In chemico 펩타이드 반응성 시험(Direct Peptide Reactivity Assay)을 이용한 농약 원제의 피부 감작성 평가

서 론

우리나라에서는 농약을 등록·판매하기 위해서 농약관리법에 따라(RDA, 2020) 연간 신규 및 10년 경과된 농약 원제 250-300여건과 농약 품목 1,300-1,400여건이 검토·평가되고있다(Jin et al., 2018). 이 중 농약의 독성 평가 항목 시험 중 피부에 농약이 노출되었을 때 나타나는 독성을 평가하는 피부 감작성 시험이 있다. 농약 사용 시 피부를 통해 직, 간접적으로 흡수되면 T세포 매개 면역 독성의 일환인 피부 감작성으로 인한 대표적인 질환으로 알러지성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis, ACD)을 유발할 수 있으므로 이에 대한 평가는 매우 중요하다(Girolomoni et al., 2004; Maxwell et al., 2011; Ezendam et al., 2016).

피부 감작성을 평가하기 위해 기니피그가 실험동물로 가장 많이 사용되고 있으며, 이를 이용한 기니피그 극대화 시험 방법(Guinea pig maximization test (GPMT), Magnusson and Kligaman, 1969; Magnusson, 1980)과 폐쇄첩포시험 방법(Buehler test (BT), Buehler, 1965) 등의 여러가지 시험법들이 오랫동안 가장 보편적으로 사용되어 왔다. 하지만 이러한 시험법들은 많은 수의 실험동물이 요구되며 시험기간도 장기적이다. 또한 실험동물 사용에 의한 윤리적인 문제가 대두되면서, 3R 원칙(replacement, refinement, reduction, 3R)에 의거하여(Rosholt, 2005; MFDS, 2017), 경제협력개발기구(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 및 유럽연합의 유럽대체실험검증센터(European Union Reference Laboratory for alternative to Animal Testing, EURL-ECVAM)에서는 개발되고 있는 동물대체시험을 검증하고 채택하기 시작하였다(EURL-ECVAM 2013; OECD, 2015a;OECD, 2015b; OECD, 2016a; OECD, 2016b; Ezendam et al., 2016). 가장 보편화 된 대체시험방법으로 마우스의 국소 림프절의 세포내 ATP량을 측정하여 림프구 증식 정도를 분석하는 국소림프절시험법(Local Lymph Node Assay, LLNA)이 OECD 가이드라인에(OECD Test Guideline 429) 등재되어 피부 감작성 평가에 사용되고 있으나, 이 방법 또한 마우스가 필요하며 방사선 동위 원소를 사용해야 하는 어려움이 있었다. 이를 완화한 DA(developed by Daicel Chemical Industries, Ltd.)법을 이용한 국소림프절 시험법(LLNA: DA, OECD TG 442A) 및 ELISA법을 이용한 국소림프절 시험법(LLNA: BrdU-ELISA, OECD TG 442B)이 등재되었다(OECD, 2010a; OECD, 2010b; OECD, 2010c). 그 후 동물을 사용하지 않는 인체유래 각질세포, 단백질 등을 사용하는 in chemico 또는 in vitro 실험으로 발전하여 특정 화학물질과 피부조직 단백질과 결합 정도를 이용한 펩타이드 반응성 시험(In chemico skin sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA, OECD TG 442C), ARE-Nrf2 루시퍼라아제 시험(In vitro skin sensitisation: ARE-Nrf2 luciferase test method, OECD TG 442D) 및 THP-1 세포주를 통해 특정 항원의 발현 정도를 이용한 인체 세포주 활성화 시험(Human Cell Line Activation Test, h-CLAT, OECD TG 442E) 등의 다양한 시험법이 등재 되었다(OECD, 2015a; OECD, 2015b; OECD, 2016).

