Editorial Board

Isoxaflutole (98.5%)과 대사산물인 diketonitrile (99.5%)의 표준품은 Bayer Crop Science에서 제공받아 분석물질로 사용하였고(Table 1), acetonitrile (ACN), methanol, n-hexane, dichloromethane (DCM) 등은 HPLC 등급으로 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 또한 hydrochloric acid (HCl), sodium chloride (NaCl)는 Wako(Osaka, Japan)로부터, 여과보조제(celite 545) 및 anhydrous sodium sulfate (Na₂SO₄)는 Merck (Darmastadt, Germany)로부터 구입하였고 acetic acid, formic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 추출에는 교반진탕장비(MMV-1000W, Eyela, Korea)를 사용하였고, 추출액 pH 조절에는 pH 미터기(Docu-pH plus meter, Sartorius, Germany)를 사용하였다. 검체는 식품의약품안전처에서 잔류농약 시험법 개발 시 고려하는 대표농산물 5종 감귤(과일류), 감자(서류), 고추(과채류), 대두(콩류), 현미(곡류) 모두 무농약 농산물을 구입하여 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 -50^oC에 보관하고 실험에 사용하였다.

Property	Isoxaflutole	Diketonitrile
Structure
IUPAC name	5-cyclopropyl-1,2-oxazol-4-yl α,α,α-trifluoro-2-mesyl-ρ-tolyl ketone	2-cyclopropylcarbonyl-3-(2-methylsulfonyl)-4-tri- fluoromethylphenyl)-3-oxopropanenitrile
CAS No.	141112-29-0	143701-75-1
Classification	Herbicide	Metabolite
Molecular formula	C15H12F3NO4S	C15H12F3NO4S
Molecular weight	359.3	359.3
Melting point	140oC	190oC
Density	1.42 g/cm3	1.5 ± 0.1 g/cm3
Log Pow	2.34	2.04
Vapor pressure	1 × 10−3 mPa (25oC)	-
Solubilityin water	6.2 mg/L (pH 5.5, 20oC)	326 mg/L
Solubilityin solvent	Dichloromethane 346, Acetone 293, acetonitrile, ethyl acetate 233, n-hexane 0.1, toluene 31.2, methanol 13.8(all in g/L, 20oC)	-

Isoxaflutole 및 diketonitrile 표준품 20.3 mg, 20.1 mg을 각각 20 mL의 acetonitrile 용해하여 1,000 μg/mL의 표준원액을 조제하였다. Matrix-matched calibration을 위해 각 농산물 검체의 무처리 추출물 900 μL에 20 μg/mL 표준용액 100 μL를 넣어 2.0 μg/mL matrix-matched 표준용액을 조제한 뒤 무처리 추출액을 이용하여 단계적으로 희석하여 0.02, 0.01, 0.1, 0.2, 1.0 및 2.0 μg/mL의 90% 이상의 matrix가 첨가된 matrix-matched 표준용액을 조제하였다. 표준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 4^oC에 보관하여 실험에 사용하였다.

균질화한 검체 10 g(과일류, 채소류, 서류는 약 1 kg을 분쇄한 후 그 10 g, 곡류 및 콩류는 약 1 kg을 혼합하여 표준체 420 μm를 통과하도록 분쇄한 후 그 10 g)을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고(곡류 및 건조시료의 경우 0.1% acetic acid 수용액 20 mL를 넣어 30분 방치) 0.1% acetic acid in water/acetonitrile (2/8, v/v) 50 mL를 가하여 진탕기에서 10분간 진탕하였다. 진탕 후 여과지가 깔려있는 부흐너 깔때기로 여과보조제인 celite 545 약 10 g을 이용해 흡인여과한 뒤 acetonitrile 20 mL로 잔사 및 용기를 씻어내려 앞의 여액과 합하였다. 합친 여액에 증류수 100 mL를 더하고 pH미터로 확인하며 1 N HCl을 천천히 가하여 pH 2가 되도록 하였다. 이를 500 mL 분액여두에 옮기고 NaCl 15 g 및 dichloromethane 50 mL를 차례로 가한 후 심하게 흔들어 층이 완전히 분리될 때까지 정치시킨 후 dichloromethane 층을 Na₂SO₄에 통과시켜 감압농축플라스크에 받는 과정을 2회 반복하였다. 이를 40^oC 이하의 수욕 상에서 감압하여 용매를 모두 날려버린 후, 잔류물에 acetonitrile을 가하여 최종부피 5 mL가 되게 한 뒤 시린지 필터로 여과한 후 시험용액으로 하였다[지방성 검체(대두, 현미)의 경우 잔류물에 n-hexane 30 mL를 잔류물에 가하여 녹인 후 250 mL 분량의 분액여두에 옮기고 acetonitrile 30 mL으로 2회 분배 추출한다. 합친 acetonitrile층을 40^oC에서 감압 농축한 후 잔류물에 acetonitrile을 가하여 최종부피 5 mL가 되게 한 뒤 시린지 필터를 이용해 여과한 후 시험용액으로 하였다.].

