시험에 사용한 약제는 Dr. Ehrenstorfer사의 imidacloprid (99.0%)를 구입하여 사용하였다. 양성대조물질로는 dimethoate (98.9%, Dr. Ehrenstorfer)을 사용하였다.

Fig. 1은 OECD 가이드라인의 꿀벌 유충 단회 및 반복노출 시험법의 주요 과정을 그림으로 나타낸 것이다(OECD, 2013; OECD, 2016). 시험에 사용한 꿀벌은 전라북도 국립농업과학원 잠사양봉소재과 양봉장에 위치한 세 벌통에서 무작위 선발하였다. 시험 3일전(D-3)에 격왕판을 설치하여 공소비판에 여왕벌이 산란하게 한 뒤 다음날 산란을 확인하고 3일 후 시험 1일차(D1)에 1일령 유충을 48 well-plate (SPL, Korea)에 이충하였다.

Fig. 1. 
Schematic representation of the important steps of the larval acute and chronic toxicity test (D=day; RH=relative humidity). Adapted from OECD (2016).

이충하기 전 48 well plate (SPL, Korea)에 grafting cell cup (Niocoplast Society, France)를 넣고 유충먹이 A를 20 μl 주입 후 1일령 유충을 이충침(chinese grafting tool)을 이용하여 이충하였다. Grafting cell cup은 사용하기 전 70% 에탄올에 1시간 이상 담구어 소독하였으며 lamina-flow 후드에서 건조시킨 후 사용하였다.

유충먹이는 A, B, C 타입의 총 3종류로 구성은 Table 1과 같다. 증류수에 yeast extract (Bacto, Sparks, USA), dextrose (Difco, Sparks, USA), D-fructose (Junsei, Japan)를 넣어 혼합한 후 0.20 μm 필터(Sartorius, Germany)로 여과하였다. 여과한 용액과 로얄젤리(여주꿀벌농원, 한국)를 혼합하여 유충먹이를 제조하였다. 로얄젤리는 구입 직 후 소량으로 나누어 냉동(-20^oC 이하) 보관하였으며 유충먹이 제조시마다 상온에 녹여 사용하였다. 유충먹이는 제조 후 +5^oC 이하로 냉장보관하고 보관한지 3일 이상 지나면 폐기하며 유충에게 급여하기 전 유충의 생육온도인 35^oC에 맞추고 생성된 기포를 충분히 제거한 후 사용하였다. 단회 및 반복노출 시험에서, 시험 1일차(D1)에 유충먹이 A를 20 μl, 시험 3일차(D3)에 유충먹이 B를 20 μl, 시험 4일차(D4)부터 6일차(D6)에 유충먹이 C를 30-50 μl 급여하였다.

단회노출 시험의 경우 이충이 완료된 시험 1일차(D1)부터 48 well-plate를 K₂SO₄ (Junsei, Japan) 포화용액을 이용하여 상대습도가 95±5%로 유지되는 데시게이터(Nalgene, USA, 30 × 30 × 45 cm) 안에 넣고, 데시게이터를 항온 인큐베이터(DAIHAN Scientific Co., Korea) 안에 넣어 온도를 34~35^oC로 유지하였다. 인큐베이터는 일정한 암조건을 유지하였으며 사육조건을 이탈한 시간이 일일 15분을 초과하지 않도록 하였다.

반복노출 시험의 경우 시험 1일차부터 7일차(D1-D7)까지 단회노출 시험과 같은 조건으로 시험하였다. 시험기간(D1-D21) 동안 인큐베이터 온도는 34~35^oC로 유지하였다. 시험 8일차(D8)에 48 well-plate을 NaCl(Sigma-Aldrich, USA) 포화용액을 이용하여 상대습도를 80±5%로 유지한 데시게이터로 이동하였고, 시험 15일차(D15)에 48 well-plate을 우화박스(emergence box)에 옮겨 상대습도를 50%로 유지하였다. 우화박스(180 × 115 × 130 mm) 뚜껑에는 공기가 통할 수 있도록 망사로 구역을 만들었으며 50% 자당용액을 공급할 수 있는 장치를 설치하였다.

단회노출의 경우 시험 4일차(D4)에 약제를 노출하고 24, 48시간 후 먹이를 급여하기 전 치사개체 및 이상증상을 관찰하였으며, 약제 노출 72시간 후 추가적인 먹이 급여 없이 치사개체 및 이상증상과 먹이를 남긴 유충의 수를 기록하고 실험을 종료하였다. 유충색이 불투명해지거나 이충침으로 살짝 건드려도 움직임이 관찰되지 않을 때 죽은 것으로 간주하였다.

