액체크로마토그래피를 이용한 농산물 중 fenoxasulfone의 잔류 분석법

시약 및 기구

실험에 사용된 methanol, dichloromethane, acetonitrile, n-hexane 등은 HPLC 등급으로 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 염화나트륨, 여과보조제(celite 545), 무수황산나트륨, 포름산은 Sigma Aldrich (Buchs, Switzerland)에서 구입하였으며 SPE 카트리지는 Agilent technologies사(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료전처리를 위한 분쇄기는 BLIXER 5 Plus (Robot coupe, USA)를 이용하였으며 균질기는 Ultra-turrax T-25 (IKA, USA), 감압농축기는 Rotavapor R-215 (Büchi, USA)를 이용하였다. Fenoxasulfone (99.5%)의 표준품은 ㈜성보화학에서 제공받아 사용하였으며 표준품을 acetonitrile에 용해하여 1,000 μg/mL의 표준원액을 조제하였다. 이를 acetonitrile을 이용하여 단계적으로 희석하여 0.1, 0.5, 1, 5, 25, 50 μg/mL를 제조하여 회수율 실험 및 기기분석에 사용하였다. 표준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 -20^oC에 보관하여 실험에 사용하였다.

농산물 시료

농산물 시료는 다양한 농산물에 분석이 적용될 수 있도록 작물 분류표(Ministry of food and drug administration, 2016)에서 사과, 고추, 감자, 현미, 대두 등 5작물을 선정하여 대형마트에서 구입하였다. 식품공전의 잔류농약 분석을 위한 농산물 검체 전처리 방법에 따라 처리하여 사과는 심과 양쪽 오목한 부분 제거하고 고추는 꼭지를 제거하였으며 현미와 대두는 그대로 실험에 이용하였으며 -20^oC에서 냉동보관하면서 실험에 이용하였다.

추출

농산물중 fenoxasulfone의 분석을 위해 시료 20 g을 정밀히 달아 500 mL tall beaker에 넣었다. 현미와 대두는 물 50 mL를 더 넣고 30분간 방치했다. 여기에 acetone 150 mL를 넣은 후 균질기로 10,000 rpm에서 2~3분간 균질화 한 후 이를 여지(No. 2)에 celite 545를 깔아둔 Büchner funnel에서 감압여과 하였다. 잔류물을 acetone 30 mL로 씻어 내려 상기 여액과 합친 후 1 L 분액깔때기로 옮기고 dichloromethane 50 mL, 포화염화나트륨 용액 50 mL 및 물 450 mL를 가한 후 10분간 격렬하게 진탕하고 층이 완전히 분리될 때까지 정치한 후 dichloromethane층을 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수시켰다. 여기에 dichloromethane 50 mL를 다시 가하여 진탕하고 층이 완전히 분리될 때까지 정치한 후 dichloromethane층을 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수시켜 앞의 액과 합하였다. 이액을 40^oC 이하에서 감압농축하여 건고시킨 후 잔류물을 n-hexane 5 mL에 용해하였다. 곡류, 두류 등 지방성 검체의 경우 상기 건고물을 acetonitrile로 포화된 n-hexane 50 mL로 녹여 500 mL 분액깔때기로 옮기고 n-hexane으로 포화된 acetonitrile 50 mL로 2회 분배추출하여 acetonitrile 층을 40^oC 이하에서 감압농축하여 건고시키고 n-hexane 5 mL로 용해했다.

