다양한 기주식물에서 분리한 탄저병균 Colletotrichum spp.의 Carbendazim에 대한 반응과 포장 집단의 분석

실험에 사용한 병원균

전국적으로 고추, 포도, 대추, 감, 구기자, 복숭아, 사과 등이 재배되는 각 주요 재배지역을 중심으로 탄저병이 발생한 식물체를 채집하고, Kim et al. (2006)의 방법과 같이 병징 위에서 형성된 병원균의 포자를 단포자 분리하였다. 분리한 탄저병균의 균주는 25^oC의 PDA배지에서 7일간 배양한 후 4^oC에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실험에 사용한 살균제와 균사생장 억제효과 검정

단포자 분리한 탄저병균 균주는 benzimidazole계에 속하는 carbendazim(a.i. 20%, WP)에 대한 균사생장 억제효과를 한천희석법으로 조사하였다. 살균제를 멸균증류수로 희석하여, 멸균한 PDA배지에 정해진 농도가 되도록 첨가하였다. 실험에 사용한 탄저병균 균주는 25^oC의 PDA배지에서 7일간 배양한 후 균총의 선단에서 직경 3mm의 균사 조각을 떼어내어 살균제를 첨가하지 않은 PDA배지와 살균제를 정해진 농도로 첨가한 PDA배지의 중앙에 접종하였다. 이 때 균사 조각의 균사 쪽이 PDA배지의 표면에 닿도록 뒤집어서 접종하였다. 병원균은 25^oC에서 다시 7일간 배양한 후, 균총의 직경을 측정하였다. 각 살균제의 균사생장 억제효과는 살균제 무첨가 PDA배지에서 자란 병원균의 균총 직경에 대해서 살균제 첨가 PDA배지에서 자란 병원균의 균총 직경을 비교하여 계산하였다. 병원균에 대한 carbendazim의 균사생장 억제효과의 계산식은 아래와 같았다.

병원균의 gDNA 추출

PDA 배지에 접종하여 25^oC에서 10일간 배양한 C. acutatum의 균사를 배지 표면에서 긁어 수확한 후, 액체질소를 부어 마쇄하였다. CTAB 추출 용액(2.5 M NaCl, 0.25 M EDTA (pH8.0), 0.5 M Tris-HCl (pH8.0), 1% polyvinylpyrrolidone-10, 1% hexadecyl trimethyl ammonium bromide, 0.5% sodium dodesyl sulfate)을 첨가하여 65^oC에서 1시간 처리한 후, 13,000 g로 10분간 원심분리하고, 상징액만을 회수하였다. 상징액에 phenol/chloroform/IAA(v:v:v, 25:24:1) 혼합액을 처리하고 13,000 g로 15분간 원심분리하여 침전한 DNA를 회수하였다. 침전된 DNA는 70% ethanol을 첨가하여 13,000 g로 15분간 원심분리하여 세척한 후, 건조시켜 ethanol을 제거하였다. DNA는 멸균증류수로 용해시켜 −20^oC에서 보관하며 PCR 실험에 사용하였다.

ITS 영역 유전자 증폭과 염기서열 분석

ITS 영역을 증폭하기 위해 primer ITS5 (5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’)와 ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)를 사용하였다. PCR kit(Bioneer Inc., Taejon, Korea)를 이용하여 총 반응량 25 μL를 준비하여, 유전자 증폭에 사용하였다. 유전자 증폭을 위해서 95^oC에서 2분 pre-denaturation을 실시하였고, 95^oC에서 1분, 55^oC에서 1분, 72^oC에서 1분간의 변성, 결합, 신장의 과정을 40회 실시하였으며, 최종적으로 72^oC에서 5분 반응시켰다. 증폭이 확인된 시료들은 Expin^TM PCR SV kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 후 Macrogen (Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 ITS 영역 유전자의 염기서열은 BioEdit ver. 7.0.9.0의 clustal X를 이용하여 정리하였고, MEGA ver. 5.2.1에서 정렬한 후 NCBI GenBank의 염기서열을 획득하여 유연관계를 확인하였다.

종 특이적 primer를 이용한 PCR

C. acutatum s. lat.과 C. gloeosporioides s. lat.에 대한 종 진단을 위해서 종 특이적인 primer인 Ca1-1 (CCA GGG GAA GCC TCT CGC GGG CCT)와 CgInt (GGC CTC CCG CCT CCG GGC GG)를 universal primer인 ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)와 쌍으로 각각 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94^oC에서 4분간 pre-denaturation을 실시하였고, denaturation, annealing, elongation 단계를 94^oC에서 30초, 65^oC에서 30초, 72^oC에서 1분간을 30회 반복하였다. 마지막 elongation 단계는 72^oC에서 7분간 실시하였다. PCR 산물은 2% agarose gel을 이용하여 100V에서 60분간 전기영동하여 확인하였다.

