Editorial Board

경기도 인근의 버섯재배 농가로부터 5종류의 버섯(팽이버섯, 잎새버섯, 느타리버섯, 신령버섯, 양송이버섯)재배한 후 1차 발효과정을 거친 버섯폐배지를 1 kg씩 수거하여 바람이 잘 통하는 음지에서 4일간 말렸다. 잘 건조된 시료를 식물 분쇄기로 1차 파쇄하여 가는 채(10 mm)로 한번 걸러 실험에 사용하였다.

실험에 사용된 식물병원균은 오이역병균(Phytophthora capsici, KACC 40181), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides, KACC 40690), 오이잘록병(Rhizoctonia solani AG-1B, KACC 40111), 마늘흑색썩음균핵병(Sclerotium cepivorum, KACC 40582), 오이흑성병(Cladosporium cucumerinum) 등 5종으로 국립농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양 받아 사용하였다. 5종의 식물병원균은 PDA (20 g Potato, 18 g dextrose, 18 g Agar, 1000 ml 멸균수) 배지에서 배양하였고 배양조건은 병원균의 최적생육조건을 고려하여 20~25°C에서 7일간 배양하여 사용하였다.

키틴 분해 능력이 뛰어난 방선균을 분리하고자 Lee et al. (1998)과 Kim et al. (2007)이 보고한 방선균 분리 방법을 병행하여 사용하였다. 우선 수집한 버섯폐배지를 48시간 동안 풍건한 후, 10 g씩 개량하여 90 ml의 멸균증류수가 들어있는 삼각플라스크에 넣고 65°C 항온수조에서 120 rpm 속도로 2시간 동안 교반하였다. 위 버섯폐배지 시료 상등액 50 ml를 3% colloidal chitin이 들어 있는 450 ml의 Chin배지(2.64 g (NH₄)₂SO₄, 2.38 g KH₂PO₄, 5.65 g K₂HPO₄, 1.5 g MgSO₄·7H₂O, 6.4 mg CuSO₄·5H₂O, 2.5 mg FeSO₄·7H₂O, 2.5 mg MmCl₂·H₂O, 2.5 g ZnSO₄·7H₂O, Agar 20 g, 증류수 1000 ml, pH 8.0)가 들어 있는 삼각플라스크에 넣은 후 거품이 발생하지 않도록 조심해서 교반 후 일정한 량을 페트리디쉬에 분주한 후 실온에서 식힌 후 37°C 항온인큐베이터에서 7일간 배양 후, 배지에 Clean zone을 형성하여 키틴 분해능력을 보이는 균주를 멸균된 needle로 수집하여 3% colloidal chitin이 들어 있는 Chin배지에 삼분 도말하여 키틴분해 능력을 재 검정하여 키틴분해 균주를 2차적으로 선발하였다.

본 실험에서 2차적으로 키틴분해 능력이 있는 것으로 확인된 방선균 균주의 주요 식물병원균에 대한 항균력을 검정하고자, 7일간 배양한 방선균 균주별로 멸균된 미생물 접종 루프(loop)에 묻혀 PDA 배지 중앙에 선을 그어 접종하였다. 방선균이 접종된 PDA배지의 중앙에서 2 cm 간격으로 5일간 배양한 각 식물병원균의 균사 disc를 화염 소독한 직경 8 mm corker borer로 균일하게 절단 후 올려놓고 28°C에서 6일간 대치 배양한 후 균사생육 저해 정도를 측정하여 항균력을 조사하였다(Hwang 등, 2006).

시험에 사용한 오이는 싱싱백다다기(Cucumis sativus) 품종으로 종자를 시중에서 구입하여 사용하였으며, 24시간 동안 멸균증류수에서 불린 후, 바로커상토가 들어 있는 72공육묘상자에 파종하여 48시간 동안 포화습도 상태에서 발아를 유도하였고 제2본엽이 전개될 때까지 육묘상자에서 키웠다. 파종 후 45일이 지난 오이 식물체를 바로커상토가 들어있는 직경 7 cm² 비닐포트에 정식 후, 낮 온도 25 ± 5°C, 밤 온도 15 ± 5°C로 재배조건을 유지하면서 온실에서 오이 식물체를 재배하였다.