Isoxaflutole 및 diketonitrile의 동시분석을 위하여 액체크로마토그래프-질량분석기(Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometer, LC-MS/MS, Waters, Milford, USA)를 사용하였고, 분석용 역상 칼럼인 XBridge^® C₁₈ (2.1 mm i.d. × 100 mm, 3.5 μm, Waters, USA)칼럼을 선택하였으며 이동상으로 0.1% formic acid in methanol과 0.1% formic acid in water을 사용하여 최적화된 기울기 용리 방식을 적용하였다. 각 대상성분의 이온화는 ESI (electro-spray ionization)법의 positive-ion mode를 사용하였다. LC-MS/MS 분석조건은 Table 2와 같다.

확립된 isoxaflutole 및 diketonitrile 동시시험법의 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection), 정량한계(LOQ, limit of quantification), 회수율(recovery), 재현성(reproducibility)에 대해 유효성을 검증하였다. 직선성의 확인을 위하여 isoxaflutole 및 diketonitrile을 각 무처리 시료 시험용액으로 희석하여 조제한 표준 용액 0.02-2.0 μg/mL의 농도 범위에 대한 각각의 peak 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 검량선의 결정계수(coefficient of correlation, r²)를 구하였다. 또한, 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio) 각각 3, 10 이상으로 하였다. 시험법의 정확성 및 재현성을 평가하기 위하여 각 무처리 시료에 isoxaflutole 및 diketonitrile의 표준용액을 첨가한 후 분석하여 회수율을 구하였다. 처리농도는 대표농산물 5종에 대하여 정량한계, 정량한계의 10배, 정량한계의 50배에 해당하는 농도로 수행하였으며 각각의 농도 및 시료에 대하여 5반복으로 수행하여 평균과 상대표준편차(RSD, relative standard deviation)를 계산하여 시험법의 정확성과 정밀성 및 재현성을 평가하였다. 또한 서울지방식품의약품 안전청과 실험실간 검증을 실시하여 시험법의 유효성을 확인하였다.

Isoxaflutole과 diketonitrile의 Low P_ow는 각각 2.34, 2.04로 중간극성을 띄며, isoxaflutole의 증기압이 1 × 10⁻³ mPa(25^oC)으로 휘발성이 낮고 200^oC 이상에서 분해되는 특성을 갖는 열불안전성 화합물로 기체크로마토그래프(GC, Gas Chromatograph)를 이용한 분석은 어렵고 액체크로마토그래프(LC, Liquid Chromatograph)를 이용한 분석이 가능하다. 현행 식품공전에서는 isoxaflutole을 포함하는 3종의 농약을 LC-MS를 이용하여 분석하는 다성분 시험법(4.1.3.38)을 고시하고 있으나(Korean Food Standards Code, 2014) 대사산물을 포함하지 않는 시험법이므로 LC-MS/MS를 이용하여 isoxaflutole 및 대사산물을 동시에 분석하였다. LC-MS/MS에 의한 분석은 최적 이온화조건에서 첫 번째 precursor ion을 선정하고, ion-focusing을 거쳐 product ion을 선정하며 각 선발된 이온과 일치하는 이온만을 검출하므로 LC-MS로 분석하는 것에 비해 선택성이 우수하고 검출감도를 극대화시킬 수 있다. 이동상에 사용한 formic acid는 protonation enhancer로서 분석물질의 [M+H]⁺ 이온 생성에 용이하게 작용하고 산성조건을 유지하여 isoxaflutole 분자 내 isoxazole ring의 N-O 결합이 분해되는 것을 억제해 isoxaflutole의 안정성을 향상시키는 작용을 하였다(C.H. Lin, 2002). 최적 특성 이온 선정을 위해서는 질량이 359.3인 isoxaflutole과 diketonitrile 표준용액(1 μg/mL)을 일정한 속도(10 μL/min)로 질량검출기에 직접 주입하여 [M+H]⁺ 이온인 360.2 mass값을 확인하였고, cone voltage는 두 화합물 모두 20 V에서 최대의 peak 강도가 나타남을 확인하였다. 또한 분석의 선택성과 검출감도를 극대화시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였는데 collision cell에서 collision energy를 조절하여 최적의 precursor/product ion pair를 선정하고 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로, 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성이온(qualification ion)으로 설정하였다. 최적 기기분석 조건은 Table 2에 나타내었고, 분석조건에서 선정된 이온과 머무름 시간은 Table 3에 나타내었다. 또한 LC-MS/MS 분석 시에는 검체 중 추출성분에 의하여 대상 성분의 이온화 억압 또는 증강현상이 나타날 수 있으므로 대상 시료별로 matrixmatched calibration법에 준하여 정량하였다.