피부 감작성 대체시험법 중 펩타이드 반응성 시험법(DPRA)은 피부 감작성 물질이 피부를 통해 체내에 들어오면 시스테인 또는 리신 등의 단백질과 결합하여 화학적 변형으로 거대 분자 면역원인 합텐-단백질 복합체(haptenized protein)를 형성하는 합텐화 과정(Girolomoni et al., 2004; Adler et al., 2011; Maxwell et al., 2011; Vinken, 2013)에서 착안하였다. DPRA는 리신 및 시스테인이 함유된 펩타이드와 시험 물질의 합텐화 과정 평가를 통해 결합된 펩타이드를 제외하고 순수 펩타이드 검출이 어느 정도로 감소(depletion)하는지를 액체크로마토크래피(HPLC)를 이용하여 측정하는 방법으로 다양한 피부 감작성 독성발현경로(Adverse Outcome Pathway, AOP) 중 첫번째 주요반응(key event 1)을 이용하여 분자 시작단계(molecular initiating)에서 피부 감작성을 평가하는 시험법이다(Maxwell et al., 2014; OECD, 2015a; Tollefsen et al., 2014; MFDS, 2016).

이러한 국제적인 추세에 맞춰 우리나라에서도 화장품, 농약 등의 안전성을 평가하기 위해 동물대체시험법을 도입하여 운영하고 있다. 식품의약품안전처에서는 화장품의 동물대체시험법 가이드라인을 통해 화장품 독성시험 분야에 대체시험법을 보급하였다(MFDS, 2016). 농촌진흥청 고시 농약 및 원제의 등록기준에 따라 인축독성 시험기준과 방법에 in chemico 피부 감작성시험: 펩타이드 반응성 시험법(DPRA)을 2019년에 추가 신설해 두었다 (RDA, 2020). 그러나 아직까지 DPRA 시험법에 관해서는 화장품 분야에 사용되는 원료를 대상으로 연구가 진행되고 있으며, 농약에 대해서는 피부 감작성을 평가한 연구 사례는 매우 적은 상황이다. 이에 본 연구에서는 국내 등록되어 사용중인 농약 중 2014년부터 2018년도 까지 출하량이 높은 농약 원제 10종(KCPA, 2019)을 선발하여 DPRA를 이용하여 피부 감작성을 평가하였다.

재료 및 방법

펩타이드 반응성 시험(Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA)

본 연구는 OECD TG 442C로 등재된 In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) 및 유럽연합 동물대체시험법 관련 연구 추진기관(EURL-ECVAM)의 검증 연구(ECVAM Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA for skin sensitisation testing DB-LAM Protocol No.15)에 의거하여 시험을 수행하였다(EURL-ECVAM, 2013; OECD, 2015a; MFDS, 2016; DB-ALM, 2020). 표준검량곡선을 작성하기 위해 시스테인 및 리신 함유 펩타이드 표준용액 0.534-0.0167 mM을 총 6 개 농도로 준비하였다. 농약 원제, 숙련도 물질 및 양성대조군(cinnamaldehyde)에 대한 용매는 acetonitrile, distilled water (DW), DW:acetonitrile=1:1(v/v), isopropanol, acetone, isopropanol:acetone=1:1(v/v), DMSO:acetone=1:9(v/v), DMSO:acetone=1:1(v/v)의 순으로 완전히 용해되는 것을 우선적으로 선정하였다. 시스테인 및 리신 함유 펩타이드 용액에 100 mM 시험 물질을 각각 1:10 및 1:50 비율로 혼합 하였다. 25 ± 2.5°C에서 24 ± 2시간 동안 암실에서 반응시킨 후, 펩타이드 용액은 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)에서 UV 검출기를 이용하여 220 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 펩타이드 소실률은 다음과 같은 식을 통하여 산출하였다.

$\[ \begin{array}{l}\mathrm{펩}\mathrm{타}\mathrm{이}\mathrm{드}\mathrm{ }\mathrm{소}\mathrm{실}\mathrm{ }\mathrm{백}\mathrm{분}\mathrm{율}=\\ \left[1-\left(\frac{\mathrm{검}\mathrm{체}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{펩}\mathrm{타}\mathrm{이}\mathrm{드}\mathrm{ }\mathrm{피}\mathrm{크}\mathrm{ }\mathrm{면}\mathrm{적}}{\mathrm{참}\mathrm{고}\mathrm{ }\mathrm{대}\mathrm{조}\mathrm{군}\mathrm{ }\mathrm{C}\mathrm{의}\mathrm{ }\mathrm{펩}\mathrm{타}\mathrm{이}\mathrm{드}\mathrm{ }\mathrm{피}\mathrm{크}\mathrm{ }\mathrm{면}\mathrm{적}\mathrm{ }\mathrm{평}\mathrm{균}}\right)\right]\times 100\end{array} \]$

평가된 시험 물질에 대해 산출된 시스테인 및 리신 소실률을 합산한 평균값으로 각각 4가지 무반응성, 저반응성, 중반응성 및 고반응성으로 분류된 예측모델을 통해 피부 감작성에 대해 판정하였다. 본 시험 전에OECD TG에서 제시된 숙련도 물질을 통해 시험의 숙련도를 검정하였으며. 실험은 총 3반복하여 진행하였다. 펩타이드 반응성 시험법에 대한 시험 진행과정을 도식화 하여 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1.

