대표 농산물 중 살균제 Pencycuron의 HPLC 정밀 잔류분석법 개발

시약 및 초자

본 연구에 사용한 모든 유기용매는 HPLC급(Burdick & Jackson, USA)이었고 sodium chloride와 무수 sodium sulfate는 GR급(Junsei chemical Co., Japan)이었으며, formic acid (≥ 95%)는 Sigma Aldrich (USA)에서 구입하였다. 증류수는 Milli-Q ultrapure water purification system(Millipore Co., USA)에 의해 18.2MΩ 수준으로 정제된 증류수를 사용하였다. Pencycuron 표준품(99.9%)과 흡착 크로마토그래피용 florisil (60-100 mesh) 및 silica gel (70-230 mesh)을 Fluka (Switzerland)에서 구입하였으며, Florisil와 Silica gel은 실험에 사용하기 전에 130^oC 오븐에서 5시간 이상 활성화시켰다. 시료 균질화를 위해 믹서기(HMF-1000A, 한일, 한국)를 이용하였고 추출을 위해 진탕추출기(SA-2s, Taitec, Japan)를 사용하였으며 시료 추출액 농축 시 감압농축기(R-114, Buchi, Switzerland)를 사용하였다. 추출액 여과 시 GF/A 여과지(Whatman International Ltd., UK)를 사용하였다.

농산물 시료

Pencycuron이 함유된 농약 제품은 벼, 딸기, 인삼, 마늘에 사용 등록되어 있으며(KCPA, 2016), 위 작물들을 포함하여 기타농산물에 농약 잔류허용기준이 설정되어 있다(MFDS, 2016b)(Table 1). 따라서, 본 연구의 대표 작물로써 채소류 중 배추와 고추, 과일류 중 사과 및 곡류 중 현미를 선정하였으며, 대상 농산물은 시중에서 유통 중인 친환경 또는 무농약 작물로 구입하였다. 시중에서 구입한 농산물은 믹서기를 이용하여 균질화 하였으며, 현미의 경우 분쇄 후 표준체 420 μm를 통과시켜 균질화 하였다. 균질화된 시료는 분석할 때까지 비닐백에 담아 -20^oC에서 보관하였다.

Table 1.

Maximum residue limits for pencycuron in agricultural produsts

표준용액 조제 및 보관

표준품을 1,000 mg/L가 되도록 acetonitrile에 용해시켜 stock solution을 조제하였다. Working solution은 분석 당일에 stock solution을 acetonitrile으로 희석하여 0.05, 0.1, 1, 5, 10, 15 mg/L 농도가 되도록 조제하였다. Stock solution은 냉장고 4^oC에 보관하였으며 실험기간 동안 pencycuron 분해는 발생하지 않아 표준용액의 안정성을 확인하였다.

HPLC 분석조건 및 LC/MS 확인분석조건 설정

Pencycuron 잔류분 분석은 diode array detector (DAD)가 장착된 Agilent 1100 series HPLC (Agilent Technologies Inc., USA)를 사용하였다. 컬럼은 작물 종류에 따라 역상 C18 컬럼인 Luna C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm, Phenomenex Inc., USA)과 Gemini-NX C18 (150 × 4.6 mm, 3 μm, Phenomenex Inc., USA)을 사용하였다(Table 2). LC-DAD를 이용하여 분석된 잔류분의 신뢰성을 확보하기 위해 LC/mass spectrometry (MS)로 확인분석하였다. LC/MS분석은 Varian 500-MS IT-MASS spectrometer (Varian Inc., USA)를 사용하였다. 컬럼은 작물 종류에 관계없이 역상 C18 컬럼인 Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 2.6 μm, Phenomenex Inc., USA)을 사용하였다(Table 3).

Table 2.

HPLC condition for pencycuron residue analysis

Table 3.