반복노출의 경우 시험 3일차(D3)에 약제를 최초 노출한 후 시험 4-6일차(D4-D6)에 정해진 시간에 약제를 노출하였다. 시험 4-6일차(D4-D6)에 약제를 노출하기 전 치사개체 및 이상증상을 관찰하였으며 시험 7일차(D7)에 추가적인 먹이와 약제의 급여 없이 치사개체 및 이상증상을 관찰하였다. 시험 8일차(D8)에 치사개체 및 이상증상을 기록하고 상대습도가 80±5%인 데시케이터로 이동하였다. 시험 11-13일차(D11-D13), 시험 15일차(D15)에 번데기 치사개체 및 이상증상을 기록하고 우화박스에 plate를 옮긴 후 상대습도를 50%로 유지하였다. 시험 17일차(D17)부터 관찰종료(D22) 시까지 우화개체 및 이상증상을 관찰하였다.

우화개체 및 이상증상은 Table 3과 같이 S (surviving), AD (adult workers deformed), FM (failed molt), FA (failed adult molt), MD (melanizing death)로 총 6개 그룹으로 분리하여 관찰 기록하였다. S는 번데기가 성공적으로 우화하여 정상적인 성충이 된 경우, AD는 번데기가 우화하여 기형을 가진 성충이 된 경우, FM은 머리, 몸통에서 번데기의 외관적인 특징을 관찰할 수 있으나 불완전한 번데기 상태로 죽는 경우, FA는 번데기가 최종 탈피에 실패하여 우화하지 못하고 죽는 경우, MD는 유충이 어두운 색을 띄거나 검은 반점을 보이며 죽는 경우, ED는 유충이 번데기 단계로 넘어가기 이전에 갈변화가 일어나거나 먹이에 잠겨 죽는 경우에 해당한다.

꿀벌 유충의 imdacloprid 단회 및 반복노출의 LC₅₀과 LD₅₀ 산출은 미국 EPA에서 제공하는 Probit 통계 프로그램(EPA analysis program probit, Version 1.5)을 이용하였다. 유충 치사율, 번데기 치사율, 우화율에서 imidacloprid 처리군과 대조군의 통계적 유의성을 판단하기 위해 SPSS software(IBM Armonk, NY, USA)를 사용하였다. 카이제곱 검정(Pearson’s chi–square test)을 실시하였고 기대빈도가 5보다 작은 셀이 전체의 25% 이상인 경우 Fisher의 정확성 검정(Fisher’s exact test)의 결과를 해석하였다. P<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 판단 하였다.

단회 및 반복노출 시험의 양성대조군 dimethoate 치사율을 Fig. 2에 나타내었다. 단회노출 dimethoate 처리군은 처리 후 72시간 누적 치사율이 86.11% 이었다. 반복노출 dimethoate 처리군은 시험 7일차(D7)에서 누적 치사율이 93.8% 이었고 시험 22일차(D22)에서 우화율이 0%였다. 단회 및 반복노출 시험의 유충 치사율은 양성대조군 유충 치사율이 50% 이상이어야 한다는 OECD 시험조건에 부합하였다.

Fig. 2. 
Cumulative mortality of larva treated with dimethoate for single and repeated exposure tests.

Table 4는 시간에 따른 imidacloprid 처리군별 치사율을 나타낸다. 0.23, 0.58 μg/larva 처리군에서는 72시간 유충 누적 치사율이 30% 이하였고 1.44, 3.60, 9.00 μg/larva 처리군에서는 유충 누적 치사율이 70% 이상이였다. 3.60 μg/larva 처리군의 24시간, 48시간 후의 치사율이 1.44 μg/larva 처리군보다 더 높았지만 72시간에서는 두 처리 군 모두 누적치사율이 같았다. Table 5는 시험물질 처리 72시간 후 먹이가 남아 있는 유충 수를 나타낸다. 1.44 μg/larva 이상 처리군에서는 살아있는 유충 모두 먹이가 남았으며 유충이 살아 있어도 크기가 무처리군에 비해서 작았다. 0.58 μg/larva, 0.23 μg/larva 처리군에서는 살아있는 개체 중 각각 74%, 39.3%가 먹이가 남았다. 반면 무처리군과 용매 대조군에서는 먹이가 남아있는 유충이 없었다. 이는 imidacloprid가 저농도로 노출되어도 유충의 발달에 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다.

Starŏn et al. (2017)는 formetanate가 꿀벌 유충에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하였으며 시험 7일차에 처리 농도별 유충 치사율과 살아있는 유충의 남아있는 먹이 양을 조사하였다. 그 결과 formetanate 432.9 mg/kg 처리군에서 36마리 유충 중 19마리가 생존했지만 그 중 12마리는 발달이 저해된 상태로 먹이가 남아 있는 상태였다. 저자는 꿀벌 유충의 남아 있는 먹이는 유충 성장저해현상과 함께 나타날 수 있다고 보고하였다.