Solid-phase extraction (SPE) cartridge 정제

n-Hexane 10 mL로 활성화한 aminopropyl SPE cartridge(1 g, 6 mL)에 n-hexane 5 mL로 용해한 위의 용액 5 mL를 가했다. 여기에 n-hexane/acetone (97.5/2.5, v/v) 10 mL를 가하여 씻어서 버리고 n-hexane/acetone (90/10, v/v) 10 mL를 가하여 받아 이 용리액을 40^oC 이하에서 농축하여 acetonitrile 1 mL에 용해하여 HPLC분석에 이용하였다. 현미와 대두의 경우 n-hexane 10 mL로 활성화한 Florisil SPE cartridge (1 g, 6 mL)에 앞의 n-hexane 5 mL로 용해한 용액을 전량 가하고 여기에 n-hexane/acetone (97.5/2.5, v/v) 10 mL를 가하여 씻어서 버리고 n-hexane/acetone (90/10, v/v) 10 mL를 가하여 받은 후 이 용리액을 40^oC 이하에서 농축하여 acetonitrile 1 mL로 용해하여 기기분석에 이용했다.

기기분석

HPLC는 Agilent 1100 series (USA)를 사용하였고 검출기는 UVD를 사용하였으며 파장은 240 nm를 사용하였다. 컬럼은 INNO Column Aegispak C₁₈-L (250 mm × 4.6 mm, 5 um, 영진바이오크롬)를 사용하였고 이동상은 acetonitrile/water (63/37, v/v) 용액을 분당 1.0 mL의 유속으로 흘렸다. 컬럼온도는 40^oC로 하였으며 주입량은 20 uL였다. 잔류분의 재확인을 위해 사용된 LC-MS/MS는 ABSciex 3200Qtrap (USA)이었으며 분석 컬럼은 Zorbax SB-C₁₈ (100 × 2.1 mm, 3.5 μm, Agilent technologies)을 사용하였다. 이동상은 0.1% formic acid 함유 acetonitrile/0.1% formic acid 함유 water (63/37, v/v)를 분당 0.2 mL로 사용하였고 컬럼온도는 25^oC였으며 주입량은 5 μL였다. 이온화 소소의 조건은 ESI positive-ion mode를 사용하였으며 ionspray voltage는 5000 V, drying gas 온도는 550^oC, curtain gas는 10 psi를 사용하였다.

분석법 검증

본 연구에서 확립된 전처리법과 기기분석법을 검증하기 위해서 농약이 처리되지 않은 각 농산물 분쇄시료에 0.025, 0.25, 1.25 μg/g의 수준으로 각 농도별로 3반복으로 회수율 시험을 실시하였고 각 회수율 시험의 결과로부터 농산물별 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 구하였다. 또한 HPLC에 표준용액을 농도수준별로 주입하여 검량선의 직선성을 조사하였다. 분석법상의 정량한계(LOQ)는 EU 가이드라인(SANTE 11945/2015)에 따라 잔류분석법 기준이 만족되는 가장 낮은 첨가농도로 설정하였다.

시료 추출 및 분배과정 확립

Fenoxasulfone은 Log Pow 값이 3.03의 중간 극성 물질(Kumiai chemical industry, 2012)이며 해리하지 않는 특성을 갖고 있어 일반적인 극성용매로의 추출이 가능하므로 중간극성에서 비극성의 농약을 농산물로부터 추출하기 위해서 주로 사용하는 acetone, acetonitrile, ethylacetate (Anastassiades et al., 2003) 중에서 fenoxasulfone에 대한 용해도가 47.8 g/L로써 가장 높은 acetone을 사용하였다. 추출 후 검체 추출액은 1차적으로 불순물 제거를 위해 수용성 추출 용매를 농축하지 않고 물로 희석하여 비극성 유기용매를 첨가하여 분리하는 것이 가능할 것으로 판단되어 acetone 추출액에 물 450 mL를 가하고 포화염화나트륨 용액 50 mL를 첨가하여 수분층과 유기용매 층을 명확하게 분리하였다. 여기에 분배 용매 선정을 위해 n-hexane, n-hexane/dichloromethane (8/2, v/v), dichloromethane의 세가지 용매를 이용하여 분배효율을 측정하였다. n-Hexane과 n-hexane/dichloromethane은 수용액층 위에 분포하므로 액액분배를 2회로 늘릴 경우 별도의 분액 깔때기로 옮겨서 분배를 진행하는 번거로움 때문에 100 mL 1회 분배조건을 선택하였고 dichloromethane의 경우 수용액층 아래에 분포하므로 50 mL 2회로 분배조건을 선택하여 비교하였다(Table 2). 실험 결과 n-hexane 100 mL 1회와 n-hexane/dichloromethane (8/2, v/v) 100 mL 1회는 77~82% 범위였으나 dichloromethane 50 mL 2회 분배 조건에서 회수율이 94%정도로 가장 양호하여 분배용매로 선정하였다. 현미의 경우 약 2%, 대두의 경우 약 18%의 지질을 함유하고 있고(Rural development administration, 2011) 이는 액-액분배 과정 이후에도 남아 있으므로 n-hexane으로 포화된 acetonitrile과 acetonitrile로 포화된 9n-hexane 분배과정을 추가하여 지질을 제거하였다(Table 3).

