 2일까지 체중감소가 나타났으나 이후 정상적으로 회복되었다(Table 2). 실험종료 시 부검 결과, 모든 투여군에서 육안적 이상소견은 관찰되지 않았으며, 혈액학적 변화 역시 관찰되지 않았다(Table 3).

8주령 암컷 랫드에 시험물질 AN-2064 배양여액을 약량 수준 200, 1,000 및 2,000 mg/kg bw으로 경피투여 결과, 4단계 시험까지 사망한 개체는 없었으며, 모든 실험동물에서 특이한 일반증상, 체중변화 또는 시험물질과 관련된 이상 증상은 관찰되지 않았다(Table 4, 5). 실험종료 시 부검 결과, 모든 투여군에서 육안적 이상소견은 관찰되지 않았으며, 혈액학적 변화 역시 관찰되지 않았다(Table 6).

토끼 1마리를 이용한 피부 부식시험 결과, 시험물질 첩포 제거 후 3분, 1시간 및 4시간에 투여부위에서 부식 또는 자극이 관찰되지 않았다. 초기시험에서 부식 영향이 보이지 않아 토끼 2마리를 추가로 이용하여 확인시험을 수행하였다. 확인시험 결과, 시험물질 첩포 제거 후 4시간에 투여부위에 홍반, 부종 및 가피의 피부자극이 전혀 관찰되지 않았다. 이상의 결과로, 시험물질의 1차 피부자극성을 Draize의 피부 자극정도에 따라 분류하면, 투여 후 24시간 및 72시간의 평균점수는 모두 0.0으로 1차 피부자극지수(P.I.I.)는 0.0으로 비자극성(Non irritant)을 나타내는 물질로 판단된다. 실험기간 동안 사망 또는 특이적인 변화를 나타내는 동물은 없었으며, 시험물질에 기인한 체중 감소가 나타나지 않았다(Table 7, 8).

토끼 1마리를 이용한 눈 부식시험 결과, 시험물질 적용 후 1시간에 투여 부위에 심한 눈 손상 및 부식이 관찰되지 않았다. 초기시험에서 부식 영향이 보이지 않아 토끼 2마리를 추가로 이용하여 확인시험을 수행하였다. 확인시험 결과, 1마리에서 시험물질 적용 24시간에 투여부위에 발적의 자극이 관찰되었으며, 48시간에 3마리 모두에서 투여부위에 결막 발적, 부종, 배출물의 안점막자극이 관찰되었다. 관찰된 자극들은 9일째 모두 회복되었다. M.O.I.는 시험물질 적용부위에서 1시간, 24시간, 48시간 및 72시간에, 각각 0.0, 0.7, 8.7, 6.7로 산출되었으며, A.O.I.는 8.7로 판정되었다(Table 9). 실험기간 동안 사망 또는 특이적인 변화를 나타내는 동물은 없었으며, 시험물질에 기인한 체중 감소가 나타나지 않았다(Table 7, 8).