The Korean Society of Pesticide Science

The Korean Journal of Pesticide Science - Vol. 22 , No. 4
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[ ORIGINAL ARTICLES ]
The Korean Journal of Pesticide Science - Vol. 22, No. 4, pp. 356-362
Abbreviation: Korean J. Pestic. Sci.
ISSN: 1226-6183 (Print) 2287-2051 (Online)
Print publication date 31 Dec 2018
Received 14 Sep 2018 Revised 12 Dec 2018 Accepted 14 Dec 2018
DOI: https://doi.org/10.7585/kjps.2018.22.4.356

개암풀(Psoralea corylifolia) 종자로부터 잘록병(Rhizoctonia solani AG-4)에 대한 항진균 활성물질 탐색
최지수 ; 최용화*
경북대학교 대학원 생태환경시스템학과

Antifungal Activity Substance from Psoralea corylifolia seeds against Rhizoctonia solani AG-4
Ji-Soo Choi ; Yong-Hwa Choi*
School of Ecology and Environmental System, Kyungpook National University, Sangju 37224, Republic of Korea
Correspondence to : *Email: ychoi@knu.ac.kr

초록

잘록병 방제를 위한 친환경 농자재의 개발을 목적으로 개암풀 종자 추출물로부터 잘록병 병원균인 Rhizoctonia solani AG-4에 대한 항진균 활성물질을 탐색하였다. 개암풀 종자의 MeOH 추출물을 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, H2O으로 순차적으로 용매분획하였고, 생물검정 결과 가장 강한 활성을 보인 hexane fraction으로부터 silica gel chromatography하여 활성물질을 분리정제하였다. 항진균 활성을 보인 HS-16 subfraction은 GC/MS와 NMR로 분석한 결과 bakuchiol로 구조동정되었다. Bakuchiol의 R. solani AG-4에 대한 항진균 활성은 대조약제로 몬세렌의 EC50 값보다 낮게 나타났으며, 100 mg/l 농도에서 몬세렌은 76.7%, bakuchiol은 92.3%의 활성효과를 나타내었다. 따라서, bakuchiol은 잘록병 원인균인 R. solani AG-4에 대하여 친환경 농자재로 개발을 고려할 만한 활성을 가지는 것으로 판단되었다.

Abstract

To develop environment-friendly agricultural product for control of damping-off, this experiment isolated antifungal active substance from Psoralea corylifolia Linn. seeds against Rhizoctonia solani AG-4, a pathogen of damping-off. Methanol extract obtained from P. corylifolia Linn. seeds was successively fractionated with hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol and water. From hexane fraction, an active compound was isolated through silica gel column chromatography. As a result of testing antifungal activity of bakuchiol against R. solani AG-4, EC50 (0.80 mg/l) of bakuchiol was lower than EC50 (2.53 mg/l) of Monseren used for control. Bakuchiol and Monseren inhibited the mycelial growth of R. solani AG-4 by 92.3% and 76.7% at 100 mg/l concentration. Therefore, Psoralea corylifolia Linn. seeds extract can be a potential candidate for environment-friendly agricultural products with a antifungal activity against R. solani AG-4.

Keywords: Antifungal active substance, Bakuchiol, Psoralea corylifolia Linn., Rhizoctonia solani AG-4
키워드: 항진균 활성물질, bakuchiol, 개암풀, Rhizoctonia solani AG-4
서 론

Rhizoctonia 속 병원균에 의한 병 발병은 거의 모든 작물에 피해를 입히고 기주의 감염부위나 환경조건에 따라 잘록 병이외에도 밑둥썩음병, 뿌리썩음병, 줄기썩음병, 줄기궤양병 등으로 나타난다(Kim et al., 1995). 특히, 잘록병은 4월 중하순에서 5월 상순까지 땅에 접한 줄기부위가 암갈색으로 마르면서 쓰러지고 주변으로 둥글게 퍼져 나가는 특징을 보이며 종자 발아 직후 어린 줄기를 침입하여 출아 전이나 출아 후에 마르면서 쓰러지는 증상을 보인다(Cho et al., 2007). 미국의 경우 잘록병에 의한 목화의 피해가 1986년 2.2%에서 1997-1999년 2년 동안 연 평균 3.0%으로 증가하였다는 보고가 있으며(Hancock et al., 2004), 우리나라의 경우 콩의 피해가 매년 30-40%에 달하는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2010). 인삼의 경우 잘록병이 묘삼 생산의 성패로 직결될 정도로 가장 중요한 병해로 인삼의 피해는 19-30%나 발생한다고 보고되었다(Hong, 1964).