Table 2.

Efficiency of extract solvent of fenoxasulfonea

Table 3.

Recoveries of fenoxasulfone from acetonitrile/nhexane partitiona

Solid-phase extraction (SPE) cartridge 정제

Fenoxasulfone은 비해리 상태(Table 1)의 비극성 상태로 존재하므로 고추를 대상으로 Florisil SPE cartridge와 aminopropyl SPE cartridge를 이용하여 n-hexane/acetone을 이용하여 정제조건을 확립하고 비교한 결과 aminopropyl SPE cartridge에서 회수율도 양호하고 농약 피크 주위 간섭물질도 작아 aminopropyl SPE cartridge를 이용하여 분석조건을 확립하였다. Aminopropyl SPE cartridge의 정제 조건을 확립하기 위해 n-hexane과 acetone 혼합액을 이용하여 실험한 결과 n-hexane/acetone (97.5:2.5, v/v) 10 mL를 이용하여 세척하고 n-hexane/acetone (90:10, v/v) 10 mL로 용리하는 조건으로 분석할 때 93%의 양호한 회수율을 보였다(Table 4). 또한 aminopropyl SPE cartridge 사용 후에도 간섭물질이 남아있는 경우 Florisil SPE cartridge를 추가할 수 있도록 정제조건을 설정하였다. Florisil SPE cartridge의 정제 조건을 확립하기 위해 n-hexane과 acetone 혼합액을 이용하여 실험한 결과 n-hexane/acetone (97.5:2.5, v/v) 10 mL를 이용하여 세척하고 n-hexane/acetone (90:10, v/v) 10 mL로 용리하는 조건으로 분석할 때 92%의 양호한 회수율을 보였다(Table 4).

Table 4.

Comparison of elution solvents for fenoxasulfone from aminopropyl and Florisil SPE

기기분석조건 확립

Fenoxasulfone은 구조내에 chloride를 2개 포함하고 있으며 비공유 전자쌍이 많아 GC-ECD로 분석이 가능하였으나 분석시 저농도에서 피크의 재현성이 나쁘고 선형의 정량곡선 확보가 불가하였다. 따라서 fenoxasulfone이 UV발색단으로 알려진 불포화 유기작용기들과 조색단인 비공유전자쌍을 함유한 작용기를 많이 함유하고 있기 때문에 HPLC/UVD로 분석을 시도하였다. HPLC분석을 위해 PDA (Photodiode array) 검출기로 210 nm에서 400 nm까지 측정파장을 스캔한 결과 최대흡수파장(λmax)이 239 nm임을 확인하였다(Fig. 2). 분석용 컬럼은 INNO Column Aegispak C₁₈-L(250 mm × 4.6 mm, 5 um, 영진바이오크롬) 칼럼을 사용하였고 이동상은 acetonitrile과 water (63/37, v/v)를 1 mL/min로 흘려주었을 때 머무름 시간은 9분으로 적합하였으며 주입량은 20 μL였다(Table 5).