꿀벌 독성을 나타낼 때 고독성(LD₅₀= 0.001 – 1.99 μg/bee), 중간독성(LD₅₀= 2.0 – 10.99 μg/bee), 저독성(LD₅₀ >11 μg/bee)으로 분류한다(Hardstone and Scott, 2010). 본 연구에서는 LD₅₀ 값이 1.465 μg/larva 이고 이는 독성 스케일로 보았을 때 고독성에 속한다(Table 6). 참고문헌에 의하면 imidacloprid의 꿀벌 접촉 및 섭식 LD₅₀ 값은 각각 0.061, 0.013 μg/bee로 고독성이고 유충 LD₅₀ 값에 비해 24배 정도 독성이 높다(Sanchez-Bayo and Goka, 2014). 이 결과는 꿀벌 유충이 성체보다 imidacloprid에 대한 독성 민감도가 낮다는 것을 보여준다. 최근 imidacloprid 뿐만 아니라 thiamethoxam과 formetanate에 대한 유충 독성영향 연구에서도 유충이 성체에 비해 독성 민감도가 낮다고 보고된 바 있다(Dai et al., 2017; Staron et al., 2017; Tavares et al., 2015). Imidacloprid는 모든 nAChR에 작용하는 것이 아니라 특정 nAChR에 작용을 한다고 알려져 있다(Decourtye et al., 2004). 꿀벌은 11개의 nAChR subunit을 가지고 있고 각 subunit은 각기 다른 꿀벌 발육과정에서 발현된다(Jones et al., 2006). Imidacloprid의 주요 타겟이 되는 nAChR은 유충 초기 단계에서 형성이 되지 않는다(Yang et al., 2012). 이는 imidacloprid에 대한 유충과 성체의 독성 민감도 차이를 설명할 수 있는 주요 요인이 될 수 있다.

Fig. 3은 주요 일자별 누적 치사율을 나타낸다. 시험 8일차(D8)에 용매대조군 유충치사율은 5.56%, 0.23 μg/larva 처리군에서는 0.00%, 0.58 μg/larva 처리군에서는 2.78%였다. 용매 대조군의 치사율은 15% 이하로 OECD 기준에 적합하였다. 용매 대조군과 0.23 μg/larva 처리군의 시험 22일차(D22) 유충 치사율은 22.22% 이였다. 최고 농도 9.00 μg/larva 처리군에서는 시험 22일차(D22)에 유충이 100% 치사했으며 0.58, 1.44, 3.60 μg/larva 처리군에서 각각 36.11, 58.33, 86.11% 치사하였다.

Fig. 3. 
Evolution of mortality after oral application of five concentration of imidacloprid from day 4(D4) to day 22(D22).

용매대조군의 우화율은 77.78%로 우화율이 70%이상 되어야하는 OECD 기준에 적합하였다. 0.23 μg/larva 처리군의 우화율도 77.78%로 용매 대조군과 같았다. 1.44, 3.60 μg/larva 처리군에서는 우화율이 50% 이하였으며 최고 농도 처리군에서는 우화개체가 없었다. 용매 대조군 및 0.23, 0.58, 1.44 μg/larva 처리군의 치사증상은 유충치사율보다 번데기 치사율이 더 높았다. 이와 반대로 9.00 μg/larva 처리군에서는 유충 단계에서 약 70% 이상이 죽고 번데기 단계에서 30% 정도가 치사하였다(Fig. 4).

Fig. 4. 
Laval mortality, pupal mortality and adult emergence rate of honeybees exposed to imidacloprid. The comparisons between exposed groups and control were performed with Chi-square test and Fisher's exact test (^*P≤0.05, ^**P≤0.01 and ^***P≤0.001) (n=36 individuals per group from 3 replicates).

Table 7은 imidacloprid 반복노출 시험 후 LC₅₀ 과 LD₅₀값을 나타낸다. 시험 후 8일차(D8), 15일차(D15), 22일차(D22)의 LC₅₀ 값은 각각 45.078. 23.676, 10.778 mg/l 이었다. LD₅₀ 값은 각각 6.311, 3.315, 1.510 μg/larva 이었다.

