Terpinen-4-ol (96.71% purity)과 α-terpinene (90% purity) 표준품은 각각 HWI group (Rülzheim, Germany)와 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan)에서 구입하였고, oleic acid (100% purity) 표준품은 Honeywell Fluka (Seelze, Germany)에서 구입하였다. γ-terpinene (97% purity), linoleic acid (98.5% purity), methyl oleate (99% purity), methyl linoleate (98.5% purity) 표준품과 tween 20, 14% BF₃ (Boron trifluoride)는 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)로부터 구입하였다. Acetone, isooctane, methanol, NaOH (sodium hydroxide), sodium sulfate anhydrous는 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. ENVI-Carb SPE (500 mg, 6 mL) 및 HLB SPE (60 mg, 3 mL) cartridge는 각각 Supelco (Philadelphia, USA) 및 Waters (Milford, USA) 로부터 구입하였다. Tea tree oil 에센셜 오일은 Niceday (Seoul, Korea)와 FGB (Melbourne, Australia)에서 2종을 구입하였고, tea seed oil 에센셜 오일은 Skinmate (Bucheon, Korea)와 Herbpeople (Guri, Korea)에서 2종을 구입하였다. 차나무 함유 유기농업자재 7종은 4개의 유기농업자재 제조업체로부터 구입하여 분석에 사용하였다.

유기농업자재 공시 기준에 “주성분이란 제품의 품질관리를 위하여 그 효과나 대표성 등을 나타낼 수 있는 이화학적 성분이나 규격을 의미한다”라고 정의하고 있다. 따라서 차나무 추출물의 원료인 tea tree oil과 tea seed oil의 주성분을 선정하기 위해서 이들이 함유하고 있는 성분을 문헌조사하였고 고유성분, 작물보호기능성분, 다량 함유성분을 바탕으로 주성분을 선정하였다.

Tea tree oil을 함유한 유기농업자재의 주성분 분석을 위한 정제방법으로는 S PE c artridge를 사용하였다. 에센셜오일의 경우 acetone으로 희석하고 유기농업자재 제품은 물에 10-100배 희석한 후 10% tween 20 용액과 1:1(v/v)로 섞어 정제용 시료로 준비하였다. Acetone 5 mL와 증류수 5mL를 순차적으로 흘려주어 활성화 한 ENVI-Carb SPE (500mg, 6 mL)에 정제용 시료 1mL를 주입하고 10분간 정치하였다. 10 mL의 증류수로 씻어준 후 acetone 10 mL로 주성분을 용출하였다(Fig. 1). 정제된 시료 중 1mL를 syringe filter (0.45 μm)로 여과한 다음 GC를 이용하여 Table 1의 기기조건에서 분석하였다.

Fig. 1. 
Flow chart for analysis of the active ingredients in tea tree oil.

차나무 추출물을 함유한 유기농업자재 제품 중 tea seed oil의 주성분 oleic acid와 linoleic acid를 분석하기 위하여 Choi et al. (2016)의 피마자유를 함유한 유기농업자재 중 ricinoleic acid 분석법과 같은 방법으로 정량분석법을 확립하였다(Fig. 2). Choi et al. (2016)는 피마자유를 원료로 사용하는 유기농업자재 제품의 주성분 ricinoleic acid를 정량하기 위한 saponification과 methylation에 최적의 반응 시간을 확립하였다. 액상 유기농업자재 20 mg에 isooctane 1 mL를 첨가하여 반응용 시료로 준비하였고, 0.5 N methanolic NaOH 1.5 mL를 첨가하고 혼합하여 100°C에서 5분간 가온하였다. 이후 30~40°C로 냉각하여 isooctane 1 mL와 14% BF₃ 용액 2mL를 첨가하고 혼합하여 100°C에서 5분간 가온하였다. 다시 30~40°C로 냉각하여 isooctane 1 mL를 첨가하고 30초간 격렬하게 진탕하였다. 포화식염수 5mL를 가하고 진탕하여 수 층과 분리된 isooctane 층을 무수황산나트륨으로 탈수시켰다. 수 층에 isooctane 1.5 mL를 추가로 넣고 2~3회 추출하였다. Isooctane 층을 질소농축하여 acetone 5mL로 재용해한 후 40배 희석하여 0.45 μm syringe filter로 여과한 다음 Table 2의 기기조건에서 정량분석을 실시하였다. 검량선은 각각 acetone에 희석한 methyl oleate와 methyl linoleate의 표준용액을 사용하여 작성하였고, 분석 시료 중 methyl oleate와 methyl linoleate 함량을 계산한 후 이를 지방산 전환계수를 사용한 환산식에 따라 각각 oleic acid와 linoleic acid의 함량으로 환산하였다. 지방산 전환계수는 지방산과 지방산 메틸에스테르의 분자량 비로 산출하였다 (Devries et al., 1999).