잘록병 방제법으로는 적절한 토양 배수 및 관수 관리 등의 경종적 방제와 비닐 멀칭을 이용한 태양열 소독, 살균제를 종자에 처리하거나 토양 소독에 이용하는 화학적 방제가 있으나, 화학적 방제가 주를 이루고 있다. 그러나 화학적 방제는 농약의 오남용으로 인한 환경오염, 생태계 파괴, 약제 내성균 등의 문제가 있다(Islam and Faruq 2012; Jo et al., 2014).

개암풀(Psoralea corylifolia)은 콩과에 속하는 1년생 초본 이고 예로부터 신장을 보하고 양기를 크게 북돋아 주는 약재로 전해지며, 새벽 설사나 남자 성기능 저하, 발기부전, 유정 등의 치료에 널리 쓰여 왔다(Shim, 2008). 개암풀 종자는 여러 종류의 장애를 치료하기 위하여 널리 사용된 Buguzhi라는 중국의 전통 약재로 잘 알려져 있으며(Katsura et al., 2001), 개암풀 추출물의 경우 Helicobacter pylori균에 대한 저해작용(Yin et al., 2006), 항균 및 항진균 작용(Yin et al., 2005), 항산화 작용(Jiangning et al., 2005), 항종양 작용(Latha et al., 2000) 등의 연구가 보고되었다.

개암풀의 성분에는 psoralen, isopsoralen, psoralidin 등과 같은 coumarins (Khastgir et al., 1961), corylifolin, corylin과 같은 flavones (Gupta et al., 1978; Suri et al., 1978), BHT, bakuchiol, psoracorylifols 등과 같은 phenol 화합물들이 보고되었다(Metha et al., 1973). 그 중 주요 성분은 방향족 고리상의 단일 hydroxyl기 및 불포화 탄화수소 사슬을 가지는 phenol성 화합물인 bakuchiol로 알려져 있으며(Cho et al., 2011), bakuchiol은 여러 가지 질병 예방 및 치료에 사용하기 위한 생물학적 활성을 가지는 천연물질로 보고된 바가 있다(Chaudhuri and Marchio 2011).

따라서, 본 연구에서는 잘록병의 화학적 방제를 대체하기 위하여 친환경 농자재 개발을 목적으로 개암풀 종자로부터 잘록병 병원균인 Rhizoctonia solani AG-4에 대한 항진균 활성물질을 구명하였다.

재료 및 방법
실험재료

본 연구에서 사용한 잘록병 병원균인 Rhizoctonia solani AG-4 Kuhn. (KACC 40141)을 농업유전자원센터로부터 분양받아 경북대학교 대학원 생태환경시스템학과 식물자원환 경전공 천연물화학연구실에 보관하며 배양한 후 사용하였다. 식물재료인 개암풀(Psoralea corylifolia Linn.) 종자는 대구 광역시 약령시장에서 구매하였다.

시약 및 기기

용매분획과 silica gel column chromatography에서 사용된 시약 methanol (MeOH) 99.5%, n-hexane 95.0%, chloroform (CHCl3) 99.5%는 ㈜삼전순약공업, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)은 ㈜덕산약품공업의 extra pure grade를, NMR 용매로 사용한 CDCl3는 Sigma-Aldrich Co. (Mo, USA) 제품을 사용하였고, 균사생장 억제 실험 대조약 제로 ㈜팜한농의 몬세렌(Pencycuron 20%, 액상수화제)을 사용하였다. NMR spectrometer는 Varian Bruker사(MA, USA)의 DMX 600 (600 MHz)을 이용하였고, 내부표준물질은 tetramethyl silane (TMS)을 사용하였으며, chemical shift는 ppm (δ)으로 나타내었다. Bioassay에 사용된 PDA배지는 Becton, Dickinson & Co.(MD, USA)의 배지를 사용하였으며, 여과지(300 mm Ø, No. 2)는 Advantec사(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였고 petri dish는 SPL사(Korea) 제품을 사용하였다. Silica gel (7734)은 Merck사(Darmstadt, Germany) 제품을, gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS)는 Agilent사(CA, USA)의 7890A 기종을, column은 HP-5MS capillary를, detector는 Agilent사(CA, USA)의 5975C를 이용하였다.

