Mesua ferrea L. 열매 유래 탄저병원균 Colletotrichum fructicola에 대한 항진균 활성물질 탐색

서 론

Colletotrichum속 병원균은 고추, 오이, 수박, 딸기 등의 과채류와 같은 경제적으로 중요한 작물에 탄저병을 일으키는 대표적인 다범성 병원균으로(Park et al., 2004; Bailey et al., 1992; Elmer et al., 2001) 식물의 잎, 줄기, 열매 등에 궤양이나 괴사를 발생시킨다. 감자의 흑점뿌리썩음병 유발인자이며, 박과(Cucurbitaceae), 콩과(Leguminosae), 가지과(Solanaceae) 등의 식물 생장에 영향을 미쳐 과일과 채소류의 작물 생산에 경제적으로 피해를 주고 있는 것으로 보고되고 있다(Dillard, 1988; Han, 2017; Park and Kim, 1992; Ben-Daniel et al., 2009; Lees and Hilton, 2003).

자낭균(Ascomycota)의 일종인 Colletotrichum spp.는 Fungi 계 Ascomycota문 Sordariomycetes강 Glomerellales목 Glomerellaceae과 Colletotrichum속에 속한다. Colletotrichum fructicola는 C. gloeosporioides species complex에 포함되며(Weir et al., 2012), 최근 국내에서는 C. fructicola ICKb132에 의한 탄저병이 복숭아에서 보고되었다(Lee et al., 2020).

해외의 경우 Prihastuti et al. (2009)과 Ro jas et al. (2010)은 C. fructicola가 태국, 일본, 이스라엘, 미국, 호주, 독일, 브라질, 나이지리아, 파나마 등지에서 발견되었고 생물학적, 지리학적 다양성을 가지고 있는 것으로 보고하였으며, Fuentes-Aragóna et al. (2018)은 아보카도(Persea americana)와 체리모야(Annona cherimola), 커피(Coffea arabica), 사과(Malus domestica), 복숭아(Prunus persica), 망고(Mangifera indica), 동백나무(Camellia oleifera) 등 다양한 작물을 감염시키는 것으로 보고하였다.

국내에서는 탄저병균에 의한 병해 방제를 위해 물리적 방제, 경종적 방제, 화학적 방제 등 여러 방제 방법이 이용되고 있으나, 대부분 화학농약을 사용하는 화학적 방제 방법에 의존하는 경향이 있다(Lee et al., 2008). Maneb, Thiabenda-zole, Imazalil, Captafol, Prochloraz, Thiram, Silver Nanoparticle을 기반으로 한 화학 농약에 관한 연구(Han, 2017; Uribe and Loria, 1994; Marais, 1990; Lee et al., 2013), 여러 종의 식물의 잎과 뿌리 추출물을 이용한 친환경적 방제를 위한 생물학적 연구(Manasi et al., 2014), Streptomyces phaeopurpureus를 이용한 연구(Palaniyandi et al., 2013) 등이 진행되었다.

화학적 방제 기법을 적용하기 위해 널리 사용되고 있는 유기합성 농약은 사용의 편리성으로 인한 오·남용과 사용자에게 누적되는 인축독성, 저항성 출현의 문제뿐만 아니라 토양과 수질을 오염 시킬 가능성이 있으며, 나아가 생태계를 교란하고 농산물의 안전성을 위협하는 등 다양한 부작용이 발생(Ames, 1979; Delp, 1988; Staub and Sozzi, 1984) 되는 현상으로 인해 국내·외에서 유기합성농약 사용을 줄이고 친환경적 농업을 장려하고 있는 추세이다(Lee et al., 2008; Glick et al., 2007).

본 실험에서 선정한 Mesua ferrea는 아시아의 아열대 지역에 분포하는 중대형 상록 관상수이다. 어린잎은 외관이 적황색, 성숙한 잎은 외관이 청회색에서 짙은 녹색이고 길이는 약 7~15 cm이다. 꽃은 크며 중앙에 수많은 노란색 수술이 있고 4개의 흰색 꽃잎과 향기가 있다. 열매는 난형이고 1~4개의 씨가 들어 있으며 나무의 형태는 외관상 우거진 모양으로 수피는 적갈색이다(Asif et al., 2017). 이 식물의 꽃, 열매, 씨, 잎은 식용이 가능하며 질병 치료를 위해 민간요법으로 해열제, 항균제, 항암제, 이뇨제, 거담제 등에 사용되고 있다(Chahar et al., 2011). Mesua ferrea로부터 분리된 활성물질은 Friedelin, Lupeol, Amyrin, Sitosterol, Gentamicin, Amoxicillin 성분들이 보고되고 있다(Keawsa-ard et al., 2015).