Procedure of Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitization.

HPLC 조건 및 분석 순서

펩타이드와 시험 물질을 반응시킨 시료를 분석하기 위해 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Model: Agilent 1220 series HPLC system, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다. 칼럼은 Zorbax SB-C18(3.5 μm, 2.1 mm × 100 mm, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, 용매 A (0.1% (v/v) Trifluoroacetic acid in water)와 용매 B (0.085% (v/v) Trifluoroacetic acid in acetonitrile)를 이동상으로 하여 0-10분에 이동상 용매 B가 10%에서 25%로 직선구배 후 10-13 분에 90%, 13 분에서 13.5 분에 10%, 13.5 분에서 20 분까지 10%가 되도록 하여, flow rate 0.35 mL/min로 설정하였다. UV spectrometer를 통해 220 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 주입량은 5 μL로 설정하였다(Table 1). 시험 분석순서는 검량표준액(STD1-6 및 희석용액)와 참고대조군 A, 동시용출대조군, 참고대조군 B, 분석시료 3반복(참고대조군 C, 양성대조군 및 시험물질 순으로) 및 참고대조군 B의 순서로 물질 분석 디자인을 설정하여 분석하였다.

Table 1.

HPLC condition for DPRA

시험 결과 유효성 기준 및 판정 기준

펩타이드 소실률은 각 검체에서 피크 면적을 구하고 참고 대조군 C의 평균 피크 면적으로 나눈 값으로 결정하였다. HPLC분석의 유효성 기준으로는 표준검량곡선의 상관계수 R²값이 0.99를 초과하여야 하며, 양성대조군(cinnamaldehyde)의 평균 소실률은 3 반복하였을 때, 시스테인 함유 펩타이드는 60.8-100%, 리신 펩타이드는 40.2-69% 범위의 값을 나타내야 한다. 시험 물질 및 양성대조군 반복간 소실률의 표준편차의 경우 시스테인 및 리신이 각각 14.9%, 11.6% 미만이어야 한다. 참고대조군 A및 C의 펩타이드 평균 농도는 0.5 ± 0.05 mM 범위에 속해야 하고, 참고대조군 B와 C의 펩타이드 변이계수(coefficient variation) 값은 15% 이하여야 한다. 또한 동시용출대조군 간섭 물질 면적이 참고대조군 C 피크 면적 평균 10% 이상을 경우를 포함하여 위의 기준 중에 하나라도 충족하지 못할 시에는 재시험을 수행하였다. 예측모델을 통해 시스테인 및 리신 펩타이드 소실률 평균값이 0-6.38%일 경우 무반응성(음성), 6.38-22.62%일 경우 저반응성(양성), 22.62-42.47%일 경우 중반응성(양성), 42.47-100%일 경우 고반응성(양성)으로 판정하였다(Table 2). 또한 리신 펩타이드 피크 면적 값이 동시용출을 보일 경우, 시스테인 펩타이드 소실률 만으로 결과를 판정하였다(Table 3).

Table 2.

Cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model for the in chemico DPRAa

Table 3.

Cysteine 1:10 prediction model for the in chemico DPRAa

결과 및 고찰

숙련도 시험 결과

본 시험을 수행하기에 앞서 시험의 유효성을 검증하기 위해 OECD TG 442C에 기술된 부록 2 숙련도 시험(Proficiency test)을 수행하였다. 그 결과, 시스테인 및 리신펩타이드에 대한 표준검량곡선의 상관계수 R² 값은 0.99를 초과하였으며, 참고대조군 A, B, C 펩타이드 평균 농도가 0.5 ± 0.05 mM로 기준을 충족하였으며, 분산계수 또한 모두 15% 이하임을 확인하여 검증기준에 충족하였다. 양성대조군인 cinnamaldehyde의 반복의 평균 펩타이드 소실률(peptide depletion)은 각각 71.88% (cysteine peptide 기준 60.8-100%), 58.79% (lysine peptide 기준 40.2-69%)로 모두 허용 범위에 포함되었다.

