Editorial Board

인삼 모잘록병을 일으키는 병원균에 대해 항균활성을 갖는 미생물을 분리하기 위해서 전국 인삼 재배지로부터 10~20 cm 깊이의 근권 토양을 채집하였다. 채집한 근권 토양 10 g에 멸균생리 식염수 90 ml를 첨가하여 180 rpm으로 진탕배양기에서 30분간 진탕 후 십진희석하여 King’s B Agar (peptones 20 g, magnesium sulphate 10.5 g, buffers 1.5 g, agar 15 g/L)에 100 μl를 도말하고 20^oC에서 5일간 배양하였다. 형태적으로 차이를 보이는 단일 집락을 순수분리하고 모잘록병원균에 항균활성 검정을 위한 공시균주로 사용하였다.

선발 균주의 항균활성을 확인하기 위해, 2014년에 충북 음성군 모잘록병 발생 포장에서 분리 동정하여 병원성이 확인된 R. solani 균주 2개와 P. ultimum 균주 2개를 사용하였다. 각각의 병원균은 PDA (glucose 20 g, potato extract 4 g, agar 15 g/L)에서 20^oC, 5일 간 배양하고 6 mm cork borer를 이용하여 균사 조각을 절단한 후 PDA 중앙에 치상하였다. 선발한 균주는 LB broth (tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 10 g/L)에서 30^oC, 200 rpm으로 1일간 배양한 후 배양액 10 μl을 PDA 배지 위에 점적하였다. 배지가 충분히 마를 때까지 10분 간 풍건한 후 20^oC에서 병원균과 5일간 대치 배양하고 균사 생육 억제 정도를 조사하였다.

선발된 균주를 동정하기 위하여 그람염색, API kit(bioMerieux, France) 동정 및 16S rRNA 유전자 분석을 수행하였다. 각각의 균주는 LB Agar에 접종하여 30^oC에서 1일간 배양 한 후 단일 균총을 LB 배지에 접종하여 30^oC에서 1일간 배양 하였다. 8,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 수확하였으며, QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다. Universal primer 인 27F와 1492R를 이용하여 Kim et al. (2012)의 방법에 따라 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 Takara Minibest DNA Fragment Purification Kit(TAKARA, Japan)을 이용하여 정제하였으며, 염기서열은 Macrogen Co. (Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 표준균주의 염기서열은 미국 국립생물정보센터에서 운영 중인 서버(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해서 다운받아, seqman(DNASTAR, USA) 프로그램을 이용하여 정렬하였다. 정렬된 염기서열 분석은 MGEGA 4.0 프로그램(Tamura et al., 2011)을 사용하였으며, Neighbor-joining 알고리즘을 이용하여 계통도를 작성하였고, bootstrapping을 1000회 반복으로 실시하여 견고성을 확인하였다.

선발된 균주들이 항균물질을 생성하는지를 확인하기 위하여, Athukorala et al. (2009) 이 수행한 PCR 검출법을 이용하여 항균물질 생합성에 관여하는 유전자를 검출하였다.

Bacillomycin D, fengycin, iturin A, surfactin 및 zwittermicin A 생합성 유전자를 증폭하기 위하여 Table 1과 같은 특이 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 AccuPower® PCR PreMix (Bionneer, Korea) premix에 1 μl의 genomic DNA와 각각의 10 pmol 프라이머를 넣은 다음 멸균수로 최종 부피가 20 μl가 되게 조정하고 PCR을 수행하였다. PCR 분석은 C1000 Thermal cycler (Bio-Rad, USA)를 이용하여 denaturation (95^oC, 2분), 30회 반복으로 denaturation (95, 30초), annealing (60^oC, 40초), extension (72^oC, 30초) 순으로 반응하였고, 최종 extension 반응은 72^oC에서 5분간 실시하였다. PCR이 완료된 후 2 μl의 증폭 산물을 1.5% agarose gel에 100 V로 1시간 전기영동을 하였으며, LodingSTAR(DYNEBIO, KOREA)로 염색한 후 각각 DNA의 증폭여부를 확인하였다.

선발한 균주들의 용해효소 활성 능력을 조사하기 위해서 0.2% NaN₃가 첨가된 0.8% agarose 배지를 기본배지로 사용하였다. 펙틴분효인 pectate lyase와 polygalacutonase 생성능을 확인하기 위하여 0.8% agarose 배지에 1% polygalacturonic acid (PGA)를 첨가하였다. 섬유소 분해효소인 cellulase 생성능을 조사하기 위하여 0.8% agarose 배지에 1% carboxylmethyl cellulose를 첨가하였으며, xylanase 생성능을 확인하기 위하여 1% oat spelts xylan을 첨가하여 실험에 사용하였다. 단백질 분해(protease)를 확인하기 위해 기본배지에 1% skim milk를 첨가하였다. 각각의 선택배지를 멸균한 다음 90 mm 페트리 디쉬에 분주하고 공시한 균주들은 LB broth (tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 10 g/L)에서 30^oC, 150 rpm으로 1일간 배양하였으며 각 균주의 배양액을 선택배지 중앙에 50 μl씩 접종한 다음 30^oC에서 2일간 배양하면서 투명환의 크기로 용해효소 활성정도를 측정하였다(Gerhardt et al., 1981).

