LC-QTOF-MS를 활용한 현미 중 동물용의약품의 정량 분석

서 론

동물용의약품(veterinary pharmaceuticals)은 동물질병의 예방 및 치료를 위하여 사용하는 의약품으로, 양봉용, 양잠용, 수산용 및 애완용 의약품을 포함한다. 한국동물약품협회와 농림축산검역본부에 따르면 2015년 현재 우리나라에서는 tetracycline, penicillin, sulfonamide, macrolide, quinolone, ionophore, polypeptide, phenicol, aminoglycoside, pleuromutilin, lincosamide, cephem, strptogramin, orthosomycin, glycolipid, quinoxaline, nitrofuran 및 기타류 7002 품목의 동물용의약품이 허가되어 판매되었고(약 6,661 억원), 이 중 67.9%가 생물학적 제제, 사료첨가제, 항병원성 약으로 사용되었으며, 전체 판매된 동물의약품 중 사료첨가, 동물투여 및 원료의 비율은 각각 8.7, 89.5 및 1.8%로 대부분이 동물투여에 사용되었다.

우리나라 가축분뇨 발생량은 2013년 현재 72,103 농가(허가대상 17,115 농가, 신고대상 54,988 농가)에서 173,052 m³/일 발생하고 있으나, 런던협약에 따라 2012년부터 가축분뇨의 해양투기가 전면 금지되어 발생량의 6.6% (11,476 m³/일) 만이 101개의 가축분뇨 공공처리시설에서 처리되고 있는 실정이다(Ham et al., 2011; Environmental Statistics Yearbook, 2015). 동물에 투여된 동물용의약품 중 상당수는 체내에서 대사되지 않고 최대 90%까지 모화합물 형태로 분뇨를 통해서 배출되고, 이들은 가축의 배설을 통해 목초지에 직접 투여되거나 거름살포를 통해 간접적으로 환경에 투여된다(Huang et al., 2001; Boxall et al., 2002; Kulshrestha et al., 2004; Sassman and Lee, 2005). 직·간접적으로 환경에 투여된 동물용의약품은 토양에 직접적으로 유입되거나 관개수 및 유출수에 의해 하천 및 농경지에 유입되고, 용탈에 의해 지하수에 유입된다(Hirsch et al., 1999; Kim et al., 2008; Park et al., 2010; Kim and Myung, 2010; Huh and Myung, 2010; Zhao et al., 2016; Ide et al., 2016; Chen et al., 2016). 최근 농경지에 유입된 chloramphenicol, chlorotetracycline, enrofloxacin, erythromycin, lincomycin, norfloxacin, oxytetracycline, sulfadiazine, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulphathiazole, tetracycline, trimethoprim, tylosin 등의 동물용의약품이 감자, 고수풀, 고추, 당근, 무, 배추, 벼, 상추, 샐러리, 시금치, 오이, 옥수수, 유채, 토마토에서 0.02-42,510 μg/kg 수준으로 흡수됨이 보고되고 있다(Boxall et al., 2006; Dolliver et al., 2007; Hu et al., 2010; Seo et al., 2010; Sabourin et al., 2012; Kang et al., 2013; Wu et al., 2013; Goldstein et al., 2014; Malchi et al., 2014; Pan et al., 2014; Wu et al., 2014; Hurtado et al., 2016; Chung et al., 2017; Lee, 2017).

현미는 벼의 왕겨만을 벗겨낸 쌀로서 배(embryo), 배유(albumen) 및 쌀겨(호분)층으로 구성되어 있고, 백미에 비하여 영양분의 손실이 적으며 지방, 단백질, 비타민, 식이섬유 및 각종 무기질 등이 풍부하여 영양성이 뛰어나고, 콜레스테롤 저하작용, 혈압상승 억제, 항돌연변이 작용, 항산화 활성 등의 기능성이 알려져 국민들의 건강에 대한 관심이 증대함에 따라 백미보다 현미 소비가 증가하는 추세에 있다(Madaz, 1983; Muramoto and Kawamura, 1991; Champnagne and Hron, 1992; Chun et al., 1995; Choi et al., 1996; Kang et al., 2006; Kim et al., 2012; Lee and Han, 2015).