오이 성체에 흰가루병균을 자연 발생시키고자 오이 유묘를 7 cm² 비닐포트에 심어서 이병 식물체 주변에 배치하여 오이 흰가루병균을 지속적으로 발생하도록 유도하였으며, 오이 잎에 흰가루병 병반 면적율이 30% 정도 발병했을 때 오이흰가루병 방제 시험을 수행하였다.

오이 흑성병(C. cucumerinum)의 균사조각을 PDA배지에 치상하여 20°C, 암상태의 항온기에서 5일 동안 배양하여 포자형성을 유도하였다. 포자형성을 광학현미경으로 확인한 후 멸균증류수에 포자를 현탁하여 최종 농도가 1 × 10⁶ conidia/ml이 되도록 농도를 조절한 후 4엽기의 오이 유묘에 분무 접종하였다(Kwon et al., 1999).

방선균 CA-23과 AA-65 균주를 PDB배지에서 10일간 배양한 배양액을 믹서기로 3분간 마쇄한 후, 킴타올(유한킴벌리, 한국)을 사용하여 1차적으로 걸러서 방제실험에 사용하였다. 방선균 배양여액은 고압문부기를 사용하여 오이 잎의 앞면과 뒷면에 흠뻑 적시게 살포하였다. 시험구는 구당 10주씩 4반복으로 처리하였다. 또한 방선균 배양여액 살포 후 3일 간격으로 15일간 병 방제효과를 조사하였다.

고추 역병균(P. capsici)의 균사조각을 V8쥬스배지(50 ml V8 쥬스, 3 g CaCO₃, 18 g Agar, 1000 ml 증류수)에 올려놓고 25°C, 암상태의 항온기에서 1주일 동안 배양한 후에 균총 표면의 공중균사를 제거하고 1일 동안 형광등 아래에 두면 유주자낭이 형성된다. 유주자낭을 배지로부터 수확하고 4°C에서 2시간 정도 두면 유주자가 유출되면 고추 1주당 50 ml 분주하여 접종한다.

방선균 CA-23과 AA-65 균주를 PDB배지에서 10일간 배양한 배양액을 믹서기로 3분간 마쇄한 후, 방선균 배양여액 50 ml씩을 고추근권 주위에 고루 처리하였다. 시험구는 구당 10주씩 4반복으로 처리하였다. 또한 방선균 배양여액 분주 후 3일 간격으로 15일간 병 방제효과를 조사하였다.

버섯폐배지로부터 분리한 키틴분해 방선균인 CA-23과 AA-65균주의 동정을 위해 16S rDNA 유전자 염기서열 분석을 위해 Chen and Goodfellow (1995)이 사용한 2개의 프라이머 ITS 8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')과 ITS 1492R (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 조건은 최종농도 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 200 nM dNTPs, 10 pmol의 ITS 8F와 ITS 1492R 프라이머, 0.1 unit의 rTaq DNA polymerase (Takara, Japan)를 사용하였으며, 50 μl로 반응용량을 맞추었다. PCR 반응조건은 predenaturation (95°C, 5분), denaturation (95°C, 30초), annealing (50°C, 30초), extension (72°C, 30초), total cycle (35 cycles), final extension (72도, 10분) 수행하였으며, 증폭된 PCR 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide로 염색하여 UV-transilluminator에서 밴드를 확인하였다. 확인된 밴드는 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)를 사용하여 분리 정제하였고 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 클로닝한 후 M13F와 M13R 프라이머를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster, CA, USA)를 이용하여 결정하였다.

시험별 통계분석은 SAS (ver. 8.0)을 이용하여 처리한 두 종류의 방선균의 고추 역병, 오이 흰가루병, 오이 흑성병 방제효과 및 고추 생육촉진효과에 대하여 5% 수준에서 유의성을 검증하였다.