LC/MS condition for confirmation of pencycuron residue

HPLC 분석법 검증

본 연구에서 확립된 HPLC 기기분석법을 검증하기 위해 기기검출한계(Instrumental limit of detection, ILOD) 및 기기정량한계(Instrumental limit of quantitation, ILOQ), 재현성(Reproducibility) 및 직선성(Linearity)을 확인하였다. ILOD 및 ILOQ 결정을 위해 pencycuron 표준용액 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/L을 차례로 20 μL씩 HPLC에 주입하여 크로마토그램 상의 signal과 noise의 비를 구하였으며, s/n > 3 또는 > 10에 해당되는 농도를 ILOD 또는 ILOQ로 설정하였다. Pencycuron 표준검량선 작성 및 직선성 확인을 위해 working solution 0.1, 1, 5, 10, 15 mg/L을 20 μL씩 HPLC에 주입하여 peak의 면적을 측정하였다.

추출 및 분배용매별 분배효율 검토

식품공전 및 앞선 문헌에서 pencycuron을 추출하는데 사용된 바 있는 acetone을 추출용매로써 선정하였다(Roll & Comis, 1989; Choi et al., 2005). 분배효율 검토를 위해 50 mL의 증류수와 포화식염수 50 mL 혼합물에 pencycuron 표준용액을 처리하여 1 mg/L 수준이 되도록 한 후, 분배용매를 각각 100 mL, 50 mL씩 첨가하여 분배하였다. 검토 대상 분배용매로는 dichloromethane, ethyl acetate, n-hexane이었다. 분배 후 유기용매 층을 무수 sodium sulfate에 통과 시켜 수분을 제거하고 40^oC 이하에서 감압농축하였으며, 농축잔사를 2 mL acetonitrile에 재용해하여 기기분석 하였다. 분배용매 및 분배용매 사용량에 따른 분배추출효율을 각각 산출하였다.

흡착 크로마토그래피의 정제조건 설정

유리컬럼(안지름 15 mm, 길이 350 mm)에 10 g의 활성화된 흡착제(florisil와 silica gel)와 3 g의 무수 sodium sulfate을 차례로 건식충진한 후, 100 mL의 n-hexane을 가하여 유출시켜 버렸다. 고정상 상단이 노출되기 전에 5 mL의 pencycuron 표준용액 1 ppm을 고정상 상단에 가하고 1 mL의 n-hexane으로 유리컬럼 내벽을 씻은 후 유출시켰다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ethyl acetate 비율이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%인 ethyl acetate/n-hexane 혼합액 100 mL를 순차적으로 용출시킨 후 용출액을 농축하여 acetonitrile 5 mL로 재용해하여 시험용액으로 하였다. 흡착제 종류에 따라 용출액별 pencycuron 용출효율을 각각 산출하였다.

분석정량한계

Pencycuron 분석을 위한 전처리 과정이 확정된 이후, 기기분석 상의 정량한계(ILOQ)와 전처리 과정의 시료채취량, 최종 시험용액량, 분석조작에 따른 희석 또는 농축배수를 고려하여 전체 분석법의 분석정량한계(Method limit of quantitation, MLOQ)를 산출하였다(Lee et al., 2009; 식 1).

컬럼내의 pencycuron 머무름 특징 및 효율성

농산물 추출액을 HPLC로 분석하였을 때 농산물 매질 존재하에 pencycuron의 머무름 특징을 확인하기 위해 capacity factor (k)를 식 2에 따라 머무름 시간과 보정머무름시간(t_r'; adjusted retention time)을 이용하여 산출하였다(식품의약품안전처, 2013).

t_R = retention time of pencycuron
t₀= retention time of a non-retained compound, dead time
t_R' = t_R − t₀ = adjusted retention time

컬럼의 효율성(Column efficiency)을 확인하기 위해 이론단수(N; Number of plates)와 이론단높이(H; Height of theoretical plates)를 산출하였다(Rood, 2007).