Liquid chromatography (LC)-quadrupole time of flight(QTOF)-mass spectrometry (MS)는 질량범위만 입력하여 분석하므로 분석법 설정에 소요되는 시간이 짧고, 스캔속도가 빨라 동시에 분석할 수 있는 성분 수도 제한이 없으며 정확한 분자량 및 조각이온의 패턴확인이 가능하여 항생제, 농약 등의 정량·정성분석 및 미지성분에 대한 동정에 사용되어 왔다(Prieto et al., 2011; Broecker et al., 2012; Masiá et al., 2013; Boix et al., 2014; Sirtori et al., 2014). 따라서 본 연구에서는 liquid chromatography (LC)-quadrupole time of flight (QTOF)-mass spectrometry (MS)를 활용하여 현미 중 국내 다사용 항생제에 대한 다성분 동시분석법을 개발하고자 하였다.

재료 및 방법

시약 및 표준품

조사대상 동물용의약품 amoxicillin, ampicillin, ceftiofur, chlortetracycline, doxycycline, erythromycin, fenbendazole, flumequine, lincomycin, oxolinic acid, oxytetracycline, penicillin, spiramycin, sulfadiazine, sulfamethazine 및 trimethoprim 표준품은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), clopidol, enrofloxacin, sulfadimethoxine, sulfamethoxazole, sulfathiazole, tiamulin, tilmicosin 및 tylosin 표준품은 Fluka (Shanghai, China)로 부터 구입하여 사용하였다 (Fig. 1).

Fig. 1.

The structure of veterinary pharmaceuticals.

시료 정제를 위한 ENVI-Carb (500 mg, 6 mL) 및 LC-Si glass tube (1,000 mg, 6 mL) solid phase extraction (SPE) cartridge는 Supelco (Philadelphia, USA), NH₂ (500 mg, 6mL), graphite carbon (500 mg, 6 mL) 및 primary secondary amine (PSA, 500 mg, 6 mL) SPE cartridge는 GL Sciences (Tokyo, Japan), Florisil (1,000 mg, 6 mL) 및 C₁₈ (500 mg, 6mL) SPE cartridge는 Sillicycle (Quebec, Canada), hydrophilic lipophilic balance (HLB, 500 mg, 6 mL) 및 Wax (150 mg, 6 mL) SPE cartridge는 Waters (Massachusetts, USA), Silica gel (1,000 mg, 6 mL) SPE cartridge는 Applied Separations (Pensylvania, USA)로 부터 구입하여 사용하였다. 시료 중 동물용의약품 추출, 재 용해 및 기기분석을 위한 내부표준물질 umbelliferone과 triethylamine은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), methanol 및 ethanol은 J.T. Baker Tedia (Ohio, USA)의 제품을 사용하였다.

SPE cartridge 효율성 검증

현미 중 조사대상 동물용의약품 정량분석의 정제에 적용할 ENVI-Carb, NH₂, Florisil, HLB, graphite carbon, Silica gel, LC-Si glass tube, Wax, C₁₈ 및 PSA SPE cartridge 효율성은 회수율 시험으로 조사하였다. 선정된 10종류의 SPE cartridge에 ethanol을 사용하여 1 μg/L 동물용의약품 혼합액을 제조한 다음 50 mL distilled water (DW)를 가하고, 이를 각각의 DW와 methanol로 활성화 한 각각의 cartridge에 loading 하였다. 각각의 cartridge에 methanol 12 mL를 가하여 흡착된 동물용의약품을 용리시킨 후 농축하고, 이를 내부표준물질 umbelliferone (1 mg/L) 함유 ethanol 5 mL로 재 용해하여 LC-QTOF-MS (DE/Impact II, Bruker Korea, Seongnam, Korea)로 분석한 다음 회수율을 산출하였다(Table 1, 2, 3). 이로부터 가장 양호한 회수율 결과를 나타낸 cartridge를 현미 중 동물용의약품 정량을 위한 재료로 선택하였다.

Table 1.

Analytical conditions (HPLC-QTOF-MS) for veterinary pharmaceuticals in brown rice

Table 2.

The alignment process and parameters for LC-QTOF-MS

Table 3.