Isoxaflutole 및 diketonitrile은 중간극성 화합물로 수용성 유기용매 사용 시 추출효율이 높을 것으로 판단하여 methanol과 acetonitrile의 추출효율을 확인하였다. 그 결과, methanol로 추출 시 isoxaflutole의 회수율 및 재현성이 현저히 낮았고 acetonitrile 추출 시 isoxaflutole의 회수율은 90%로 양호하였으나, diketonitrile의 회수율이 76%로 비교적 낮은 것으로 확인되었다. isoxaflutole의 추출효율은 용매 별 용해도의 차이에 의한 것으로 methanol (용해도 13.8 g/L)보다 acetonitrile (용해도 233 g/L)에 용해도가 월등하게 높기 때문에 acetonitrile의 추출효율이 높은 것으로 판단되었다. 반면 diketonitrile은 pKa 값이 5.2인 약산성 화합물로 pH 3이하일 때 비해리 상태로 존재하는 특성을 갖는 것으로 보아(Fig. 2) 추출효율의 향상을 위해 유기용매에 산성 수용액을 첨가한 뒤 산성조건에서의 추출효율을 확인하였다. 추출용매에 첨가한 산 용액으로는 1% formic acid 용액과 1% acetic acid 용액을 비교하였는데, isoxaflutole은 acetonitrile에 두 산 용액을 첨가하였을 때 모두 유사한 추출효율을 보였고, diketonitrile의 경우 1% acetic acid 용액을 첨가한 acetonitrile에서 높은 추출효율을 보여 추출용매로는 acetonitrile, 산 용액은 acetic acid를 선정하였다. 최적의 acetic acid 농도 설정을 위하여 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1%의 acetic acid 농도에 대한 회수율을 비교한 결과, isoxaflutole은 산의 농도가 증가할수록 회수율이 점차 감소하였고, diketonitrile은 산의 농도가 증가할수록 회수율이 증가하는 경향을 보였다. 이는 isoxaflutole의 경우 pH 2-14 범위에서는 비해리 상태로 존재하지만 pH 2 이하의 강산성 조건에서 일부가 해리되는 특성이 있어 유기용매에 대한 추출효율이 감소하는 것으로 보이며, diketonitrile의 경우 산의 농도가 높아질수록 이온화가 억압되어 유기용매에 대한 추출효율이 증가하는 것으로 판단된다. 등록예정인 대두를 포함한 시험법 적용 대표농산물 5종 중 감귤의 경우, 0.1% acetic acid 수용액을 사용했을 때 두 화합물 모두 95% 이상의 높은 회수율이 나타났다(Table 4). 그러나 수분함량이 낮은 대두(수분함량 8.5%)와 현미(수분함량 11.4%) 시료에서 상대적으로 저조한 회수율 결과가 나타나 감귤시료를 제외한 감자, 고추, 대두, 현미 시료에 0.1% acetic acid 용액의 양을 더한 뒤 추출효율을 확인하였다(Table 5). 고추와 감자시료에서는 용매조성의 변화에 회수율이 크게 영향을 받지 않았고 대두와 현미시료에서는 0.1% acetic acid in water/acetonitrile (2/8, v/v)에서 가장 높은 회수율을 얻어 이를 최적 추출용매의 조성임을 확인하였다. 그러나 0.1% acetic acid in water/acetonitrile (2/8, v/v)의 용매를 사용하여도 대두, 현미시료에서 diketonitrile의 회수율이 72.8-76.0%로 나타나, 보다 추출효율을 높이기 위해 습윤화 단계에서 0.1% acetic acid 수용액을 사용하였을 때의 회수율을 확인하였다. 그 결과, 증류수를 이용하는 것 보다 acetic acid 수용액으로 습윤화 후 추출 시 더욱 효과적으로 diketonitrile을 추출할 수 있었는데, 이는 대두와 현미시료를 약산성 조건에서 습윤화하면 diketonitrile의 이온화를 억압하여 유기용매 가용성 형태를 유지시켜 추출효율을 높일 수 있는 것으로 판단되었다(Fig. 3).