실험 병원균의 배양 조건

잘록병 병원균의 배양 배지는 PDA를 1 L 조건으로 petri dish에 조제하였다. 병원균인 R. solani AG-4은 cork borer (8 mm)로 채취하여 배지의 중앙에 치상 시킨 후 25oC에 7일간 배양하였다.

MeOH 용매추출

건조시킨 개암풀 종자 시료 650 g을 blender (㈜한일전기, HMF-3260S, 8700 rpm)를 이용해 잘게 분쇄하고 99.5% MeOH 3 L로 실온에서 24시간 침지 후 추출하였으며 침지와 추출과정을 3회 반복하였다. 상등액을 여과지를 사용하여 고형물을 걸러내고 40oC에서 rotary evaporator로 감압농 축하여 MeOH 추출물 101.65 g을 얻었다.

용매분획

MeOH 추출물 101.65 g을 증류수 500 ml에 현탁시킨 후 hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH을 순차적으로 용매분획하여 hexane fraction 22.62 g, CHCl3 fraction 54.37 g, EtOAc fraction 2.17 g, BuOH fraction 1.47 g, Aqueous layer 21.02 g을 얻었다.

생물검정

항진균 활성 탐색을 위하여 고압 멸균한 PDA배지 내 최종 농도가 100 mg/l이 되도록 MeOH 추출물과 각 분획물을 첨가한 후 petri dish (60 mm × 15 mm)에 분주하여 평판배 지를 만들었다. 평판배지를 완전히 굳히고 cork border (5 mm)로 채취한 시험 균주를 배지 중앙에 치상하여 25oC incubator에서 균주의 생장속도를 보며 항진균 활성 여부를 조사하였다.

항진균 활성물질 분리 및 정제

활성이 가장 강한 hexane fraction으로부터 항진균 활성물 질을 분리정제하기 위하여 glass column (50 mm × 860 mm)에 silica gel (Merck 7734) 500 g을 충진한 후 hexane fraction 22.62 g을 loading한 후, hexane : EtOAc (9 : 1, v/ v)의 용매계로 isocratic 방식으로 순차 용출하여 150 ml씩 36개의 subfraction들을 얻었다. 그 중 가장 활성이 강한 HS-16 subfraction을 GC/MS와 NMR 분석으로 항진균 활성물질의 화학적 구조를 구명하였다.

항진균 물질 구조 구명

순수 분리한 HS-16 subfraction의 화학구조은 MS와 1HNMR, 13C-NMR spectral data을 분석으로 화합물의 구조를 해석되었다. GC/MS 분석은 HS-16 subfraction을 100 mg/l 농도가 되도록 acetone (HPLC grade, B&J, USA)에 희석시킨 후 분석하여 분자량([M]+)이 256임을 확인하였다. NMR 분석은 HS-16 subfraction 10 mg을 CDCl3에 녹여 분석하였다.

Brown liquid; ElMS m/z 256 [M]+

1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 1.19 (3H, s, H-16), 1.49 (2H, m, H-10a & b), 1.58 (3H, s, H-15), 1.67 (3H, s, H-14), 1.95 (2H, m, H-11a & b), 5.02 (2H, m, H-18a & b), 5.10 (1H, brt, H-12), 5.88 (1H, dd, J = 17.4, 10.8 Hz, H-17), 6.05 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8), 6.25 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7), 6.76 (2H, d, J = 9.0 z, H-3, 5), 7.24 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2, 6); 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 17.6 (C-15), 23.2 (C-16), 23.3 (C-11), 25.6 (C-14), 41.3 (C-10), 42.5 (C-9), 111.9 (C-18), 115.4 (C-3 & 5), 124.8 (C-12), 126.5 (C-7), 127.4 (C-2 & 6), 130.9 (C-1), 131.3 (C-13), 135.9 (C-8), 150.0 (C-17), 154.6 (C-4).