경기도 지역에서 수집한 5종류의 버섯(팽이버섯, 잎새버섯, 느타리버섯, 신령버섯, 양송이버섯) 폐배지로부터 키틴(chitin) 첨가 배지를 이용하여 키틴분해 능력이 있는 것으로 보이는 방선균을 1차 선발하였다. 분리한 방선균의 숫자는 신령버섯(167.8 cfu/g) >양송이버섯(23.0~26.6 cfu/g) 순으로 높게 나타났으며, 팽이버섯, 잎새버섯, 느타리버섯 폐배지에서는 전혀 방선균이 분리되지 않았다(Fig. 1).

Fig. 1. 
Isolation of chitinolytic isolates of Actinomycetes spp. from five kinds of waste mushroom media.

본 실험에서 팽이버섯, 잎새버섯, 느타리버섯 폐배지에서 방선균이 전혀 분리되지 않은 것은 신령버섯이나 양송이버섯을 재배에 사용되는 배지는 볏짚과 사탕수수, 계분 등을 혼합하여 퇴비화하여 주로 균상재배를 이용하며 80~90°C의 고온에서 살균한 후 벗을 재배하기 때문에 고온에서 살아남은 방선균의 밀도가 상대적으로 높았던 것으로 사료된다(Kim et al., 2002). Lee et al. (2014)은 양송이 재배농가의 복토재료 살균온도에 따른 미생물 변화를 조사하였더니 중 온성 방선균의 경우 복토 15일에 급격히 증가하여 복토 22일에 가장 높은 밀도를 보인 것으로 보고하였다. 또한 Song et al. (2001)에 의하면 버섯페배지로부터 41개의 방선균 균주를 분리하였는데 16S rRNA분석결과 Streptomyces 속과 Thermoactinomyces 속에 속하는 것으로 보고한 바 있다.

일반적으로 방선균을 분리하는데는 주로 토양을 시료로 하고 토양에 존재하는 방선균의 수와 형태는 지리적 위치, 토양온도, 토양형태, 토양pH, 유기물질 성분 등에 의해 큰 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Goodfellow and Williams, 1983).

본 실험에서는 섬유소가 가장 많이 존재할 것으로 생각되어 버섯폐배지를 대상으로 방선균을 분리하였더니 폐배지에 사용된 재료의 종류에 따라 다양한 방선균 분리 양상을 보이는 것으로 사료된다.

대부분의 버섯은 발효된 유기물이 퇴적된 곳에서 양분을 흡수 이용하여 생장하는 습성이 있어 인공재배에 있어서 특수하게 제조된 배지에서 필요한 양분을 공급받아야 한다. 느타리버섯은 볏짚배지, 폐면배지를 이용한 균상재배와 톱밥배지(미송톱밥: 미강=80 : 20(w/w), 미송톱밥 :비트펄프 :면실박-50 : 30 : 20), 면실박, 비트펄프 등을 혼합하여 이용하는 병재배, 봉지재배, 상자재배 등 다양한 방법으로 재배되고 있다(Ju et al., 2007). 양송이, 신령버섯의 경우 우리나라와 일본, 중국에서는 볏짚과 사탕수수, 계분 등을 혼합하여 퇴비화하여 주로 균상재배를 하는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2002). 팽이버섯의 경우 초기에는 미송톱밥, 미강 위주의 배지재료에서 콘코브, 면실박, 면실피, 비트펄프 등 다양한 수입재료들을 혼합하여 병재배를 하는 것으로 보고되었다(Cheong et al., 2010).

따라서, 본 실험에서도 5종류의 버섯 폐배지마다 방선균의 분리밀도의 차이를 보이는 것은 버섯을 재배하기 위하여 사용되는 배지원의 종류가 다르기 때문이라 사료된다.