β-tubulin 유전자의 증폭

탄저병균으로부터 tub2 유전자를 TB2L (GYT TCC AGA TYA CCC ACT CC)과 TB2R (TGA GCT CAG GAA CRC TGA CG) primer를 사용하여 증폭하였다(Peres et al., 2004). 유전자의 증폭은 PCR 키트(Bioneer Inc., Taejon, Korea)를 사용하여 thermal cycler (i-cycler version3.021, Biorad, Hercules, California, USA)에서 수행하였다. 반응액은 95^oC에서 2분을 유지한 후, 95^oC에서 1분, 55^oC에서 1분, 72^oC에서 1분씩 총 40회를 반응시켰으며, 72^oC에서 5분 동안 반응을 지속하였다. 증폭이 확인된 시료들은 ITS 영역 유전자와 동일하게 tub2 유전자의 염기서열을 분석한 후 NCBI GenBank의 염기서열을 확인하였다.

Cabendazim에 대한 반응과 β-Tubulin 유전자의 염기서열 분석

고추에서 분리한 23개의 Colletotrichum 균주를 선발하여 한천희석법과 β-tubulin 유전자 분석을 실시하였다. Fig. 1에서 보는 것과 같이 실험한 탄저병균은 감수성 Cg형, 저항성 Cg형, Ca형 등 3가지 반응형으로 나눌 수 있었는데, 0.8 μg/mL 처리구의 균사생장 억제율이 80% 이상인 균주를 감수성 Cg형으로, 30% 이하인 균주를 저항성 Cg형으로, 그리고 0.16 μg/mL과 0.8 μg/mL 처리구의 억제율이 30 – 80% 사이인 균주를 Ca형으로 구분하였다. Ca형인 균주는 23개 균주 중에서 16CABH1, 16CASJ1, 16GS3 균주 등 3균주가 확인 되었는데, 종 특이적 primer를 이용한 PCR에서 C. acutatum s. lat.으로 동정되었고, 한천희석법에서도 carbendazim에 대해서 비감수성으로 나타났다(Table 1). 종 특이적 primer에 의한 PCR 결과, 나머지 20개 균주는 C. gloeosporioides s. lat.로 동정되었으며, 한천희석법의 결과 감수성 균주가 10개, 저항성 균주가 10개인 것으로 나타났다. 실험에 사용한 23개 균주의 β-tubulin 유전자를 분석한 결과, C. gloeosporioides s. lat. 중에서 감수성 Cg형과 C. acutatum s. lat.인 Ca형에 속하는 균주의 198번째 아미노산 코돈은 GAG(Glu)였으나, C. gloeosporioides s. lat. 중에서 저항성 Cg형에 속하는 균주는 코돈은 GCG(Ala)로 치환되어 있었다. 이런 결과는 Kim et al. (2007)이 보고한 결과와도 일치하였다. 이와 같은 C. acutatum s. lat.과 C. gloeosporioides s. lat.의 benzimidazole계 살균제에 대한 반응의 차이를 이용한다면 두 종의 구별이 가능할 것으로 본다. 하지만 많은 수의 포장 병원균을 분리하여 병원균의 집단을 분석할 때, benzimidazole계 살균제에 대한 반응이 뚜렷하지 못한 균주들이 있기 때문에 정확한 동정에 이용하기에는 어려움이 있음에 주의하여야 한다.

Fig. 1.

Inhibitory effect of carbendazim on the mycelial growth of Colletotrichum spp. isolates obtained from diseased pepper fruits. Efficacy of carbendazim against Colletotrichum spp. causing pepper anthracnose was investigated by agar dilution method.

Table 1.