균사생장 억제 실험

고압 멸균한 PDA배지 내 최종 농도가 0, 1, 5, 10, 50, 100 mg/l이 되도록 HS-16 subfraction와 시판되고 있는 대조 약제 몬세렌을 각각 첨가한 후 petri dish (60 mm × 15 mm)에 분주하여 평판배지를 만들었다. 평판배지를 완전히 굳히고 cork borer (5 mm)로 채취한 시험 균주를 배지 중앙에 치상하여 25oC incubator에서 균주의 생장속도를 보며 균사 생장 억제능을 검정하였다.

통계 분석 및 구조 분석

실험을 통하여 얻은 성적들은 SAS 프로그램(version 9.4, SAS Institute Inc., USA)을 이용하여 EC50 (effective concentration inhibiting by 50% of mycelial growth) 값 및 유의성 검정을 하였다.

결과 및 고찰

개암풀 종자의 MeOH 추출물은 잘록병 병원균인 Rhizoctonia solani AG-4에 대하여 강한 활성을 나타내었다. 개암풀 종자로부터 항진균 활성물질을 구명하고자 개암풀 종자의 MeOH 추출물을 hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, H2O로 용매분획하여 얻은 각각의 fraction들을 대상으로 100 mg/l에서 항진균 활성을 검정한 결과, hexane fraction에서 가장 강한 활성을 나타내었고 다음으로 CHCl3 fraction에서 강한 활성을 나타내었다(Fig. 1). Hexane fraction과 CHCl3 fraction을 GC/MS로 분석한 결과, 두 GC chromato-gram이 거의 동일한 패턴을 나타내었다. Hexane fraction을 대상으로 항진균 활성물질을 분리 및 정제하였다.


Fig. 1. 
Antifungal actives of fractions fractionated from MeOH extract against R. solani AG-4 at 100 mg/l concentration. A, Control; B, Hexane fraction; C, CHCl3 fraction; D, EtOAc fraction; E, BuOH fraction; F, Aqueous layer.

Hexane fraction의 36개 subfraction들을 대상으로 항진균 활성검정을 진행한 결과 HS-16 subfraction에서 강한 활성을 나타내었다.

항진균 활성이 강한 HS-16 subfraction을 GC/MS로 분석한 결과, m/z 256에서 [M]+peak가 검출되었고 m/z 173에서 base peak가 검출되었으며 주요 fragment ion으로 m/z 213, 158, 145, 107 등이 검출되었다(Fig. 2, 3).


Fig. 2. 
GC chromatogram data of HS-16 subfraction isolated from Psoralea corylifolia seeds.


Fig. 3. 
Mass spectrum data of HS-16 subfraction isolated from Psoralea corylifolia seeds.

HS-16 subfraction을 CDCl3 용매로 용해시켜 NMR로 구조분석하였다(Fig. 4, 5).


Fig. 4. 
1H-NMR spectrum of HS-16 subfraction isolated from P. corylifolia seeds.


Fig. 5. 
13C-NMR spectrum of HS-16 subfraction isolated from P. corylifolia seeds.

1H-NMR spectrum을 분석한 결과, signal δ 7.24 (d, J = 90 Hz)과 6.76 (d, J = 9.0 Hz)에서 para-substituted aromatic ring, δ 6.25 (d, J = 16.2 Hz), δ 6.05 (d, J = 16.2 Hz) δ 5.88 (dd, J = 17.4, 10.8 Hz), δ 5.10 (br t), δ 5.02 (m)에서 5개의 alkenyl protons, δ 1.67 (s), δ 1.58 (s), δ 1.19 (s)에서 3개의 methyl singlets, δ 1.95 (m)과 1.49 (m)에서 saturated alkane의 proton이 관찰되었으며, δ 6.05와 δ 6.25에서 나타난 coupling constant (J = 16.2 Hz)으로 trans double bond임을 알 수 있었다.

13C-NMR spectrum을 분석한 결과, 18개 carbon에 상응하는 peak가 검출되었으며 δ 25.6, 23.2, 17.6 ppm에서 CH3 carbon peak가, δ 111.9, 41.3, 23.3 ppm에서 CH2 carbon peak가, δ 146.0, 135.9, 127.4, (2), 126.5, 124.8, 115.4 (2) ppm에서 CH carbon peak가, δ 154.6, 131.3, 130.9, 42.5 ppm에서 quaternary carbon peak가 검출되었다.