5종의 버섯 폐배지로부터 분리한 방선균 균주 91개의 항균력과 2차적으로 키틴분해 능력을 조사하였더니 대부분의 분리 균주들은 키틴분해 능력을 나타내었으나, 7개의 균주(AC001, AC015, AC025, AC037, AC040, AC065, AC067)는 전혀 키틴분해 능력을 보이지 않았다(Fig. 2). 91개의 분리균주 중 AC005, AC007, AC008, AC012, AC029, AC032, 5개의 균주는 키틴분해 능력과 4개의 식물병원균에 대한 항균력이 매우 뛰어난 것으로 나타났다 (Fig. 2).

Fig. 2. 
Estimation of chitinolytic and antifungal activity of 91 isolates of Actinomycetes spp. isolated from a waste mushroom media.

Fig. 2와 같이 버섯폐배지로부터 분리한 91개의 방선균 균주에 대해 키틴 분해능력과 4종의 식물병원균에 대한 항균력을 기준으로 3개의 그룹으로 분류하였더니, 키틴분해 능력과 항균력이 뛰어난 그룹(CA; chitinolytic antifungal actinomycetes)으로 CA-23, CA-24, CA-39이 분류되었고 키틴분해 능력은 없으나 항균력이 뛰어난 그룹(AA; Antifungal actinomycetes)으로 AA-15, AA-65, AA-67이 분류되었으며, 키틴분해 능력이 뛰어나고 항균력이 있는 그룹(Ca; chitinolytic actinomycetes)으로 Ca-07, Ca-12, Ca-05가 분류되었다(Table 1).

방선균은 토양, 바다, 유기물질 등 다양한 서식처에 존재할 수 있는 환경적으로 매우 넓게 분포되어 있는 미생물이다(McNeil and Brown, 1994; Park et al., 2012). 퇴비 발효 시 내부 온도가 70~80°C 일 때 퇴비 내 우점 미생물은 고온성 세균과 고온성 방선균이며, 퇴비를 많이 넣은 토양은 병해 억제 능력이 바로 방선균에 의하여 생성된 다량의 항생물질 때문인 것으로 알려져 있다. 특히, Michael et al. (1992)은 바다모래로부터 분리한 키틴 분해능력이 있는 방선균 116개 균주 중에서 85개의 균주가 항균력을 가지는 것으로 보고하였다.

본 실험결과에서도 키틴분해 능력이 뛰어난 방선균 균주일수록 4종류의 식물병원균에 대한 균사생육억제능력이 뛰어난 것으로 조사되었다. 키틴은 방선균의 중요한 영양원이 되며 키틴을 이용하는 대부분의 방선균들은 복잡한 외부비체계를 가지고 있기 때문에 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능력이 높게 나타나는 것으로 사료된다.

키틴분해 능력과 항균력이 뛰어난 그룹(CA)에서 선발한 CA-23 균주와 키틴분해 능력은 없으나 항균력이 뛰어난 그룹(AA)에서 선발한 AA-65 균주를 고추 유묘에 처리한 후 역병균에 대한 방제효과를 조사하였더니 무처리의 경우 역병균 유주자를 접종 후 4일째부터 시들음 증상을 보이더니 7일 후부터는 지제부에 수침상의 병징이 나타나기 시작하였고 15일 후에는 지제부에 괴사 증상을 보였다. 반면에 두 종류의 방선균 배양액을 처리한 고추는 전혀 역병이 발생하지 않았으며 15일 후 역병 방제가를 조사하였더니 AA-65균주는 89.6%이었고 CA-23균주는 100%로 나타났다(Table 2).

Ahn and Hwang (1992)은 고추재배지의 근권으로부터 P. capsici와 Magnaporthe grisea에 길항효과가 있는 방선균 중 고추 역병균의 균사생장을 5 mm 이상 저지원을 형성하는 32개의 균주를 고추 역병에 대한 길항력을 검정하였더니 균주마다 다양한 길항효과를 보이는 것으로 보고하였다. 특히, 길항 방선균 배양액의 Butanol 추출액이 P. capsici와 M. grisea의 균사생육을 억제하는 것으로 보아 항균물질이 강하게 생성되는 것으로 보고하였다.