포장 방제를 위한 병원균의 접종원 준비는 Yu et al. (1989)의 방법을 개선하여 이용하였다. 도정되지 않은 호밀종자를 하루 동안 물에 불리고, 121^oC에서 3회 멸균한 다음 R. solani 균총을 10개씩 접종하였다. 병원균을 접종한 호밀은 25^oC에서 2주간 동안 배양하며, 병원균이 균일하게 자라게 이틀에 한번씩 흔들어 섞어주었다. 2주 동안 호밀에서 배양된 접종원은 실온에서 풍건한 후 실험에 사용하였다.

포장방제효과 검정은 충북 음성군 소이면에 위치한 묘포에서 수행하였다. 선발된 길항균 3종의 배양액을 6 log CFU/ml 농도로 조정하여 개갑된 인삼 종자에 1시간 침지처리 하고 이틀간 풍건하였다. 길항균이 침지 처리된 인삼 종자는 1칸당 1800개씩 파종한 후, 병원균이 접종된 이병호밀을 묘포 1칸(1.8 m×0.9 m=1.62 m²)당 50 g씩 접종하고 마사토를 이용하여 2 cm 두께로 복토하였다. 약제대조구로는 모잘록병 방제에 사용되는 fludioxonil을 종자에 분의처리 하여 파종하였다. 추가적인 길항균 처리는 인삼종자 출아 전인 3월 30일부터 1주일 간격으로 6 log CFU/ml 농도로 칸당 10 L씩 5회 처리 하였으며, 방제효과 조사는 최종처리 후 7일 이후에 아래와 같이 계산하였다.

인삼 모잘록병원균에 항균활성을 갖는 길항미생물을 선발하기 위하여 인삼 재배 토양 및 근권에서 채집한 토양시료로부터 콜로니 형태 및 균총의 색이 다른 500 균주를 선발하였으며, 선발한 균주를 대상으로 일차적으로 R. solani AG2-1 KACC 40123와 Pythium sp. KACC 40581을 대상으로 길항력을 검정하였다. 선발한 균주 중에서 총 52개의 균주가 모잘록병원균에 길항효과를 가지는 것으로 확인되었으며, 이 중에서 R. solani AG5 KACC 40146 균주를 대상으로 추가로 균사 생육억제를 확인하였다. 1차 선발한 균주 중 52개의 균주가 모잘록병원균에 항균활성을 가지고 있었으며, 이중에서 항균활성이 높은 Bacillus 종 3 균주(ES1, ES2, ES3)를 최종적으로 선발하였다. 최종 선발한 균주 3종을 대상으로 항균활성 특성 및 생화학 특성을 분석하였다.

인삼모잘록병원균에 대한 항균활성 검정은 병원성이 다르게 확인된 R. solani 2종과 P. ultimum 2종에 대하여 수행하였다. 대치배양을 통하여 균사 생장 억제 효과를 조사한 결과, Table 2와 같이 공시한 모든 병원균에 대하여 항균활성을 나타내었다. ES1 균주는 P. ultimum보다 R. solani 균에 높은 항균활성을 나타냈으며, ES3 균주는 P. ultimum 균에 대하여 더 높은 항균활성을 가지고 있었다. 또한, ES1 균주는 배지의 표면과 내부로 들어가 신장하는 R. solani의 기질 균사의 생육을 완전히 저해하는 것으로 확인되었다(Fig. 1). 선발한 길항균의 생육 적온은 30^oC이지만 인삼모잘록병원균의 생육 적온인 20^oC에서도 높은 항균활성이 확인되었다. 모잘록병의 효과적인 방제를 위해서는 병원균의 생육 적온에서 항균효과가 높은 길항균을 선발하는 것이 필수적이며, 저온에서 높은 항균활성을 유지하는 것은 인삼모잘록병의 생물적 방제를 위하여 매우 중요하다. 따라서, 본 연구에서 선발한 균주들은 향후 처리방법 개발 등을 통하여 인삼모잘록병의 방제를 위한 생물적 방제제로서 활용가능하다고 판단된다.

