농산물에서 분리한 무름병균의 항생제 최소 억제농도 조사

병원균 분리

무름병균은 배추 무 재배지에서 무름병징을 보이는 시료로부터 분리하였다. 병원균 분리는 1% 차염소산나트륨으로 병든 시료를 표면 소독하고 종이수건으로 수분을 제거하여 표면을 건조시켰다. 병원균 분리에 사용한 감자는 수돗물로 깨끗이 세척한 다음 70% 에탄올로 분무처리하고 30초 이상 알콜램프로 화염소독하여 표면에 부착한 오염원을 제거하였다. 화염 소독한 감자는 10 mm 두께로 절단하여 습실 처리된 페트리 접시에 배치하고 병든 시료 조직을 조심스럽게 올려 두었다. 그 다음 플라스틱 지퍼백에 넣고 28^oC 항온기에서 24시간 배양 후 특이적인 무름병징 발생여부를 확인하고 병원균 분리에 사용하였다. 감자절편에 새롭게 형성된 무름병징에서 병원균을 채취하여 CVP (Crystal violet pectate agar, MDcell) 배지에 도말 후 단일 균총을 이용하여 26개 병원균을 분리하였다. 분리균은 TSA (Tryptic Soy Agar, Difco) 배지에 보관하며 실험에 사용하였다. 한편 감자, 배추, 무에서 분리한 무름병균 가운데 10균주는 고령지농업연구소에서 분양받았고, 다른 40균주는 국립농업과학원 유해생물과에서 2000년대 분리하여 보관중인 균주로 실험에 사용하였다.

Biolog, 16S rRNA 이용 무름병균 동정

농산물에서 분리한 병원균은 TSA (Trypton Soy Agar, Difco)에 도말 후 28^oC 항온기에서 24시간 배양하였다. 병원균 colony를 멸균된 면봉으로 채취하여 접종액(Inoculating Fluid)에 조심스럽게 풀어주고, 탁도계(Nephelometer)를 이용해 맥파랜드 표준용액(McFarland equivalence turbidity standard)의 탁도를 0.5로 조절하였다. 그 후 접종액은 멀티채널 피펫을 이용하여 100 μL씩 GENIII MicroPlate (Biolog)에 접종하고 30^oC에서 24시간 배양하였다. 보라색으로 변색된 plate는 Biolog 마이크로 스테이션를 이용하여 미생물을 동정하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 ㈜솔젠트에 의뢰하여 BLAST 방법으로 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 자료와 비교 분석하여 병원균 동정에 이용하였다.

기주별 병원성 및 온도반응 조사

농산물에서 분리한 무름병균 26 균주(국립농업과학원)와 분양받은 10균주(고령지농업연구소)의 병원성과 온도반응은 감자, 당근, 배추, 로메인 상추를 사용하여 조사하였다. 감자와 당근은 수돗물로 깨끗이 세척하고 종이수건으로 표면의 수분을 제거하여 70% 알코올로 30초 이상 표면을 화염소독 한 후 10mm 두께로 절단하였고, 상추와 배추는 표면의 수분을 제거 후 5 × 5 cm 크기로 절단하여 준비하였다. 준비한 시료는 사각 페트리 접시에 종이수건을 넣고 멸균증류수로 수분을 공급하여 습실조건을 만들고 4종의 기주 시료를 배치하였다. 그리고 무름병균은 6.0 log cfu/mL로 조절하여 10 μL씩 3개 위치에 3반복으로 접종하였고 온도별 병원성 반응을 조사하기 위하여 항온기를 10, 15, 20, 25, 30^oC로 조절하여 24시간 동안 배양하고 기주별 병원성 및 온도반응 정도를 무병징(−) 약(+), 중간(++), 강함(+++)으로 구분하였다.

항생제 최소억제농도 조사

무름병균의 분류동정

2021년에 농작물에서 분리한 26개 무름병균은 Biolog 탄소원 이용 특성을 반영한 결과 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum으로 동정되었다. 그런데 이들은 16S rRNA 유전특성에 따라 동정했을 때는 Pectobacterium carotovorum (34.6%), Pectobacterium aroidearum (26.9%), Pectobacterium odoriferum (23.1%), Pectobacterium polaris (15.4%)의 4종으로 분류되었다(Table 1). 이 결과는 Pectobacterium odoriferum (32.4%), Pectobacterium carotovorum (27.6%), Pectobacterium brasiliense (25.8%) Pectobacterium versatile (12.4%) Pectobacterium polaris (0.9%) Pectobacterium parmentieri (0.9%) 순으로 분포한다는 보고(Jee et al., 2020)와 유사하였고 이는 분리기주, 분리지역, 농장의 작물재배이력 등과 관련성이 높을 것으로 판단되었다. Jee et al. (2020)이 분리한 225개 균주는 90% 이상이 감자에서 분리하였고, 배추에서 18 균주, 무에서 5 균주를 분리했다고 보고하였다. 본 연구에서는 배추에서 21 균주를 분리하였고 우점균은 Pectobacterium carotovorum였으나, 무에서 분리한 5균주는 Pectobacterium aroidearum이 우점균으로 확인되었다. 이는 감자에서 분리한 무름병균의 우점균인 Pectobacterium odoriferum과 분포비율이 다르게 나타났으며 배추 무의 분포와 지역별 특성의 지속적인 조사 및 비교 연구가 필요하였다.