현행 식품공전 isoxaflutole 시험법(4.1.3.38)에서는 활성탄/아미노프로필 카트리지를 이용하여 acetonitrile/toluene(75/25, v/v) 15 mL를 용출시키는 정제방법이 고시되어 있는데(Korean Food Standards Code, 2014), 이 방법을 isoxaflutole과 diketonitrile에 모두 적용하였을 때 diketonitrile이 거의 회수되지 않는 것을 확인하였다. 이는 isoxaflutole에 비해 diketonitrile의 극성도가 높아 카트리지에 더욱 강하게 흡착하여 acetonitrile/toluene (75/25, v/v)의 사용으로는 용출이 되지 않는 것으로 보인다. 이에 기존 공전시험법으로는 isoxaflutole 및 diketonitrile을 동시분석하기에 적합하지 않아 동시분석이 가능한 정제방법이 필요하였다. 본 연구에서는 시료 추출물로부터 불순물을 제거하기 위하여 액-액 분배법을 적용하였는데, isoxaflutole과 diketonitrile의 특성을 살펴보면 두 화합물 모두 pH 2-3 범위에서 이온화가 억압되어 비해리 상태로 존재하므로(Fig. 2) 추출액을 1 NHCl을 이용하여 pH 2, 2.5, 3으로 조절한 뒤 dichloromethane으로 액-액분배를 수행하여 분배율을 비교하였다. 회수율이 가장 저조했던 대두, 현미시료에 적용하여 각각의 pH에 대한 회수율을 확인했으며, 가장 높은 회수율을 얻었던 pH 2 조건을 액-액분배 시 pH 조건으로 설정하였다(Table 6). 선정된 pH 조건에서 isoxaflutole과 diketonitrile을 비이온 상태로 전환한 뒤 NaCl을 첨가하여 수용액 층의 이온강도를 증대시켜 dichloromethane으로 2회 분배할 경우 우수한 효율로 회수가 가능하였으며, 시료 중 간섭물질을 충분히 제거할 수 있어 추가적인 정제 없이 효율적으로 분석 가능하였다. 다만, 추출액 중 유지성분을 함유하고 있는 지방성 시료인 대두, 현미의 경우 추출 시 다량의 유지성분이 동시에 추출되어 농축 후 잔여물이 남기 때문에 유지 및 비극성 성분의 제거를 위해 n-hexane과 acetonitrile을 이용한 정제법을 추가 적용하였다.

Fig. 2. 
pKa graph of (A) isoxaflutole and (B) diketonitrile.

Fig. 3. 
Effects of hydration solution for isoxaflutole and diketonitrile extraction efficiency in samples.

시험법의 유효성 입증을 위해 서울지방식품의약품안전청 수입식품분석과와 실험실간 검증을 수행하였다. 개발한 시험법을 서울지방식품의약품안전청에 제공하고 동일한 방법으로 분석을 수행한 후 회수율 및 표준편차를 비교하였다. 검증 결과 각 농도별 isoxaflutole과 diketonitrile의 평균 회수율은 각각 71.9-103.1%, 84.1-114.7%이고 표준편차는 10% 미만으로 측정되었다. 두 실험실간 회수율 결과에 따른 평균값은 72.4-111.0%, 변이계수(CV%) 또한 21% 미만으로 모든 처리구에서 CODEX 가이드라인(CAC/GL 40, 2003)에서 제시한 기준 처리농도 >1 mg/kg, ≤0.01 mg/kg의 45%, >0.01 mg/kg, ≤0.1 mg/kg의 32%보다 낮아 적합한 것으로 확인되었다(Table 8).