Fig. 2.

LC-UVD spectrum of fenoxasulfone.

Table 5.

HPLC conditions for the determination of fenoxasulfone

무처리 시료와 회수율 시료는 확립된 시험방법에 따라 분석한 결과, 농산물 시료 중 fenoxasulfone의 머무름 시간대에 방해피크가 검출되지 않았다. 표준용액의 직선성(linearity)을 확인하기 위하여 0.1, 0.5, 1, 5, 25, 50 μg/mL 20 μL를 HPLC에 주입하여 분석한 결과 표준용액에서 결정계수(R²)는 1.0000으로써 높은 직선성을 보여주었다(Fig. 3).

Fig. 3.

Calibration curve of fenoxasulfone in the concentration range of 0.1 μg/mL to 50 μg/mL.

회수율 및 정량한계

시험법의 정확성과 재현성 및 효율성을 평가하기 위하여 LOQ, LOQ 10배, LOQ 50배 수준인 0.025, 0.25, 1.25 μg/g의 처리농도로 대두, 사과, 고추, 감자, 현미에 대하여 fenoxasulfone의 회수율 실험을 3반복으로 수행하였다. 각 농도에서 평균 회수율은 71.2-89.8%이었고 상대표준편차는 모두 7.2% 미만으로 조사되어(Table 6) 국내기준(Ministry of food and drug administration, 2013) 및 국제식품규격위원회(Codex)의 잔류분석법 기준(CAC/GL 40-1993)을 만족하였다. 분석법상의 정량한계(LOQ)는 EU 가이드라인(SANTE 11945/2015)에 따라 잔류분석법 기준이 만족(회수율: 70~120%, RSD: ≤ 20%)되는 가장 낮은 첨가농도인 0.025 μg/g으로 설정하였다. 농산물 중 fenoxasulfone의 회수율 크로마토그램은 Fig. 4에 제시하였는데 fenoxasulfone이 검출되는 시간대에 방해피크는 관찰되지 않았다.

Table 6.

Validation results of analytical method for the determination of fenoxasulfone

Fig. 4.

Representative HPLC chromatograms of fenoxasulfone: (A) blank, (B) spiked at 0.025 μg/g, (C) spiked at 0.25 μg/g and (D) spiked at 1.25 μg/g.

검출성분의 재확인

본 연구에서는 HPLC/UVD로 검출된 농약의 확인을 위해 LC-MS/MS 조건을 확립하였다. MS/MS 분석은 MRM(multiple reaction monitoring) mode를 이용하였는데 fenoxasulfone 분자의 precursor 이온으로써 [M+H]⁺인 367과 [M+NH₄]⁺인 383부터 생성된 product 이온들의 MRM 쌍들의 감도를 비교한 결과 [M+NH₄]⁺이온으로부터 생성된 product 이온들의 감도가 높아 precursor 이온으로써 [M+NH₄]⁺를 선정하였다(Table 7). 확립된 LC-MS/MS분석조건은 Table 8에 나타내었다. 확립된 분석법을 이용하여 분석한 결과 농약이 첨가되지 않은 시료에서는 방해피크가 발견되지 않아서 잔류분 확인에 사용이 가능한 것으로 보인다(Fig. 5). 확립된 LC-MS/MS 조건을 이용하여 첨가농도 0.025 μg/g 수준에서의 회수율 시험에 따른 농산물 추출물을 분석한 결과 표준용액에서의 MRM 쌍들의 피크 면적 비율과 일치하였고 크로마토그램에서 fenoxasulfone에 대한 방해피크가 나타나지 않았다.

Table 7.

Ions and retention time (tR) of fenoxasulfone for LC-MS/MS analysis

Table 8.

Analytical conditions for the determination of fenoxasulfone

Fig. 5.

Representative LC-MS/MS chromatograms of fenoxasulfone: (left) sample controls, (right) spiked at 0.025 μg/g.