Fig. 1. 
Inhibition of mycelium growth of Pythium ultimum (A) and R. solani (B) by tested strains ES1, ES2, and ES3.

인삼모잘록병의 생물적 방제를 위하여 분리한 균주들은 그람 양성으로 확인되었으며 API 50CHB kit를 이용한 동정한 결과 선발한 3개의 균주들은 B. subtilis와 B. amyloliquefacies로 구분할 수 없었으며, ES1, ES2, ES3는 B. subtilis/amyloliquefacies 동정되었으며 각각 99.6%, 98.6%, 97.6%의 상동성을 보였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, API 50CHB kit를 이용하여 Bacillus 종을 동정 할 경우 B. subtilis와 B. amyloliquefacies 의 동정을 위하여 추가적인 실험이 필요할 것으로 판단된다. 선발한 균주의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 후 NCBI Blast에서 비교한 결과, ES1과 ES3균주는 B. methylotrophucus CBMB205 (GenBank No. EU194897)과 99%의 높은 상동성을 보였으며, ES2 균주는 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42와 99%의 높은 상동성을 보였다. 또한, 16S rRNA 염기서열을 바탕으로 한 계통수 분석 결과, 선발한 균주들은 B. amyloliquefaciens와 B. methylotrophucus와 높은 유연 관계를 가지고 있는 것으로 확인되었으며, 계통수의 안정성을 나타내는 Bootstrap 값도 비교적 높은 68%와 61% 확인되었다(Fig. 2). 다양한 식물병원균의 생물적 방제제로 활용되는 Bacillus 속 균주들은 토양 및 식물체 근권에서 서식하여 식물 병원균에 항균활성 및 식물의 생장을 촉진하는 것으로 보고되었다(Cawoy et al., 2011). 근권 토양에서 분리한 B. amyloliquefaciens B94 균주가 다양한 식물병원균에 항균효과를 가지는 항진균 물질을 생산하는 것으로 보고되었으며(Yu et al., 2002), Madhaiyan et al. (2010)은 벼의 근권에서 분리한 B. methylotrophucus는 의한 식물생육 촉진효과를 확인하였다. 기존에 보고된 Kim et al. (2012)의 연구에서처럼 표준균주와 길항균주의 계통도 분석을 이용한 근연종의 유연관계 분석은 식물병원균의 생물적 방제를 위한 길항균의 선발 및 분류학적 위치를 연구하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 2. 
Neighbour joining tree based on nearly 16S rRNA gene sequences showing the phylogenetic relationships between strains ES1, ES2, and ES3, and the species of the genus Bacillus. The numbers at the nodes are the percentages indicating the level of bootstrap support based on 1,000 resampled data set. Bar, 0.005 substitutions per nucleotide position.

Fengycin, bacillomycin, surfactin, iturin A과 같은 항진균 물질 생합성유전자를 PCR로 증폭하는 기술은 미생물이 생성하는 항균물질을 화학적으로 분석하지 않고 쉽게 확인할 수 있는 방법으로 길항균의 항균활성 기작을 연구하는데 유용하게 사용되고 있다(Yu et al., 2002; Khabbaz et al., 2015). 선발한 모든 균주에서 Bacillus 속 균주들이 생성하는 iturin A와 surfactin을 생합성하는 유전자가 존재하는 것으로 확인 되었으며, ES2 균주를 제외한 2 균주에서 bacillomycin D를 생성하는 유전자가 검출되었으며, 모든 균주에서 fengycin과 zwittermicin의 생합성 유전자는 검출되지 않았다(Fig. 3). Bacillus 속 균주들이 생산하는 surfactin, bacillomycin, iturin A, zwittermicin A, fengycin과 같은 리포펩타이드 계통의 항생물질은 식물병원균에 대한 생물방제제로서 보고되어왔다(Besson et al., 1977; He et al., 1994; Horowitz et al., 1991; Kim et al., 2004; Yu et al., 2002). 특히, iturin 과 fengycin은 다양한 식물병원균에 대하여 강력한 항진균 활성과 생장억제효과를 가지고 있는 것으로 알려져 왔다(Kim et al., 2004; Yu et al., 2002). 국내에서 iturin, fengycin과 surfactin과 같은 리포펩타이드는 Colletotrichum gloeosporioides에 의한 탄저병을 방제하는데 사용되어 왔다(Kim et al., 2010). 본 연구에서 최종 선발한 균주에서 리포펩타이드 계통의 항생물질을 생합성하는 유전자가 검출되어 향후 인삼모잘록병 방제를 위한 생물방제제로 활용가치가 있을 것으로 생각된다.

Fig. 3. 
PCR detection of antifungal activating gene corresponding to bacillomycin D (bmy D), iturin A (ituA), and surfactin (srfA), M : 100 bp ladder.