W_h= peak width at half height

농산물별 pencycuron 회수율 실험

균질화된 무처리 시료 25 g을 정밀히 달은 후 표준용액 첨가법에 따라 MLOQ, 10MLOQ, 100MLOQ 수준이 되도록 각각 처리한 다음 100 mL의 acetone을 가하여 1시간 동안 진탕 추출하였다. 현미는 추출 전에 증류수 25 mL를 넣어 시료를 습윤화시켰다. 추출물은 여과지를 이용해 흡인여과하고, 30 mL acetone으로 잔사 및 용기를 씻어내어 앞의 여액과 합하였다. 합친 여액을 40^oC 이하의 수욕조에서 감압 농축하였다. 농축잔사를 50 mL 포화 식염수가 담긴 500 mL 분액여두에 50 mL 증류수와 100 mL n-hexane으로 헹구어 담고 격렬히 진탕한 후 층이 분리될 때까지 정치하였다. n-Hexane 층을 무수 sodium sulfate에 통과 시켜 탈수한 후, 다시 n-hexane 50 mL을 가하여 상기의 과정을 한 번 더 분배 추출하고 추출액을 합하여 40^oC 이하에서 감압농축한 후 n-hexane 5 mL에 재용해 하였다. silica gel 컬럼에 추출액 5 mL를 가하고 농축잔사를 약 n-hexane 1 mL로 헹구어 합쳐 유출시켜 버렸다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ethyl acetate:n-hexane (10/90, v/v)용액 100 mL를 컬럼에 가해 흘려 버린 후 ethyl acetate:n-hexane (20/80, v/v)용액 100 mL를 가하여 용출시켜 받았다. 용출액을 40^oC 이하에서 감압농축한 후 5 mL acetonitrile로 재용해하여 HPLC로 분석하였다. 이 과정을 3번 반복실험하여 농산물별 처리수준에 따른 회수율을 산출하였다.

UV 흡광 파장 결정

Pencycuron는 형광을 발생하는 특성을 나타내지 않으므로 범용 HPLC 검출기 중 UV 흡광검출기를 적용하여 분석하였다. Pencycuron 표준용액 1 ppm을 DAD로 분석함으로써 UV 흡광 특성을 조사한 결과, 최대 흡광파장이 240 nm에서 관찰됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 잔류분 분석 시 흡광 파장으로 240 nm를 채택하여 분석하였다(Fig. 2).

Fig. 2.

Ultraviolet spectrum of pencycuron.

HPLC 분석법 확립 및 검증

Pencycuron 분석용 컬럼은 일반적으로 가장 많이 사용되고 있는 C18 컬럼을 적용하였으며, 재현성이 뛰어난 isocratic 조건으로 분석조건을 설정하였다. 모든 농산물에 동일한 HPLC 기기조건을 설정함이 가장 효율적이나, 농산물별 매질효과가 상이함으로 분석조건 설정원칙 중 분석의 신뢰성 확보를 최우선하여 기기분석 조건을 설정하였다. 따라서, 현미와 고추의 경우 사과 및 배추와는 다른 간섭물질 존재로 인하여 C18 계열의 분리능이 상이한 Phenomenex Gemini-NX C18 (150 × 4.6 mm, 3 μm)을 이용하여 분석하였고, 이동상 조성 및 유속은 농산물 매질별 최적의 pencycuron 분리가 가능한 조건으로 최적화 하였다(Table 2). 기기검출한계(ILOD) 및 기기정량한계(ILOQ)는 크로마토그램 상 signal/noise 비가 각각 3배, 10배 이상 되는 농약의 양으로 결정하였으며(Fong et al., 1999; Miller, 2005), pencycuron의 lLOQ는 2 ng이었다. 잔류분 정량을 위한 검량선은 0.1~15 mg/L 범위의 표준용액을 이용하여 작성되었으며, 표준용액 농도와 피크 면적간의 회귀방정식으로부터 산출된 결정계수(R²)는 0.9996~0.9999로 검량선의 직선성은 양호하였다(Fig. 3).

Fig. 3.

Calibration curve of pencycuron.

분배효율에 따른 액-액 분배 조건 결정

액-액 분배를 통해 작물별 추출물 매질내의 극성 방해물질을 제거하고자 하였다. 검토된 분배 용매는 n-hexane, ethyl acetate 및 dichloromethane 세 종류 용매이었다. 용매 100 mL를 이용한 1차 분배에서 회수율이 63.7~80.2%로 분배효율이 좋지 않았으며, 추가로 진행된 용매 50 mL를 이용한 2차 분배를 포함한 회수율은 74.2~83.2%로 n-hexane를 이용한 분배의 경우만 80%를 상회하는 회수율을 보였다(Table 4). 따라서, 분배 용매로 n-hexane을 이용하여 100 mL, 50 mL 씩 두 번 분배하는 것으로 분배 조건을 결정하였다.