본 실험에서는 키틴분해 능력이 뛰어난 CA-23와 키틴분해 능력은 낮으나 항균력이 뛰어난 AA-65균주 모두 고추역병균에 대하여 뛰어난 방제효과를 나타내었는데 방선균이 식물병원성 곰팡이 대한 항균능력을 가지는 것은 대부분 항생물질의 생성과 관련되어 있는 것으로 보고되어 있다, 특히 Chitinase와 같은 외분비 가수분해효소의 영향이 큰 것으로 알려져 있으므로 추후 정밀한 실험이 진행되어야 하겠지만 CA-23은 Chitinase를 분비하고 키틴분해 능력이 없는 AA-65균주는 다른 항생물질을 가지고 있는 것으로 사료된다.

오이 흰가루병을 방제하고자 키틴분해 능력과 항균력이 뛰어난 CA-23 균주와 항균력이 뛰어난 AA-65 균주 배양액을 흰가루병이 발생한 오이 엽면에 처리하였더니, 무처리 대비 AA-65균주의 방제가는 79.4%이었고 CA-23균주는 87.3%로 1회 처리 후 2주까지 효과가 지속되는 것을 확인하였다(Table 3).

고추 역병과 오이 흰가루병에 뛰어나 방제효과를 보인 방선균 CA-23 균주와 AA-65 균주 배양액을 오이 검은별무늬병을 접종한 오이 엽면에 처리하였더니, 무처리대비 AA-65균주의 단독 또는 안정제인 0.3% 난황유를 혼합하여 처리하였더니, 방선균 배양액 단독처리는 CA-23균주는 44.2%, AA-65균주는 41.0%로 낮은 방제가를 보였으나 안정제로 0.3% 난황유를 혼합하여 처리하였을 때는 CA-23균주는 98.8%, AA-65균주는 98.0%로 매우 높은 방제효과를 보였다(Table 4).

Cho (2005)는 streptomyces SH-09가 오이흰가루병(Sphaeritheca fusca)에 대해 길항력이 강하고 실제 균배양액을 이용한 실험에서도 흰가루병 방제효과가 높고 다른 식물병원균에 대해서도 강한 활성을 보여 미생물 농약으로의 개발이 가능할 것으로 보고하였다. Chi et al. (2012)은 식물근권으로부터 분리한 Streptomyces padanus IA70-5 균주가 in vitro에서 Colletotrichum acutaum의 균사생장, 포자발아, 그리고 부착기 형성을 효과적으로 억제하였으며, 고추 과실에 대하여 고추 탄저병원균 접종 전 IA70-5 배양액 처리 시 약 90%의 탄저병 억제효과를 나타내는 것으로 보고하였다.

본 실험에서는 방선균 CA-23과 AA-65균주 모두 오이에 발생한 흰가루병은 효과적으로 방제하였으나 CA-23과 AA-65균주 단독처리로는 오이 검은별무늬병에 대한 방제효과가 낮은 것으로 나타났다. 이러한 단점을 보완하고자 농가에서 친환경자재로 널리 알려져 있는 0.3% 난황유와 혼합하여 처리하였더니 검은별무늬병에 대한 방제효과가 높게 나타났는데 이러한 결과는 난황유의 포자발아 억제능력과 방선균의 항균력이 더해져 상승효과를 낸 것으로 판단된다. 이러한 혼합제의 처리는 향후 농가현장에서 길항미생물을 적용할 때 보다 안정적으로 식물체에 정착시킬 수 있는 좋은 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3. 
Phylogentic analysis of 16S rRNA sequence of Streptomyces sp. AA-65 and CA-23 isolated from the waste mushroom media. Bootstrep percentage (from 1000 replications) > 50% are shown at branch points analyzed by with MEGA 6 program ().