Analysis of Colletotrichum isolates obtained from diseased pepper fruit by using DNA sequences of ITS and β-tubulin gene, and response to carbendazim

고추 탄저병균의 살균제 반응

본 실험에는 2016년 고추에서 분리한 159개의 탄저병 균주를 사용하였다. 탄저병의 전형적인 병반에서 고추탄저병균을 분리하면 대부분 C. acutatum s. lat.이 분리된다(Kim and Kim, 2004). 하지만 본 연구에서는 많은 수의 C. gloeosporioides 균주를 실험에 사용하고자 하였기 때문에, 전형적인 탄저병의 병징 뿐만 아니라 유사한 병징을 보이는 고추 열매 모두를 습실처리하고, 형성된 포자를 단포자 분리하여 얻은 모든 균주를 사용하였다. Carbendazim에 대한 탄저병균의 반응은 감수성(감수성 Cg형)과 저항성(저항성 Cg형), 그리고 비감수성(Ca형) 반응 등 3가지로 구분할 수 있었다(Fig. 2). 세 가지 반응의 기준은 앞에서 기술한 것과 같이 0.8 μg/mL 처리구의 억제율을 계산하여 80% 이상인 균주를 감수성 Cg형, 30% 이하인 균주를 저항성 Cg형, 그리고 0.16μg/mL과 0.8 μg/mL 처리구의 억제율이 30 – 80% 사이인 균주를 Ca형으로 구분하였다. 하지만 Fig. 2에서 보는 것과 같이 carbendazim 감수성균과 비감수성균의 경계를 뚜렷하게 구분하기란 쉽지 않았다. 고추의 경우, 감수성 Cg형 균주가 60개, 저항성 Cg형 균주가 7개로 나타났으며, Ca형 균주는 사용한 모든 균주 중에서 92개가 확인되었다. 실험에 사용한 전체 균주 중에서 Cg형 균주가 42.1 %, C a형 균주가 57.9%이었으며, Cg형 탄저병균 중에서 저항성 Cg형은 사용한 전체 균주 중에서 4.4%이었으며, Cg형 균주 집단에서만은 10.4%의 비율로 존재하였다. Ca형에 속하는 균주는 0.16μg/mL와 0.8 μg/mL의 처리구에서 균사생장이 30 – 60% 사이로 억제되었을 뿐만 아니라, 살균제의 농도를 20 μg/mL까지 증가시켜도 60 – 80% 정도만 억제되었다. 이런 균주들은 처리한 살균제의 농도를 상승시킨다고 해서 균사생장에 대한 억제효과가 비례적으로 상승하지는 않았다. 이미 고추 탄저병의 주된 병원균으로 알려진 C. acutatum s. lat.은 benzimidazole계 살균제에 대해서 본 실험에서 보여주는 것과 같은 비감수성인 반응을 보이는 것으로 알려져 있다(Adaskaveg and Forster, 2000). 2001년과 2002년 전국적으로 분리한 고추탄저병균의 분리 비율을 보면 C. acutatum s. lat.의 분리 비율이 90% 이상이었음에도 불구하고, 본 연구에서는 분리된 C. acutatum s. lat.은 57.9%이었으며, C. gloeosporioides s. lat.는 42.1%이었다. 이처럼 본 연구에서 C. gloeosporioides s. lat.의 분리 비율이 높은 것은 전형적인 탄저병 병징을 보이는 열매에서만 병원균을 분리하지 않고, 유사한 병징까지 분리한 결과라고 생각한다. 특히 고추에 대한 C. gloeosporioides s. lat.을 인위적으로 접종하여도 전형적인 병징이 나타나지 않았을 뿐만 아니라 병원성도 크지 않았기 때문에, 전형적으로 발생한 병징에서 분리하는 병원균은 대부분 C. acutatum s. lat.이었던 것으로 생각된다(Kim and Kim, 2004).

Fig. 2.

Effect of carbendazim on the mycelial growth of Colletotrichum isolates obtained from infected pepper fruits.

실험에 사용한 159개의 고추 탄저병균 균주의 ITS 영역 유전자의 염기서열 분석과 종 특이적 primer를 사용하여 병원균을 동정한 후, benzimidazole계 살균제 반응을 가지고 구분한 반응형과 일치하는 지의 여부를 조사하였다. Table 2에서 보는 것과 같이 ITS 유전자의 염기서열 분석을 통한 유전자 동정과 종 특이적 primer를 사용하는 PCR법으로 동정한 결과, 감수성 Cg형으로 구분된 60개의 균주 중에서 44개 균주는 C. gloeosporioides s. lat.로, 16개 균주는 C. acutatum s. lat.으로 동정되었으며, 저항성 Cg형으로 구분된 7개의 균주도 C. gloeosporioides s. lat.가 5개, C. acutatum s. lat.이 2개로 동정되었다. 하지만 Ca형으로 구분된 92개 균주는 모두 C. acutatum s. lat.으로 동정되었다. 이상의 결과에서 보면 benzimidazole계 살균제에 대한 반응만을 가지고서 탄저병균을 C. gloeosporioides s. lat.와 C. acutatum s. lat.으로 동정하기는 어렵다. 특히 비감수성 반응을 보이는 C. acutatum s. lat.의 균주 중에는 benzimidazole계 살균제에 대한 반응이 뚜렷하지 않아서 정확한 동정이 이루어지지 않았다. 그렇지만 분리한 탄저병균의 benzimidazole계 살균제에 대한 저항성 검정을 실시하면서 얻을 수 있는 반응형을 가지고 서로 다른 기주식물에서 분리한 Colletotrichum 병원균 집단의 구성과 주요 병원균 등을 예측할 수는 있을 것으로 생각하였다.