Table 1.

Identification of soft rot bacteria obtained from agricultural produces

무름병균의 기주 및 온도반응

배추 무에서 2021년 분리한 26 균주와 분양받은 10 균주의 무름병균은 접종 후 25~30^oC에서 24시간 이후 감자에서 심한 무름병징이 나타났고, 당근, 배추 상추에서는 유사한 수준으로 병징을 유발하였다(Table 2). 이는 Jee et al. (2020)의 20~37^oC 온도 범위에서 발생한 무름병징 보고와 유사한 결과를 보였으나 10~15^oC에서는 차이가 있었다. 무름병균을 접종하고 15~20^oC 항온기에 배양하였을 때 병징발생은 감자 > 당근 > 배추 > 상추 순으로 심하게 나타났다. 10^oC에서 감자는 뚜렷한 병징 발현이 있었으나 당근 배추 상추에서는 큰 차이를 보이며 약한 병징이 발생하였다. 특히 배추에서 분리한 무름병균이 감자에서 가장 심한 병징을 유발하여 분리 균주 간 연관분석이 필요하여 추가실험이 진행중에 있다. 최근에는 작물이 연중재배 되어 병원균은 다양한 재배환경에서 생존하며 병원성의 변화가 발생할 수 있으므로 저온과 고온에서 병원균의 특성 변화를 연구하는 것은 안전관리 측면에서 중요하다. 무름병은 기후변화로 인해 발생이 증가하고 고온에서 강한 병원성 있을 것으로 예상되지만 Jee et al. (2020)의 보고에 따르면 37^oC 이상의 고온에서는 병원성이 나타나지 않았다. 본 연구에서는 저온에서도 강한 병원성을 유발하는 무름병균이 확인되었는데 이는 본 연구에 사용된 균이 저온에 대한 적응력이 획득된 것이 아닌가는 추가연구가 필요하다.

Table 2.

Comparison of pathogenicity and temperature response of soft rot bacteria isolated from agricultural produces

항생제 최소억제농도

무름병균의 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline)에 대한 최소억제농도는 2021년에 분리한 36균주와 2000년대에 분리한 40균주를 이용하여 E-test 방법으로 조사하였다(Table 3). 그 결과 최근에 분리한 3균주와 2000년대에 분리한 2균주가 스트렙토마이신 100 μg/mL 농도에서도 왕성하게 증식하였다. 그리고 대조균주 KACC 10057은 스트렙토마이신 최소억제농도가 0.4 μg/mL이었으나, 2021년에 분리한 균주는 대조균주에 비하여 10배 이상 높은 4.0 μg/mL에서 억제되는 비율이 60% 수준이었다. 무름병균은 스트렙토마이신에 대한 평균 최소억제농도가 2000년대에는 3.04 μg/mL이었으나 2021년에는 6.64 μg/mL로 2배 높은 수준으로 억제농도가 증가하였다. 그리고 무름병균의 테트라사이클린에 대한 항생제 반응도 조사하였다. 2000년대에 분리한 무름병균은 평균 최소억제농도는 0.48 μg/mL이었으나, 최근에 분리한 균주는 1.13 μg/mL으로 2배 이상으로 증가하였다. 그리고 무름병 대조균주 KACC 10057은 스트렙토마이신 최소억제농도는 0.19 μg/mL이었으나, 그보다 5배 높은 1.0 μg/mL 수준인 균주가 2000년대의 10% 수준에서 최근에는 53%로 증가 하였다. 그러나 축산물에서 분리한 병원성대장균이 테트라사이클린에 대하여 저항성 반응을 보이는 균주가 26% 이었다고 보고(Lee et al., 2021)한 것과 다르게 무름병균은 저항성 반응을 보이는 균주가 없었다. 이와 같이 무름병균이 스트렙토마이신, 테트라사이클린 항생제에 대하여 다른 반응 특성을 보이는 것은 농약사용, 축분퇴비 및 관계수 등과 관련되었을 것으로 생각되어 지속적인 모니터링과 항생제 유입경로 구명이 필요하다고 판단된다.

Table 3.

Minimum inhibitory concentration by e-test method of soft rot bacteria isolated from agricultural produces

식물병원균의 항생제 저항성 여부는 최소억제농도를 근거로 하여 평가하고 있다. 최근에 키위에서 분리한 Pseudomonas syringae pv. actinidiae 균주들의 스트렙토마이신 저항성 연구에서 100 μg/mL 농도 수준으로 조절된 배지에서 병원균 생장여부로 판단하였고, 조사균주의 5.2%가 저항성 반응을 보였다고 보고하였다(Lee et al., 2020). 농업용 항생제 스트렙토마이신의 안전사용기준이 100~260 μg/mL (10~25 g/20 L)으로 제품에 따라 처리량이 다르기 때문에 최소억제농도에 근거하여 병원체의 저항성 연구를 수행했을 것으로 생각되었다. 이번 연구에서 무름병을 일으키는 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum도 안전사용기준을 100 μg/mL 농도로 항생제 반응평가를 수행한 76개 균주 가운데 6.6%에 해당하는 5개 균주가 100 μg/mL 이상의 최소억제농도를 보여 저항성균으로 판단하였다. 그러나 테트라사이클린에 대해서는 0.12~7.5 μg/mL의 최소억제농도를 보여 저항성 균주는 없었다.