Mass spectrometer characteristics of veterinary pharmaceuticals

분석법의 유효성 검증

현미 중 동물용의약품 잔류량 분석을 위한 분석법의 유효성은 검량선의 직선성, 회수율 시험, 정량한계(limits of quantitation, LOQ) 및 상대표준편차(relative standard deviation)로 검증하였다. 검량선의 직선성은 시험대상 동물용의약품 표준품을 ethyl alcohol에 각각 용해하여 내부표준물질 umbelliferone (1 mg/L) 함유 0.1-1,000 μg/L 수준의 표준용액을 조제한 다음 Table 1의 기기조건에서 분석한 다음 내부표준물질과 각각의 성분간 피크의 면적비율로 검량선을 작성하여 직선성을 확인하였다. 시험대상 항생제 각 성분의 LOQ는 S/N (signal to noise ratio) 비가 10이 되는 농도로 하여 다음의 식으로부터 산출하였다.

$\[ \text{LOQ}\left(\text{μg/L}\right)\text{=}\frac{\text{최소검출량}\left(\text{pg}\right)\text{×최종재용해량}\left(\text{mL}\right)}{\text{기기주입량}\left(\text{μL}\right)\text{×시료량}\left(\text{mL}\right)} \]$

(1)

회수율 시험은 혼합표준용액을 현미 10 g에 25와 50 μg/kg 수준으로 처리한 다음 Fig. 2의 방법에 따라 3반복으로 실시하였고, 각각의 성분 피크면적을 각각의 검량선에 대입하여 산출한 농도와 첨가농도의 비로부터 회수율(%)을 산출하였다.

Fig. 2.

Flow chart for analysis of veterinary pharmaceuticals in brown rice.

결과 및 고찰

SPE cartridge 효율성

현미 시료 중 동물용의약품 분석 시 정제에 적합한 cartridge를 선발하기 위하여 본 연구에서 시험된 ENVI-Carb 등 10개의 cartridge는 하천수, 과일, 작물, 커피, 우유, 폐수, 분뇨 등 다양한 시료에서 농약, 항생제, 곰팡이 독소 (mycotoxin), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), persistent organic pollutants (POPs) 등의 분석 시 정제과정에 사용되어 왔다(Tsubouchi et al., 1988; Sannino, 1998; Doong and Lee, 1999; Sheridan and Meola, 1999; Fernández et al., 2000; Moret and Conte, 2000; Jaraczewska et al., 2006; Karthikeyan and Meyer, 2006; Xu et al., 2009; Yoo et al., 2009). 선발된 10종류의 cartridge 효율성은 1 μg/L 수준의 24종의 동물용의약품 혼합액을 사용하여 회수율시험을 통하여 조사하였다. 10종류의 cartridge 중 HLB cartridge는 chlortetracycline, clopidol, doxycycline, oxytetracycline 및 tilmicosin 5종의 동물용의약품에서 회수율이 다소 낮은 39.6-63.8%를 이었으나, 이들을 제외한 19종에서는 회수율이 71.0-112.7% 범위로 농촌진흥청에서 권장하는 회수율 70-120% 기준을 충족하였다(RDA, 2016, Table 4). 따라서 현미 중 동물용의약품 다성분 동시분석을 위한 전처리 도구로서 HLB cartridge를 선정하였다.

Table 4.