숙련도 물질에 대한 시스테인과 리신 펩타이드 소실률(peptide depletion)의 평균은 2,4-Dinitrochlorobenzne에서 58.60% (고반응성, 양성), oxazolone은 65.64% (고반응성, 양성), formaldehyde는 24.88% (중반응성, 양성), benzylideneactetone은 46.38% (고반응성, 양성), farnesal은 13.23% (중반응성, 양성), 2,3-butanedione은 46.80% (고반응성, 양성), 1-butanol은 1.55% (무반응성, 음성), 6-methylcoumarin은 0.81% (무반응성, 음성), lactic acid는 1.55% (무반응성, 음성), 4-methoxyacetophenone에서 1.05% (무반응성, 음성)로 나왔다(Table 4). 1-Butanol에서 리신 펩타이드 피크와 동시용출(co-elution)이 보여 시스테인 펩타이드(Table 3)의 결과로 양성 여부를 판단하였다. 피부 감작성 판정은 OECD TG 442C 가이드라인에 기술된 결과와 비교하였을 때(Table 4) 모두 정확하게 판정되었다. 결론적으로, 숙련도 물질 10개 모두 OECD 가이드라인에 기술된 기준에 부합하여 본 시험을 진행하였다.

Table 4.

Test chemicals for demonstrating skin sensitization with in chemico Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구개발사업(과제번호: PJ01423701)의 지원에 의하여 이루어진 것입니다.