Table 2.

Number of isolates of Colletotrichum obtained from diseased pepper fruits identified by using the phenotype to carbendazim, ITS region sequences and species-specific PCR

다른 기주식물에서 분리한 탄저병균의 살균제 반응

포도, 대추, 감, 구기자, 복숭아, 사과 등 총 6가지의 작물에서 탄저병이 발생한 열매를 채집하고 단포자 분리를 통하여 53, 15, 40, 52, 43, 54균주를 확보하였다. 분리한 모든 탄저병균 균주에 대한 carbendazim의 균사생장 억제효과를 한천희석법으로 조사하였다.

고추에서 분리한 탄저병균의 carbendazim에 대한 반응형의 기준을 가지고서 서로 다른 기주식물로부터 분리한 탄저병균을 조사하였다(Fig. 3). 포도의 경우 감수성 Cg형 균주가 17개, 저항성 Cg형 균주가 31개, 그리고 Ca형 균주가 5개씩 분리되었다. 대추에서는 감수성 Cg형과 저항성 Cg형 균주가 각각 7개와 8개이었으며, Ca형 균주는 분리되지 않았다. 감에서도 Ca형 균주는 분리되지 않았으며, 감수성 Cg형이 38균주, 저항성 Cg형이 2균주 분리되었다. 구기자에서는 분리한 52균주 중에서 49균주가 Ca형이었으며, 3균주만이 감수성 Cg형으로 나타났으며, 복숭아에서도 43균주 중에서 3균주만이 감수성 Cg형이었으며, 나머지 40균주는 Ca형이었다. 사과에서는 감수성 Cg형이 22균주, 저항성 Cg형이 24균주, 그리고 Ca형이 8균주이었다. Fig. 3에서처럼 기주식물에 따라서 분리되는 탄저병균의 carbendazim에 대한 반응형은 차이가 있었는데, 포도, 구기자, 복숭아, 사과에서는 고추와 동일하게 C. acutatum s. lat.과 C. gloeosporioides s. lat.이 모두 분리되었으며, 포도와 사과에서는 저항성 Cg형 균주의 비율이 58.5%와 44.4%로 높았다. 반면에 구기자와 복숭아는 감수성 Cg형 균주가 3개씩이었으며 나머지는 모두 Ca형 균주로 각각 94.2%와 93.0%를 차지하였다.

Fig. 3.

Efficacy of carbendazim on Colletotrichum spp. isolated from grape (A), boxthorn (B), peach (C) and apple (D). Efficacy of carbendazim was investigated by agar dilution method on PDA with/without the fungicide.

대추와 감에서는 C. acutatum s. lat.으로 예상되는 Ca형 균주는 전혀 보이지 않았고, 분리한 모든 균주가 C. gloeosporioides s. lat.로 예상되는 Cg형만이 존재하였다(Fig. 4). 하지만 Cg형 균주의 carbendazim에 대한 반응은 서로 달라, 대추에서는 저항성 Cg형 균주가 53.3%이었던데 비해서, 감에서는 5.0%에 지나지 않았다. 특히 감에서는 감수성 Cg형 균주 중에서 0.032 μg/mL에서 80% 이상 균사생장이 억제되는 극감수성 균주가 9균주나 분리되었다.

Fig. 4.

Efficacy of carbendazim on Colletotrichum spp. isolated from jujube (A) and persimmon (B). Efficacy of carbendazim was investigated by agar dilution method on PDA with/without the fungicide.