키틴분해 능력과 항균력이 뛰어난 CA-23 균주와 항균력이 뛰어난 AA-65 균주는 고추 역병균에 대해 항균력이 뛰어날 뿐만 아니라, 고추의 생체중이 무처리 대비 CA-23균주는 64.7% 증가하였으며 AA-65균주는 2배이상 증가하였으며 고추의 과중은 CA-23균주는 17.6% 증가하였으며 AA-65균주는 32.4% 증가 하였다(Table 5).

Han et al. (2012)은 비농경지의 식물 근권토양에서 분리한 4개의 방선균 균주인 MSS181, MSS269, MSS275, MSS276가 식물체의 초기생육촉진 효과가 있으며 MSS275균주는 P. capsici, F. oxysporum, R. solani, S. sclerotiorum에 강한 항균활성을 보이는 것으로 보고하였다. Yandigeri et al. (2015)은 인도의 Chilika 호수에서 분리한 S. vinaceusdrappus S5MW2는 실내실험에서 R. solani에 대하여 균사생육 억제 능력이 뛰어났고 키틴 분해능력이 뛰어난 방선균으로 토마토에 R. solani균을 접종하고 방선균 S5MW2을 처리하였을 때 토마토 시들음병 방제뿐만 아니라 토마토의 생육을 촉진하는 것으로 보고하였다. 본 연구결과에서도 길항능력이 우수한 CA-23과 AA-65 균주 모두 토마토와 같은 가지과 작물인 고추의 생육을 촉진시켰으며 고추역병에 대한 방제효과도 우수한 것으로 나타났다.

최근 친환경 유기농산물 중 저농약인증제도가 폐지됨으로써 유기농산물의 안정적인 생산기반을 조성하기 위해서는 병해충을 친환경적으로 방제할 수 있는 유기농자재의 개발이 절실히 필요하다(Lee, 2012; Thomashow and Weller, 1996). 식물병 방제를 위하여 키틴분해 능력을 지닌 생물적 방제인자를 적용하는 기술은 매우 중요한 것으로 보고되어 있다(Cho et al., 2007; Han et al., 2012; Kim et al., 2007; Kishore et al., 2005; Michael et al., 1992; Pati et al., 2011; Yandiferi et al., 2015).

버섯 폐배지로부터 분리한 병원균의 분자생물학적인 동정을 위해 병원균의 rDNA의 ITS부분을 PCR로 증폭하여, ITS rDNA 영역의 염기서열(1,200 bp)을 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였더니, 키틴분해 항균성(Chitinolytic Antifungal Actinomycetes) 방선균인 CA-23과 항균성(Antifungal Actinomycetes) 방선균인 AA-65은 Streptomyces diastatius subsp. ardesiacus NRRL B-1773) (GenBank: DQ026631)과 Streptomyces xiamenensis MCCC 1A01550(T) (GenBank: EF012099.1)에 대하여 각각 100%의 상동성을 나타내었다. 키틴분해 방선균인 CA-23과 AA-65에 관련된 분류 군들과의 유전적 상관관계를 알아보기 위하여 MEGA 6.0 프로그램을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 유연관계를 분석한 결과, Streptomyces sp.을 다시 확인하였다.

따라서, 본 연구에서는 방선균의 좋은 먹이가 되는 섬유질이 풍부한 버섯폐배지로부터 분리한 키틴분해 방선균 Streptomyces sp. CA-23과 AA-65균주는 오이 흰가루병, 검은별무늬병, 고추 역병에 대한 방제효과와 작물의 생육촉진 효과가 뛰어난 것으로 그 효과가 인정되었다. 이러한 기초연구를 토대로 농가현장에서 활용할 수 있도록 적용기술과 방선균 CA23과 AA-65균주가 분비하는 항균성 물질에 대한 후속연구가 뒷받침된다면, Streptomyces sp. CA23과 AA-65균주는 유기농 병해관리를 위한 유기농자재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.