Fig. 2. 
Flow chart for analysis of the active ingredients in tea seed oil.

※ oleic acid의 지방산 전환계수 : 0.9527
※ linoleic acid의 지방산 전환계수 : 0.9524

Tea tree oil 및 tea seed oil 주성분의 정량분석을 위한 시험방법의 유효성은 검량곡선의 직선성, 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 회수율 및 상대표준편차를 사용하여 검증하였다. 검량곡선의 직선성은 표준용액 6개 농도를 Table 1과 Table 2의 조건에서 각각 3반복 주입하여 얻은 평균값으로 작성하였고, 기기상 S /N비(signal to noise ratio)가 10이 되는 농도를 분석물질 각각의 기기정량한계(Instrument LOQ; ILOQ)로 정하고, 희석배수를 고려하여 분석정량한계(Method LOQ; MLOQ)를 산출하였다. 회수율 시험은 2개 이상의 수준으로 처리하고 상기의 분석방법에 따라 3회 반복 수행 하였다.

ISO 4730(2004)에 따르면 tea tree oil에는 terpinen-4-ol이 30-48% 수준으로 함유되어 있어 tea tree oil의 대표성분으로 볼 수 있으며, tea tree oil이 최적의 항균활성을 나타내기 위해서는 terpinen-4-ol이 최소한 30% 이상 함유되어 있어야 한다고 보고되어 있다. 또한 γ-terpinene이 10-28%, α-terpinene이 5-13% 수준으로 함유하고 있어 이들 3개의 성분이 tea tree oil에 가장 많이 함유되어 있는 성분으로 보고 되어 있다(ISO, 2004). 이 성분들은 Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus 등의 세균(Carson & Riley, 1995)과 곰팡이균(Hammer et al., 2003; Carson et al., 2006)에 대한 항균활성이 있으며, 살충효과(Ma & Zhang, 2004; Abbassy et al., 2009; Klauck et al., 2014)에 대해서도 보고되어 있다.

유차나무(Camellia oleifera) 종자에는 평균적으로 47.83%의 오일이 함유되어 있으며, 유차나무 종자에서 추출한 tea seed oil에는 지방산이 다량 함유되어 있다. 그 중 oleic acid (C18:1)는 53.5~76.7%, linoleic acid (C18:2)는 2.0~5.6% 수준으로 함유되어 있어 tea seed oil 중 2가지 성분이 가장 다량 함유된 성분으로 보고되어 있다(Ma et al., 2011; Shao et al., 2015; Yang et al, 2016a). Oleic acid는 세포막의 정상적인 기능을 방해하여 병원균을 죽이는 살균효과, 진딧물 등에 대한 살충효과가 있으며 이끼에 대한 제초효과가 있는 것으로 알려져 있다(Paranjape et al., 2014). 따라서 tea tree oil 판정용으로 terpinen-4-ol, γ-terpinene, α-terpinene 세가지 성분을 주성분으로 선정하였고(Fig. 3), tea seed oil 판정용으로 oleic acid, linoleic acid 두 성분을 주성분으로 선정하였다(Fig. 4).

Fig. 3. 
Chemical structures of the active ingredients in tea tree oil.

Fig. 4. 
Chemical structures of the active ingredients in tea seed oil.

차나무 추출물을 함유한 유기농업자재 제품 중 tea tree oil의 주성분인 terpinen-4-ol, γ-terpinene, α-terpinene을 분석하기 위해 ENVI-Carb SPE cartridge로 정제 하였다(Fig. 1). 유기농업자재 제품에 부자재로 함유되어 있는 계면활성제를 전처리 과정에서 제거하고자 SPE (solid phase extraction) 정제방법이 활용되며, 제품을 물로 희석한 수용액 상태의 시료를 적용할 수 있는 Envi-carb 또는 HLB cartridge의 유용성이(Lee et al., 2013; Lim et al., 2014a; Lim et al., 2014b; Lim et al., 2015; Yang et al., 2016b; Choi et al., 2016)에서 검증된 바 있다. 정제하기 전 유기농업자재의 희석방법에 따른 효율을 비교한 결과, 표준용액을 물로 희석해서 cartridge에 주입한 경우 회수율이 23.4~40.5%, 희석하지 않고 주입한 경우 26.1~37.8%, 10% tween 20으로 2배 희석하여 주입한 경우 55.5~61.1%로 나타났다. 따라서terpinen-4-ol, γ-terpinene, α-terpinene 세 성분을 동시에 분석하기 위해서는 10% tween 20으로 2배 희석한 후cartridge에 주입하는 것이 효율적인 것으로 확인되었다. 수용해도가 1,767mg/L인 terpinen-4-ol은 비교적 물에 잘 녹지만, γ-terpinene, α-terpinene은 수 용해도가 각각 5.92mg/L, 8.72 mg/L로 물에 잘 녹지 않는 특성을 가지고 있다(Carson et al., 2006; Bio-pesticides Database (BPDB), University of Hertfordshire). 계면활성제는 수용액 내의 소수성 성분의 용해도를 증가시키는 역할을 하기 때문에 (Rosen, 1989; Lee et al., 2002), 오히려 제품을 희석할 때 계면활성제를 첨가함에 따라 분석 효율이 증가한 것으로 보인다.