식물병원성 세균의 항생제 저항성 기작은 대개 두 가지로 알려져 있다. 스트렙토마이신의 표적위치인 리보소옴의 단백질을 암호화 하는 rpsL 유전자에 단일염기 돌연변이가 발생하는 경우와 무름병균이 strA–strB 유전자 복합체를 얻게 되는 경우가 그것이다(Chiou and Jones 1995; McGhee et al., 2011; Foster et al., 2015; Sundin and Wang, 2018).

2021년에 분리한 무름병균의 의료용 항생제 16종에 대한 반응은 sensititre(ARIS HiQ, Thermo scientific)를 이용하여 최소억제농도(MIC)를 조사하였다(Table 4). 그 결과, Azithromycin, Chloromphenicol, Nalidixic acid, Streptomycine은 균주 간 최소억제농도의 차이가 있었다. 특히 항생제 Nalidixic acid, Streptomycine은 최소억제농도가 sensititre HiQ plate의 최고농도인 128 μg/mL이었으며 추후 더 높은 항생제 농도에서 무름병균의 증식 억제여부를 조사해야 할 것으로 보인다. 그리고 Amikacin (4~64, AMI), Ampicillin (2~64, AMP), Cefotaxime (1~32, FOT), Cefoxitin (4~32, FOX), Ceftazidime (1~32, TAZ), Ceftriaxone (1~32, AXO), Ciprofloxacin (0.03~16, CIP), Colistin (2~16, COL), Gentamicin (1~64, GEN), Imipenem (1~8, IMI), Tetracycline (2~128, TET), Trimethoprim/Sulphamethox azole (1/19~16 / 304, SXT)의 12종 항생제에 대한 무름병균의 반응은 균주 간 차이가 없이 일정하게 최소 농도에 반응을 보여 해당 항생제에 감수성으로 판단하였다. 세균의 DNA 합성을 저해하는데 효과적인 Quinolone 계열의 Nalidixic acid에 대한 무름병균의 최소억제농도는 4균주에서 128 μg/mL, 3균주에서 64 μg/mL, 14균주에서 4 μg/mL로 균주간 반응이 다양하였다. 이는 최저 조사 농도(2.0 μg/mL) 보다 2배 이상 높은 최소억제농도를 말하는 것으로 전체 조사대상 균주의 58%를 차지하였다. 이 Nalidixic acid 항생제는 인체 및 동물의 요로감염 치료제로 사용하는 것인데도 무름병균에 대하여 다양한 최소억제농도를 보이는 것에 대해서는 향후 항생제 저항성 기작을 포함하여 오염경로 구명 등 구체적인 분석이 필요하다. 인체 동물 수산물 및 식물에 공통적으로 사용하는 Aminoglycoside계열 스트렙토마이신에 대한 무름병균의 반응도 다양하였다. 스트렙토마이신에 의한 무름병균 최소억제농도가 앞에서 언급한 E-test법으로 조사한 최소억제농도와 유사하게 128 μg/mL에 이르는 3균주를 확인하였고, 최저조사농도(2.0 μg/mL)보다 2배 이상 높은 최소억제반응을 보이는 30균주도 확인하였다. 그리고 Azithromycin, Chloramphenicol도 4.0 μg/mL 농도에서 최소억제반응을 보이는 균주가 90% 이상으로 확인되어 다양한 항생제 반응이 있었다. 이번 연구결과에서는 농산물에서 분리한 무름병균이 농업환경에 사용하지 않는 항생제에 대하여 높은 최소억제농도를 보여서 해당 항생제의 유입경로 분석과 더불어 다양한 연구가 필요한 것으로 판단된다.

Table 4.

Minimum inhibitory concentration by sensititre Hi-Q of soft rot bacteria isolated from poato, chinese cabbage and radish in Korea

본 연구에서는 농산물에 발생하는 식물병원세균의 농용항생제 및 의료용 항생제에 대한 최소억제농도를 비교하였다. 식물병원세균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum은 스트렙토마이신에 대한 최소억제농도가 2000년대에 비해 3.54 μg/mL 높아졌으며, 일부 의료용 항생제에 대하여 높거나 다양한 반응을 보였다. 이번 연구결과를 근거로 항생제 내성 유발원인과 오염경로의 추가적인 연구와 항생제 내성 최소화를 위한 작물 및 재배지역 간 연계성 분석이 필요할 것으로 생각되었다.

이해상충관계

저자는 이해 상충 관계가 없음을 선언합니다.