Fig. 5는 용매대조군과 imidacloprid 처리군 별 치사개체 증상 및 성공적으로 우화한 비율을 나타내었다. Fig. 6은 본 시험에서 관찰된 시험 일자 별 정상개체와 이상증상 개체의 예시를 보여준다. 9.00 μg/larva 처리군에서는 ED가 66.7%로 유충 치사율은 대부분 시험 8일차(D8) 이전에 발생하였다. 3.6 μg/larva 처리군의 치사증상은 MD가 30.6%로 가장 많이 차지했고 그 다음이 ED가 25%를 차지하였다. 1.44 μg/larva 처리군에서는 22.2%가 성공적으로 우화하였고 ED가 16.7%, FM이 11.1%, FA가 30.6%, AD가 19.4%를 차지하였다. 0.58 μg/larva 처리군은 41.7%가 성공적으로 우화하였고 AD가 22.2% FA가 22.2%, FM이 8.3%, MD가 2.8%, ED가 2.8%였다. 0.23 μg/larva 처리군은 시험 8일차(D8) 이전에 죽은 치사개체가 없었고 S가 58.3%, AD가 19.4%, FA가 8.3%, FM이 8.3%, MD가 5.6%를 차지하였다.

Fig. 5. 
Percent of survivorship and observed mortality symptoms of larvae exposed to imidacloprid.

Fig. 6. 
Common symptoms observed in honey bee larval rearing tests.

유충단계와 번데기 단계의 치사개체를 보면 약제 처리양이 증가할수록 치사개체 증상이 유충단계에서 죽거나, 갈변화되어서 죽는 경우가 많았고, 약제 처리양이 감소할수록 치사개체 증상 중 FM과 FA의 비율이 ED와 MD의 비율보다 더 높았다.

용매 대조군에서는 우화율이 77.78% 인데 이 중 AD가 22.2%, S가 55.6%를 차지하였다. 0.23 μg/larva 처리군에서도 용매대조군과 비슷하게 AD가 19.4%, S가 58.3%를 차지하였다. 실제 벌통 내부에서 유충은 세로로 세워져 있는 소비판에서 성장하는 반면 실험실에서 유충을 사육할 때는 plate를 수평으로 놓고 기르게 된다. 이로 인해 꼽추 등(humpback) 또는 날개 기형(wing deformation) 현상이 일어날 수 있다고 알려져 있다(Brodschneider et al., 2009). 이는 본 시험에서 저농도 또는 용매대조군에서 AD가 우화개체 중 약 20% 정도 발생한 것을 설명할 수 있다. 선행연구에서는 이런 현상을 방지하기 위해 plate를 얇은 왁스층으로 덮고 우화박스에 세로로 부착하여 가능한 벌통내부와 비슷한 환경을 만들어 시험을 하였다(Tavares et et al., 2017) .

Tavares et al. (2017)은 thiamethoxam을 0.00001 ng a.i/μl, 0.001 ng a.i/μl, 1.44 ng a.i/μl 농도로 유충에 노출시켰고 0.001 ng/μl 처리군에서는 유충 치사율이 무처리군과 통계적으로 유의한 차이가 없었지만 번데기 치사율과 우화율에는 통계적으로 유의한 영향을 미친 결과를 보고하였다. 또한 Grillone et al. (2017)은 꿀벌 유충 발달 과정 중 thiamethoxam이 0.2, 0.5 mg/l 농도로 노출되었을 때 유충의 갈변현상, 성장 지연, 기형 성체 발생 등을 포함한 반치사(sublethal) 영향을 준다는 사실을 발견하였다.

Yang et al. (2012)은 imidacloprid를 0.4 ng/larva에서 8000 ng/larva까지 꿀벌 유충에 노출시켜 번데기화율(pupation rate), 우화율(eclosion rate)을 관측하였고 0.4 ng/larva에서는 imidacloprid가 유충 우화율에 영향을 주지 않았고 24 ng/larva 부터 8000 ng/larva까지 노출양이 증가함에 따라 우화율이 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 발견하였다. 또한 유충을 imidacloprid 0.0004-0.4 ng/larva로 처리하였을 때 0.04 ng/larva 이상 처리군에서 유충이 우화한 후 꿀벌 후각 행동이 영향을 받는 것을 발견하였다. 즉 imidacloprid가 유충 치사율에 영향을 주는 농도가 아닌 매우 저농도로 노출되어도 성체의 기억 및 학습능력에 영향을 줄 수 있다는 것이다.

본 시험에서 최저 농도처리군인 imidacloprid 0.23 μg/larva에서 우화율은 무처리군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았지만 선행연구 결과에 의하면 성체에서 기억 및 학습능력, 화분매개활동에 영향을 받을 것이라고 예상할 수 있다.

본 연구에서는 유충 단회 및 반복노출 시험법을 통해서 imidacloprid의 LD₅₀ 값을 구하였고 치사 및 이상증상을 관찰하였다. 향 후 본 연구에서 구축된 시험법을 활용하여 네오니코티노이드계 농약의 환경 중 검출 양으로 꿀벌 유충에 노출시켜 농약이 실제 유충단계뿐만 아니라 성체단계에서 어떤 영향을 미치는지 보다 정밀한 조사가 필요할 것이라고 생각된다.