Tea tree oil의 주성분의 GC-FID 분석을 통한 크로마토그램을 Fig. 5에 나타내었으며, 결정계수(R²)는 모두 0.9997이상으로 직선성이 양호한 수준으로 확인되었다. Terpinen-4-ol, γ-terpinene, α-terpinene의 기기정량한계(ILOQ)는 모두 0.5mg/L이고 분석정량한계(MLOQ)는 20mg/L이었다. Tea tree oil을 함유하지 않은 유기농업자재 제품을 control 시료로 사용하였으며, 대상 성분에 대한 특이성은 나타나지 않았다. 회수율을 20, 200mg/L 두 수준에서 확인한 결과terpinen-4-ol은 평균 103.2~105.4%, γ-terpinene은 75.9~100.5%, α-terpinene은 70.0~82.9% 수준으로 확인되었고, 상대표준편차는 모두 10% 이하로 확인되어 전처리 방법이 차나무추출물 함유 유기농업자재 중 tea tree oil의 주성분 terpinen-4-ol, γ-terpinene, α-terpinene의 분석에 적합함을 확인하였다(Table 3).

Fig. 5. 
Chromatogram of α-terpinene, γ-terpinene, terpinen-4-ol by GC-FID.

또한 tea seed oil의 주성분의 GC-FID 분석을 통한 크로마토그램을 Fig. 6에 나타내었으며, 이들 결정계수(R²)은 모두 0.9997 이상으로 직선성이 양호한 수준으로 확인되었다. Oleic acid, linoleic acid의 기기정량한계(ILOQ)는 모두 0.1mg/L이었고, 분석정량한계(MLOQ)는 oleic acid 95.27 mg/L, linoleic acid 95.21 mg/L 이었다. Oleic acid 및 linoleic acid 200 mg/L, 500 mg/L 두 수준에서 회수율을 확인한 결과, oleic acid의 평균 회수율은 70.8~89.3%, linoleic acid는 76.4~97.6%이었으며, 상대표준편차도 모두 10% 이하로 확인되어 전처리 방법이 유기농업자재 중 oleic acid 및 linoleic acid 분석에 적합함을 확인하였다(Table 3).

Fig. 6. 
Chromatogram of methyl oleate and methyl linoleate by GC-FID.

확립된 분석법을 활용하여 분석한 결과, Tea tree oil 에센셜 오일 2종에는 terpinen-4-ol 12.45~35.29%, γ-terpinene 5.74~13.66%, α-terpinene 2.94~6.19%의 수준으로 함유되어 있었다. 차나무 추출물 함유 유기농업자재 중에서는 1개 제품에서만 terpinen-4-ol 5.79%, γ-terpinene 3.76%, α-terpinene 1.11% 수준으로 함유되어 있는 것으로 나타났다(Table 4). Tea seed oil 에센셜 오일 2종에는 oleic acid 53.68~69.22%, linoleic acid 8.38~16.50% 수준으로 함유되어 있었으며, 차나무 추출물 함유 유기농업자재 제품 중 액상과 고상 7개의 제품에서 oleic acid 0.01~2.09%, linoleic acid 0.01~1.33% 수준으로 함유되어 있는 것으로 나타났다(Table 5). 같은 종류의 오일의 경우에도 원료의 품종 및 재배지역에 따라 화학적 조성 및 함량이 달라질 수 있으며(Yang et al., 2016a; Yang et al., 2008), 유기농업자재 제조공정의 차이까지 고려하면 제품 중 주성분의 함량을 일률적으로 관리하기는 어려운 점이 있다. 그러나 확립된 분석법을 통해 유기농업자재 제품에 사용된 원료의 확인 및 함량 미달 제품의 관리 등 유기농업자재의 공시 제품의 품질관리에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.