1H-NMR spectrum과 13C-NMR spectrum을 분석한 개암풀 종자로부터 순수 분리한 HS-16 subfraction은 4-[(1E, 3S)-3-ethenyl-3,7-dimethylocta-1,6-dienyl]phenol로 구조동 정하였으며(Fig. 6), 이 화합물의 구조해석은 Lin et al. (2007)과 Hsu et al. (2009)의 구조해석과 일치하였다.


Fig. 6. 
Chemical structure of antifungal active substance isolated from P. corylifolia seeds.

개암풀 종자로부터 분리정제하여 그 화합물의 구조가 밝혀진 4-[(1E, 3S)-3-ethenyl-3,7-dimethylocta-1,6-dienyl] phenol 화합물은 Mehta et al. (1973)에 의해 개암풀에서 분리하여 bakuchiol이라 명명된 monoterpene phenol 화합물이다.

Bakuchiol은 항염증성(Matsuda et al., 2009), 항산화(Adhikari et al., 2003), 항종양성(Chen et al., 2010), 항균성 (Katsura et al., 2001), 세포 독성(Jiang et al., 2010), 간 보호성(Cho et al., 2001) 그리고 apoptosis 효과에 좌우되는 caspase-3 (Park et al., 2007)을 보유하는 것으로 보고되었다. 또한, Chaudhuri et al. (2011)은 bakuchiol이 항 여드름 활성을 가지고 있다고 보고했으며 Chaudhuri and Bojanowski (2014)은 임상사례연구와 조직화학, ELISA, DNA microarray에 사용하고 있는 bakuchiol의 레티놀과 같은 기능과 노화 방지효과를 보고하였다. 또한 이 화합물은 Kim et al. (2007)에 의하여 쥐에 대한 개암풀 종자 추출물의 LD50 값이 쥐의 체중 kg당 2 g 이상으로 회당 경구 투여에 대한 독성을 가지지 않는 것으로 보고되었다.

순수 분리한 bakuchiol 화합물과 몬세렌을 MeOH 용매에 녹여 최종농도가 0, 5, 10, 50, 100 mg/l이 되도록 배지를 조성하여 배지 중앙에 고체배지에서 배양된 R. solani AG-4 병원균을 치상하고 25oC incubator에서 7일간 배양 후 항진균 활성을 검정하였다(Fig. 7). 또한 항진균 활성에 대하여 EC50 값을 산출하고(Table 1) 유의성 검정하였다(Table 2).


Fig. 7. 
Antifungal activities of bakuchiol (I) isolated from P. corylifolia and Monseren (II) against R. solani AG-4 at various concentrations. A, Control; B, 1 mg/l; C, 5 mg/l; D, 10 mg/l; E, 50 mg/l; F, 100 mg/l

Table 1. 
EC50 value of bakuchiol and Monseren against R. solani AG-4
EC50 value (mg/l)
Average Minimum Maximum
Bakuchiol 0.80 0.46 1.22
Monseren 2.53 0.83 4.92
*Figures were EC50 value (mg a.i. l−1)

Table 2. 
Inhibition rate of growth by bakuchiol and Monseren against R. solani AG-4 at various concentration
1 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 50 mg/l 100 mg/l
Bakuchiol 52.634C 73.796B 79.177B 91.081A 92.333A
Monseren 34.873 47.222 80.052 85.109 76.701
* The values represent the mean ± standard deviations for three independent experiment.
A~C Different superscripts are significantly different by DUNCAN at P < 0.05.

잘록병 원인균인 Rhizoctonia solani AG-4에 대한 개암풀 종자로부터 분리한 bakuchiol의 균사생장 억제 실험을 검정한 결과, 5 mg/l 이상 농도에서 강한 항진균 활성을 나타내었다. 시중에 판매하는 농약인 몬세렌과 거의 비슷한 항진균 활성이 나타났으며, bakuchiol의 EC50 값은 0.80 mg/l이었다. 특히, 100 mg/l에서 bakuchiol의 활성은 92.3%로써 몬세렌(76.7%)보다 약 15% 높은 활성을 보였다.

따라서, 개암풀 종자로부터 분리한 bakuchiol이 잘록병 원인균인 Rhizoctonia solani AG-4에 대한 항진균 활성물질로 구명되었으며, 이 물질은 잘록병에 대한 친환경 농자재로 개발을 고려할 만한 활성을 가지는 것으로 판단되었다.

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