고추에서는 carbendazim에 대한 세 가지 반응형이 모두 분리되었으며, Ca형이 분리된 전체 균주의 57.9%를 차지하였다. 그런데 포도와 사과에서는 Ca형 균주가 분리되기는 하지만 분리 비율이 7.5%와 14.8%에 그쳤고, 분리된 대부분의 병원균은 Cg형으로, 포도에서는 92.5%, 사과에서는 83.2%가 Cg형이었다. 구기자와 복숭아에서는 포도와 사과와는 반대로 Ca형 균주가 90% 넘게 분리되었고, Cg형 균주의 분리 비율이 낮았을 뿐만 아니라, 분리되는 Cg형 균주에서도 carbendazim에 대해서 저항성인 Cg형 균주는 전혀 분리되지 않았다. 이처럼 포도와 사과, 그리고 구기자와 복숭아에서는 Cg형과 Ca형의 Colletotrichum 균주가 모두 분리되기는 하지만, 각각의 분리되는 비율이 달랐다.

ITS 염기서열을 기반으로 분류가 가능한 C. gloeosporioides s. lat.와 C. acutatum s. lat.은 한 종의 병원균이 여러 가지 기주식물을 침입하기도 하고, 한 종류의 기주식물에 두 종이 모두 침입하는 경우도 있다(Freeman et al., 1998; Peres et al., 2005). 본 실험의 결과에서도 포장에서 포도, 사과, 구기자, 복숭아에 탄저병을 일으키는 Colletotrichum 종은, 본 실험의 결과에서 carbendazim에 대한 반응형을 보았을 때 Cg형과 Ca형이 모두 있기 때문에 C. gloeosporioides s. lat.와 C. acutatum s. lat.이 모두 존재하는 것을 알 수 있다. 하지만 대추와 감에서는 Ca형 균주는 전혀 분리되지 않고 Cg형 균주만 분리되는 것을 보면, C. gloeosporioides s. lat.와 C. acutatum s. lat.이 모두 탄저병을 일으키는 위의 5가지 기주식물과는 다르게 C. gloeosporioides s. lat.만이 탄저병균임을 알 수 있었다.

C. gloeosporioides s. lat.와 C. acutatum s. lat. 두 가지의 Colletotrichum 종은 benzimidazole계 살균제에 대한 반응과 생리적인 면에 차이가 있다(Adaskaveg and Forster, 2000; Kim et al., 2006). 그런데 살균제에 대한 반응이 다른 탄저병균이 동일한 기주식물에서 탄저병을 일으키고 있다면, 병방제를 위한 전략을 세우기 위해서 각 기주식물에서 탄저병을 일으키는 병원균의 집단 구성에 대한 분석이 필요하다. 탄저병균인 C. gloeosporioides s. lat.와 C. acutatum s. lat.은 ITS 영역 유전자의 염기서열 분석이나 종 특이적 primer를 사용한 PCR을 통해서 정확한 동정이 가능하지만, benzimidazole계 살균제에 대한 반응이 다르게 나타나기 때문에 한천희석법으로 benzimidazole계 살균제에 대한 반응형을 조사하여도 포장 병원균 집단의 구성을 예측할 수 있을 것으로 생각한다. 그런데 Table 2에서 보는 바와 같이 benzimidazole계 살균제에 대한 반응형과 유전자 동정의 결과가 정확하게 일치하지는 않았기 때문에 정확한 동정의 결과를 얻기에는 한계가 있었다.

본 실험의 결과를 보면 7가지 기주식물에서 분리한 탄저병균의 benzimidazole계 살균제인 carbendazim에 대한 반응형은 0.8 μg/mL의 농도에 대한 반응을 가지고 감수성 Cg형, 저항성 Cg형, Ca형 등으로 구분하였고, 감수성 Cg형과 저항성 Cg형은 C. gloeosporioides s. lat., Ca형은 C. acutatum s. lat.으로 동정할 수 있었다. 이 동정의 결과는 유전자를 이용한 동정과 비교하였을 때 정확도가 떨어졌지만, 포장에서 병원균 집단의 구성을 분석할 수 있는 결과를 제공하기에는 충분하였기 때문에, benzimidazole계 살균제에 대한 반응형을 분석한다면 포장 병원균 집단을 구성하는 Colletotrichum 종의 구성을 예측할 수 있어서 포장에서 탄저병 방제를 위한 살균제를 선발하는데 도움이 될 것으로 생각한다. 또한 최근 주요 작물에서 큰 피해를 일으키는 탄저병의 주요 원인인 Colletotrichum 복합종의 분류를 여러 종류 유전자의 염기서열 분석을 통해서 수행하고 있는데(Damm et al., 2012; Weir et al., 2012), 이런 변화한 분류 체계를 통한 Colletotrichum 속 병원균의 재분류와 그 분류 체계를 통해서 새롭게 재분류된 Colletotrichum 종에 대한 benzimidazole계 살균제의 반응형에 대한 조사 등이 계속적으로 이루어져야 할 과제로 생각한다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.