Table 4.

Efficiency of liquid-liquid partitiona) with three different solvents

흡착 크로마토그래피 정제 최적화

액-액 분배 이후, 추가 정제를 위해 흡착 크로마토그래피를 이용하였으며, 흡착제로는 널리 사용되는 florisil와 silica gel를 검토하였으며 용출 용매로는 ethyl acetate/n-hexane 혼합액을 사용하였다. 두 가지 흡착제를 이용한 흡착 크로마토그래피에서 모두 ethyl acetate 비율이 20%일 때 101.6~103.7%가 용출되었다(Table 5). 흡착제로 florisil를 사용하였을 경우, ethyl acetate 비율이 10%일 때 2.0% 용출된 반면, silica gel를 사용하였을때는 용출되지 않았다. 따라서, 분배액의 정제조건은 세척과정을 추가할 수 있는 silica gel를 사용하여 설정하였으며, ethyl acetate/n-hexane 10:90(v/v) 혼합액 100 mL로 컬럼을 세척하고 ethyl acetate/n-hexane 20:80(v/v) 혼합액 100 mL로 pencycuron을 용출하는 세부 정제조건을 확립하였다.

Table 5.

Recovery rate by sequential elution of ethyl acetate/n-hexane mixture

분석정량한계(MLOQ)

분석정량한계(MLOQ)는 시료 전처리 및 분석과정을 통틀어 전체 분석법을 통해 시료 내의 분석물질을 정량할 수 있는 한계치로써, 분석장비의 정량한계, 시료주입량, 시료채취량 및 희석 또는 농축배율 등을 고려하여 산출된다(Lee et al., 2009). 본 연구에서 설정된 분석법의 경우, pencycuron의 ILOQ가 2 ng, HPLC 주입량 20 μL, 시험용액량 5 mL, 시료채취량 25 g, 희석배수 1이므로 MLOQ는 0.02 mg/kg으로 산출되었다. 본 연구로 설정된 pencycuron의 MLOQ 수준은 농산물 중 최저 잔류허용기준인 풋마늘 0.05 mg/kg 수준을 충분히 정량할 수 있는 수준이기에 잔류 분석법으로써 적합하다고 판단된다.

컬럼 내의 머무름 특징 및 효율성

본 연구에서 확립된 방법에 따라 조제된 농산물별 시험용액을 설정된 HPLC 기기조건에 따라 분석하였을 때 나타나는 pencycuron의 컬럼 내 머무름 특징 및 컬럼 효율성을 검토하였다. Pencycuron의 머무름 시간은 배추와 사과의 경우 10.37분, 10.48분인 반면, 현미와 고추에서는 13.21분, 13.03분이었으며(Table 6), pencycuron 머무름 시간대에 매질별 간섭물질이 확인되지 않음으로써 분석의 선택성이 양호하였다(Fig. 4). 한편, 농산물별 pencycuron 머무름 시간의 차이는 컬럼의 종류, 이동상 조성 등의 차이로 인한 것이었다. Capacity factor, k값은 배추와 사과의 경우 각각 4.16, 4.12인 반면, 현미와 고추에서는 11.95, 11.82이었다. Capacity factor가 낮으면 짧은 시간내에 분석이 가능하지만 선택성 및 분해능을 확보하기 어렵기 때문에 일반적으로 4~8 되는 분석조건을 결정한다(Lee et al., 2009; Kwon et al., 2011; Lee et al., 2015). 현미와 고추의 경우 k값이 10 이상으로 시료당 분석시간이 길어 많은 시료를 분석하는데 어려움이 존재하였다. 하지만, 이는 현미와 고추 추출물 매질 내 간섭물질 영향이 배추와 사과보다 큰 상황이었기에 pencycuron의 선택성을 확보하기 위해 배추와 사과의 분석조건보다 이동상의 acetonitrile 비율을 55%로 낮추고 분해능을 향상시키기 위해 충진제 pore 크기가 3 μm인 컬럼을 사용함으로써, pencycuron 머무름 특성을 분석의 효율성보다는 분석능 향상을 우선시한 결과이었다. 이론단수(N)과 이론단 높이(H)를 통해 컬럼의 분리 효율을 검토한 결과, 배추 및 사과에서는 pencycuron의 N이 14421, 18814이었고 H는 0.017, 0.013 mm이었으며 현미와 고추에서는 N값이 9853, 8144이었고 H는 0.015, 0.018 mm이었다. 따라서, 현미와 고추 분석 시 capacity factor는 배추 및 사과 분석 시보다 높지만 분리효율은 유사한 수준이었다.