Literature cited

• Alder S, Basketter D, Creton S, Pelkonen O, Benthem J, et al., 2011. Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Arch. Toxicol. 85:367-485.
• Avonto C, Wang YH, Chittiboyina AG, Vukmanovic S, Khan IA, 2018. In chemico assessment of potential sensitizers: stability and direct peptide reactivity of 24 fragrance ingredients. J. Appl. Toxicol. 39(2):398-408. [https://doi.org/10.1002/jat.3732]
• BCPC, 2003. The pesticide manual: A world compendium of pesticides. British Crop Protection Council. UK.
• Buehler EV, 1965. Delayed contact hypersensitivity in the guinea pig. Arch Dermatol. 91(2):171-175. [https://doi.org/10.1001/archderm.1965.01600080079017]
• Cho AR, 2018. Skin sensitizing potentials of chemical household products through Direct Peptide Reactivity Assay. Daegu Catholic Univ., MA Diss., Daegu, Republic of Korea.
• Cho SA, Choi MS, Park SR, An SS, Park JH, 2019. Application of spectro-DPRA, Keratinosens^TM and h-CLAT to estimation of the skin sensitization potential of cosmetics ingredients. J. Appl. Toxicol. 40(2):300-312. [https://doi.org/10.1002/jat.3904]
• DB-ALM, 2020. Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing p.1-21. http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/, .
• Dimitrov S, Detroyer A, Piroird C, Gomes C, Eilstein J et al., 2015. Accounting for data variability, a key factor in in vivo/in vitro relationships: application to the skin sensitization potency (in vivo LLNA versus in vitro DPRA) example. J. Appl. Toxicol. 36:1568-1578. [https://doi.org/10.1002/jat.3318]
• EC, 2011. CLH report proposal for harmonized classification and labelling based on regulation (EC) No 1272/2008 (CLP Regulation) annex VI, part 2, substance Name: Fluazinam, European Commission, Brussels, Kingdom of Belgium.
• Ezendam J, Braakhuis HM, Vandebriel RJ, 2016. State of the art in non-animal approaches for skin sensitization testing: from individual test methods towards testing strategies. Arch. Toxicol. 90(12):2861-2883. [https://doi.org/10.1007/s00204-016-1842-4]
• Gerberick GF, Vassallo JD, Bailey RE, Chaney JG, Morrall SW, et al., 2004. Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicol. Sci. 81(2):332-343. [https://doi.org/10.1093/toxsci/kfh213]
• Gerberick GF, Vassallo JD, Foertsch LM, Price BB, Chaney JG, et al., 2007. Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicol. Sci. 97(2):417-427. [https://doi.org/10.1093/toxsci/kfm064]
• Gerberick GF, Troutman JA, Foertsch LM, Vassallo JD, Quijano M, et al., 2009. Investigation of peptide reactivity of pro-hapten skin sensitizers using a peroxidase-peroxide oxidation system. Toxicol. Sci. 112(1):164-174. [https://doi.org/10.1093/toxsci/kfp192]
• Girolomoni G, Gisondi P, Ottaviani C, Cavani A, 2004. Immuno-regulation of allergic contact dermatitis. J Dermatol. 31:264-270. [https://doi.org/10.1111/j.1346-8138.2004.tb00671.x]
• European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL-ECVAM), 2013. EURL ECVAM recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DRPA) for skin sensitization testing European Commission Joint Research Centre. Europe.
• Jin JH, Lee NL, Park ES, Kim BS, Hong SM, 2018. Study of coidentity verification of pesticide products and active ingredients through FT-NIR and FT-IR. Korean J. Pestic. Sci. 22(4):337-344. [https://doi.org/10.7585/kjps.2018.22.4.337]
• Joint FAO/WHO Meeting on Pesticides Residues (JMPR), 1995. Pesticide residues in Food 1995, evaluations 1995 part II Toxicological and environmental. Geneva, Swiss.
• Joint FAO/WHO Meeting on Pesticides Residues (JMPR), 2003a. Pesticide Residues in Food. Toxicological Evaluations. Ethephon. 3-31. JMPR (WHO/PCS/03.1). Geneva, Swiss.
• Joint FAO/WHO Meeting on Pesticides Residues (JMPR), 2003b. Pesticide Residues in Food. Toxicological Evaluations. Ethephon. 333-385. JMPR (WHO/PCS/03.1). Geneva, Swiss.
• Joint FAO/WHO Meeting on Pesticides Residues (JMPR), 2012. Pesticide Residues in Food. Toxicological Evaluations. Ethephon. 547-652. JMPR (WHO/PCS/03.1). Geneva, Swiss.
• Korea Crop Protection Association (KCPA), 2019. Agrochemical year book. Seoul, Republic of Korea.
• Lalko JF, Kimber I, Gerberick GF, Foertsch LM, Api AM, et al., 2012. The direct peptide reactivity assay: selectivity of chemical respiratory allergens. Toxicol. Sci. 129(2):421-431. [https://doi.org/10.1093/toxsci/kfs205]
• Lepoittevin JP, 2006. Metabolism versus chemical transformation or pro- versus prehaptens? Contact dermatitis. Contact Dermatitis. 54(2):73-74. [https://doi.org/10.1111/j.0105-1873.2006.00795.x]
• Magnusson B, Kligman AM, 1969. The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol. 52:268-276. [https://doi.org/10.1038/jid.1969.42]
• Magnusson B, 1980. Identification of contact sensitizers by animal assay. Contact dermatitis. 6(1):46-50. [https://doi.org/10.1111/j.1600-0536.1980.tb03894.x]
• Maxwell G, Aeby P, Ashikaga T, Bessou-Touya S, Diembeck W, et al., 2011. Skin sensitisation: the Colipa strategy for developing and evaluating non-animal test methods for risk assessment. Altex 28(1):50-55. [https://doi.org/10.14573/altex.2011.1.050]
• Maxwell G, MacKay C, Cubberley R, Davies M, Gellatly N, et al., 2014. Applying the skin sensitization adverse outcome pathway (AOP) to quantitative risk assessments. Toxicol. Vitro 28(1):8-12. [https://doi.org/10.1016/j.tiv.2013.10.013]
• Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), 2016. OECD guideline for the testing of chemicals, in chemico direct peptide reactivity assay, B1-2016-4-001. Cheongju, Republic of Korea.
• Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), 2017. The establishment study of alternative method to animal test for Korean cosmetic safety evaluations. Cheongju, Republic of Korea. p. 32-215.
• National Institute of Environmental Research (NIER), 2016. Application of alternative test methods for evaluation of household products toxicity. Incheon, Republic of Korea. p. 1-40.
• National Institute of Agricultural Sciences (NAS), 2006. 36 Report for safety management of technical concentrate of pesticides (IV). Wanju-gun, Republic of Korea. p. 505-507
• NRA, 2002. National Registration Scheme for agricultural and veterinary chemicals Australia existing chemicals review program review of the mammalias toxicology and metabolism/toxicokinetics of diazinon. Department of Health & Aged care Canberra, Austrailia.
• OECD, 2010a Guidelines for the testing of chemicals. Section 4: health effects. Test No. 429. Skin sensitization: local lymph node assay. OECD Publishing, Paris
• OECD, 2010b Guidelines for the testing of chemicals. Section 4: health effects. Test no. 442A skin sensitization: local lymph node assay: DA. OECD Publishing, Paris
• OECD, 2010c OECD guidelines for the testing of chemicals. Section 4: health effects. Test no. 442B skin sensitization: local lymph node assay: BrdU-ELISA. OECD Publishing, Paris
• OECD, 2015a. OECD guidelines for the testing of chemicals, Section 4. Test No. 442C: in chemico skin sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA). OECD Publishing, Paris
• OECD, 2015b. OECD guidelines for the testing of chemicals, Section 4. Test No. 442D: in vitro skin sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase test method. OECD Publishing, Paris
• OECD, 2016a. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. Test No. 442E: in vitro skin sensitisation: human Cell Line Activation Test (h-CLAT) vol ENV/JM/WRPR(2016)19]. OECD Publishing, Paris.
• OECD, 2016b. Guidance document on the reporting of defined approaches and individual information sources to be used within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) for skin sensitisation In: OECD Environment HaSP (ed) Series on testing and assessment, vol ENV/JM/HA(2016)11.OECD Publishing, Paris.
• Ohtake T, Maeda Y, Hayahsi T, Yamanak H, Nakai M, et al., 2018. Applicability of an integrated testing strategy consisting of in silico, in chemico and in vitro assays for evaluating the skin sensitization potencies of isocyanates. Toxicology. 393:9-14. [https://doi.org/10.1016/j.tox.2017.10.015]
• Rosholt AP, 2005. The seventh amendment directive an unnecessary measure to a necessary end possible legal challenges to directive 2003/15/EC of the European parliament and of the council amending council directive 76/768/EEC under European union low. Food Drug Law J 60(3):421-446.
• Rural Development Administration (RDA), 2020. Pesticide control act. Jeonju, Republic of Korea.
• Park KH, Song GC, Choo HY, Heo Y, Kim BH, 2017. Condition establishment study of the direct peptide reactivity assay in Korea. J. Prev. Vet. Med. 41(4):174-179. [https://doi.org/10.13041/jpvm.2017.41.4.174]
• Patel NH, Mishra PK, Nagane R, Deshpande A, Tamboli IY et al., 2019. Comparison of in chemico skin sensitization methods and development of in chemico skin photosensitization assays. ALTEX-Altem. Anim. Exp. 36(3):373-387. [https://doi.org/10.14573/altex.1811011]
• Takenouchi O, Fukui S, Okamoto K, Kurotani S, Imai N, et al., 2014. Test battery with the human cell line activation test, direct peptide reactivity assay and DEREK based on a 139 chemical data set for predicting skin sensitizing potential and potency of chemicals. J. Appl. Toxicol. 35:1318-1332. [https://doi.org/10.1002/jat.3127]
• Tollefsen KE, Scholz S, Cronin MT, Edwards SW, Knecht J, et al., 2014. Applying adverse outcome pathways (AOPs) to support integrated approaches to testing and assessment (IATA). Regul. Toxicol. Pharmacol. 70(3):629-640. [https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2014.09.009]
• Troutman JA, Foertsch LM, Kern PS, Dai HJ, Quijano M, et al., 2011. The incorporation of lysine into peroxidase peptide reactivity assay for skin sensitization assessments. Toxicol. Sci. 122(2):422-436. [https://doi.org/10.1093/toxsci/kfr101]
• Vinken M, 2013. The adverse outcome pathway concept: A pragmatic tool in toxicology. Toxicology. 312:158-165. [https://doi.org/10.1016/j.tox.2013.08.011]
• WSDOT, 2006. Oxadiazon, Roadside vegetation management herbicide fact sheet. Washington State Department of Transportation, USA.
• Yamamoto Y, Tahara H, Usami R, Kasahara T, Jimbo Y, et al., 2015. A novel in chemico method to detect skin sensitizers in highly diluted reaction conditions, J Appl. Toxicol. 35:1348-1360. [https://doi.org/10.1002/jat.3139]
• Zhang F, Erskine T, Klapacz J, Settivari R, Marty S, 2018. A highly sensitive and selective high pressure liquid chromatography with tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS) method for the direct peptide reactivity assay (DPRA). J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 94:1-15. [https://doi.org/10.1016/j.vascn.2018.07.004]