Recoveries of veterinary pharmaceuticals in selected ten cartridges

분석법의 유효성

본 연구에서는 분석의 정확성을 높이기 위하여 내부표준법을 사용하였으며, 내부표준물질로는 동물용의약품 정량에 쓰이는umbelliferone을 사용하였다(Wu et al., 2008). 동물용의약품 24종의 검량선은 0.1-1,000 μg/L 혼합표준용액(1.000 mg/L umbelliferon포함)을 제조하고, Table 1, 2 및 3의 LC-QTOF-MS 조건에서 분석한 다음 내부표준물질과 각 성분간 피크의 면적비율로부터 작성하였다. 각 성분의 머무름시간은 amoxicillin 1.3 (y=0.0019x+0.0292, R²=0.9862), ampicillin 6.5 (y=0.00104x+0.0355, R²=0.9929), ceftiofur 9.8 (y=0.0165x-0.0125, R²=0.9958), chlortetracycline 8.8 (y=0.0247x+0.0107, R²=0.9971), clopidol 5.4 (y=0.0181x+0.0251, R²=0.9912), doxycycline 9.3 (y=0.0691x-0.171, R²=0.9982), enrofloxacin 7.3 (y=0.0751x+0.1399, R²=0.9946), erythromycin 10.9 (y=0.0263x+0.6024, R²=0.9941), fenbendazole 12.6 (y=0.3188+0.7697, R²=0.9957), flumequine 11.6 (y=0.0463x+0.1887, R²=0.9959), lincomycin 6.0 (y=0.0573x+0.0977, R²=0.9946), oxolinic acid 9.4 (y=0.0418x+0.0639, R²=0.9961), oxytetracycline 6.8 (y=0.0142x+0.0322, R²=0.9928), penicillin 11.8 (y=0.0067x+0.1034, R²=0.9936), spiramycin 8.7 (y=0.0124x-0.2619, R²=0.9980), sulfadiazine 5.4 (y=0.006x+0.0143, R²=0.9901), sulfadimethoxine 10.1 (y=0.1019x+0.1685, R²=0.9955), sulfamethazine 7.0 (y=0.0399x-0.1427, R²=0.9939), sulfamethoxazole 8.7 (y=0.0314x+0.0425, R²=0.9950), sulfathiazole 5.9 (y=0.0051x+0.0056, R²=0.9947), tiamulin 12.1 (y=0.3806x+1.6423, R²=0.9930), tilmicosin 10.0 (y=0.0207x-0.0671, R²=0.9970), trimethoprim 6.6 (y=0.0926x+0.6609, R²=0.9894), Tylosin 11.3 (y=0.0903x+0.1033, R²=0.9960) 분 이었고, 검량선의 직선성은 상관계수(R²)가 >0.9862 으로 양호하였다(Table 3, Fig. 3).

Fig. 3.

Standard chromatogram (A), representative ion chromatogram (B), mass spectrum (c), and recovery chromatogram of LC-QTOF-MS.

현미 중 동물용의약품에 대한 회수율 시험은 25와 50 μg/kg 수준에서 수행하였고, 그 결과를 Table 5에 나타냈다. Erythromycin, fenbendazole, penicillin 및 tylosin을 제외한 현미 중 동물용의약품 20 성분의 회수율, RSD 및 LOQ는 각각 70.3-112.0%, 1.1-5.7% 및 0.076-7.6 μg/kg 범위로 나타났다(Table 5). 이상의 현미 중 회수율과 RSD결과는 회수율 70-120%, RSD 20% 이하로 잔류분석법 기준에 적합하였다(RDA, 2016).

Table 5.

Recovery, LOQ, and RSD of veterinary pharmaceuticals in brown rice

본 연구는 현미 중 동물용의약품 정량을 위해 HLB cartridge를 활용하여 정제하고, LC-QTOF-MS로 분석하는 방법의 유효성을 검증한 것으로, 현미 중 동물용의약품 20성분을 동시에 분석하는 다성분 동시분석법의 최초의 보고이다. 이 분석법은 농업환경 및 농산물 중 동물용의약품에 대한 모니터링 조사 및 분석법 개발을 위하여 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 우리나라는 2019년부터 국내 사용등록 또는 수입식품의 잔류허용기준(MRL, maximum residue level) 설정 신청으로 MRL이 설정된 농약 이외에는 일률기준(0.01 mg/kg)으로 관리하는 positive list system(PLS)을 모든 농산물에 적용한다. 식품의약품안전처는 식품위생법 제7조의3(농약 등의 잔류허용기준 설정 요청 등)에 따라 식품 및 수입식품에 잔류하는 농약관리법에 따른 농약, 약사법에 따른 동물용의약품의 잔류허용기준 설정이 필요한 자는 관련 자료를 쭓Y@제출하여 기준설정을 신청 및 요청할 수 있도록 하고 있다. 따라서 PLS가 모든 농산물에 적용되는 2019년 이후에는 본 연구에서 개발한 현미 중 동물용의약품 다성분동시분석법의 amoxicillin 등 일부 성분은 LOQ가 PLS의 일률기준 0.01 μg/kg 보다 다소 낮은 수준(7.6 μg/kg)으로 정량분석 요구 수준을 충족하지 못할 수 있으므로 이를 해결하기 위한 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것으로 판단된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업 및 국립농업과학원(PJ012600, PJ010922, PJ012092, PJ010822 및 PJ011435)의 지원에 의해 이루어졌습니다.

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