Table 6.

HPLC chromatographic behavior of pencycuron

Fig. 4.

HPLC chromatograms of pencycuron. A; control, B; fortified at 0.2 mg/kg.

분석법의 농산물별 회수율

본 연구에서 확립된 추출, 분배, 정제 및 기기분석법에 따라 농산물 중 pencycuron 잔류분 회수정도를 확인함으로써 분석법의 정확성과 정밀성을 확인하였다. 무처리 농산물 시료에 표준용액 첨가법에 따라 처리수준이 MLOQ (0.02 mg/kg), 10MLOQ (0.2 mg/kg, 100MLOQ (2 mg/kg)인 회수율 시료를 조제하여 회수율 실험을 수행하였다. 농산물별 처리 수준별 3번 반복 실험하였다. 회수율 결과, MLOQ 수준에서는 82~108%, 10MLOQ수준에서는 72~93%, 100MLOQ 수준에서는 81~87%의 양호한 회수율을 보였고, 정밀성(CV < 10%)도 우수하여 식약처의 단성분 분석법 기준인 회수율 70~120%, C.V ≤ 20%을 만족하였다(Table 7). 따라서, 본 연구를 통해 확립된 pencycuron 분석법은 신뢰성이 보장된 높은 감도의 분석법으로 다양한 작물의 잔류수준 검정에 적용될 수 있는 분석법임을 확인할 수 있었다.

Table 7.

Recovery of pencycuron by different agricultural commodities

잔류분의 재확인

본 연구에서 확립된 잔류분석법을 이용하여 분석된 pencycuron 잔류분 결과에 대한 신뢰성을 확보하기 위해 재확인(confirmation)용 LC/MS법을 확립하였다. ESI (electro spray ionization) positive mode에서 capillary voltage 60 V에서 이온화하였고 이동상은 HPLC와 같은 acetonitrile/water 혼합액에 추가로 이온화를 위한 proton을 제공하고 해당 peak의 모양을 향상시키는 장점을 가지고 있는 formic acid를 0.1%사용하였다(Lee et al., 2011). Pencycuron 표준용액 1 mg/L, 5 μL를 주입하여 total-ion chromatogram (TIC)과 mass spectrum을 확인하였다(Fig. 5). 머무름시간 3.3분에 pencycuron을 확인할 수 있었으며, pencycuron의 nominal mass가 328.1이기에 ESI positive mode에서 m/z가 329.2인 양성자화된 분자이온 [M+H⁺]을 확인할 수 있었고 해당 이온을 SIM 분석을 위한 ion으로 결정하였다. 한편, pencycuron 분자구조 내 존재하는 1개의 Cl 원자로 인하여 Cl 동위원소 ³⁵Cl와 ³⁷Cl의 비율 100:32.5에 따라 [M+H⁺=329]와 [M+2+H⁺=331]이 확인되었다. 농산물 종류별 pencycuron 잔류분을 앞서 설정된 LC/MS법에 따라 분석한 결과, pencycuron 머무름 시간대에 분석 간섭물질이 관찰되지 않아 본 LC/MS법을 잔류분 재확인 분석법으로 결정하였다(Fig. 6).

Fig. 5.

Total-ion chromatogram (A) and full scan mass spectrum (B) of pencycuron by LC/MS. A standard solution (1 μg/mL) was analyzed.

Fig. 6.

Selected-ion monitoring chromatograms of pencycuron by LC/MS. A; control, B; fortified at 0.02 mg/kg.