길항균이 생산하는 용해 효소 활성능을 분석한 결과, 최종 선발한 3균주 모두 Table 3과 같이 cellulase, protease와 xylanase를 생산하는 것으로 확인되었으며, B. amyloliquefaciens ES2 균주를 제외한 두 균주에서 pectate lyase를 분비하였다(Fig. 4). Bacillus 속 균주들은 항생물질이외에도 cellulase, protease 등과 같은 다양한 종류의 효소를 생성하여, 식물병원균의 생장을 저해하는 것으로 보고되었으며, 이들 균주들이 생산하는 세포벽 분해효소는 식물병원균의 세포벽을 용해하는데 작용하는 것으로 알려져 있다(Chi et al., 2011; Pant et al., 2015). 길항균이 분비하는 용해효소는 작물과 병원균과의 상호작용을 통해 병 발생을 돕거나 억제하며, 미생물의 근권정착 및 식물의 면역반응 등을 통해 식물의 생육에도 영향을 끼치는 것으로 확인되었다(Berendsen et al., 2012). 특히, 미생물이 분비하는 protease는 식물의 방어기작을 조절하여 식물병원균에 대한 유도저항성을 가지는 것으로 보고되었다(Xia, 2004; Cheng et al., 2015). 본 연구에서 최종선발 된 ES1, ES3 균주는 cellulase, pectate lyase, protease와 xylanase를 모두 분비하는 것으로 확인되었고, 활성능 또한 매우 우수한 것으로 조사되었다. 특히, 식물병원균의 세포벽이 cellulose로 구성되어 있는 것을 고려해 볼 때, ES1과 ES3 균주들이 생산하는 cellulase가 병원균의 세포벽을 분해하여 병원균의 생장을 억제하는 것으로 생각된다. 선발 균주가 분비하는 용해효소가 식물병원균 및 인삼에 끼치는 영향을 분석하기 위하여 향후 포트실험 및 접종실험이 수반되어야 할 것으로 판단되며, 이를 통하여 정확한 활성기작 및 억제 조건 등을 확인 할 수 있을 것으로 생각된다.

Fig. 4. 
Colony appearances showing lytic enzyme activities of Bacillus strains isolated. (A); Cellulase, (B); Pectate lyase, (C); Protease, (D): Xylanase.

모잘록병의 포장방제 효과는 R. solani 균을 접종한 이병포장에서 수행하였다. 선발한 길항균 3균주를 1년생 묘삼에 침지 및 관주처리 한 결과, ES1, ES2, ES3 처리구에서는 방제가가 각각 32.4%, 46.8%, 36.7%로 확인되었으며, 대조약제인 fludioxonil 분의 처리구에서 75.2%의 방제효과를 보였다(Fig. 5). 병원균을 접종한 이병포장에서 4월 중순 이후부터 출아 후 땅에 접한 지제부위가 암갈색으로 마르면서 쓰러지는 증상을 보였으며 주변이 점차 원형으로 퍼져가는 증상을 보였다(Fig. 6). 무처리구에서의 발병주율이 47.7%, 약제대조구 발병주율이 11.8%인 것을 감안할 때 길항균 처리구의 방제효과는 비교적 높은 것으로 판단된다. 인삼에서 R. solani에 의한 모잘록병은 인삼종자가 출아하는 4월 중하순에 시작하여 5월말까지 발생하는 것으로 알려져 있으며(Cho et al., 2007), 모잘록병의 효과적인 방제를 위하여 길항균을 출아 전 근권에 처리하여 근권내에 길항균의 밀도를 유지시키는 것이 중요하다고 생각된다. 포장방제 실험에서 인삼 종자의 파종 깊이가 깊어질수록 모잘록병의 발생이 심해진다는 Yu et al. (1990)의 보고처럼, 파종깊이를 고려하여 포장방제 효과가 수행되어야 할 것으로 생각되며, 향후 제형화 및 길항균의 근권정착효과 등을 포함한 방제효과를 높일 수 있는 추가적인 연구가 수행된다면 인삼모잘록병 방제를 위한 생물농약으로 활용 가능할 것으로 판단된다.

Fig. 5. 
Effect of antifungal bacteria treatment on damping off caused by Rhizoctonia solani in the field of ginseng seedling. Treatmets with the same letter are not significantly different at the 5% level by Duncan's multiple range test.

Fig. 6. 
Effect of antagonistic microbe application on damping off of 1 year-old ginseng seedling inoculated Rhizoctonia solani. A, cotnrol; B, treatement plot of Bacullus amyloliquefaciens ES2 C, treatment plot of fludioxonil.