따라서 본 논문에서는 C. fructicola ICKb132에 대한 화학적 방제 방법을 대처할 방안으로 친환경 유기농자재를 이용한 방제 방법을 마련하기 위하여 Mesua ferrea 열매에서 추출한 항진균 활성물질을 구명하고, 그 활성물질의 항진균 활성을 검증하였다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

Mesua ferrea 열매 MeOH 추출물 1,000 ppm 농도에서 병원 균주 접종 후 4일차에서 6일차까지 항진균 활성도를 검토한 결과, 강한 항진균 활성을 나타내었다(Table 1).

Table 1.

Antifungal activity of MeOH extract of Mesua ferrea L. fruit against Colletotrichum fructicola ICKb132 by incubation period.

MeOH 추출물 149.98 g을 증류수 500 ml에 현탁 시킨 후 순차적으로 용매분획하여 hexane fraction 55.15 g, CHCl₃ fraction 2.95 g, EtOAc fraction 9.43 g, BuOH fraction 28.97 g, aqueous fraction 53.47 g을 얻었다. 각각의 fraction들을 bioassay 한 결과, hexane, CHCl₃ fraction에서 활성이 강하게 나타났으며, EtOAc, BuOH fraction에서는 약하게, aqueous layer에서는 활성이 나타나지 않았다(Fig. 1).

Fig. 1.

Antifungal activity of solvent fractions at 500 ppm concentration against Colletotrichum fructicola ICKb132.(A: control, B: hexane fraction, C: CHCl3 fraction, D: EtOAc fraction, E: BuOH fraction, F: aqueous fraction).

강한 활성이 나타난 hexane fraction과 CHCl₃ fraction을 GC-MS로 비교분석한 결과, 동일한 peak 패턴을 나타내어 보다 용량이 많은 hexane fraction으로부터 활성물질을 분리하였다. Hexane fraction을 GC-MS로 분석하여 각각의 peak들을 profiling한 결과, 10 min~12 min 사이의 peak들은 lipid compound들로 추정되었고, 13 min~18 min 사이의 peak들은 fatty acid로, 20 min 이후의 peak들은 steroid로 추정되었다.

따라서 활성물질은 9.5 min과 18.5 min에서 나타난 peak 화합물로 추정되었다(Fig. 2).

Fig. 2.

GC chromatogram of hexane fraction.

Hexane fraction을 silica gel chromatography로 2회 분리·정제하여 얻어진 활성분획을 silica gel cartridge column으로 분리·정제하여 최종적으로 활성분획 HSSC-6와 HSSC-8을 얻었다. 활성분획 HSSC-6을 GC-MS로 분석한 결과 GC chromatogram에서 9.5 min에 나타난 A peak가 main peak로 확인되었고, 13.5 min에 나타난 peak는 mass spectrum을 Wiley library의 mass spectrum과 비교 분석한 결과 heptanoic acid로 noise peak로 판단하였다(Fig. 3).

Fig. 3.

GC chromatogram of HSSC-6 subfraction.

HSSC-6 subfration의 GC chromatogram에서 9.5 min에 나타난 A peak의 mass spectrum과 Wiley library의 mass spectrum을 비교 분석한 결과, A peak는 99% quality로(1R)-1,3-dimethyl-8-propan-2-yltricyclo[4.4.0.02,7]dec-3-ene (α-copaene) 화합물로 구조해석 되었다(Fig. 4).

Fig. 4.

Mass spectra of A peak and Wiley library.

또한 최종 활성분획 HSSC-8을 GC-MS로 분석한 결과, GC chromatogram에서 18.5 min에 나타난 B peak가 main peak로 검출되었다(Fig. 5). HSSC-8 subfraction의 main peak인 B peak의 mass spectrum과 Wiley library의 mass spectrum을 비교 분석한 결과 B peak는 98%quality로5,5,9-trimethyl-14-methylidenetetracyclo[11.2.1.0^1,10.0^4,9] shexadecane (kaur-16-ene)으로 구조해석 되었다(Fig. 6).

Fig. 5.

GC chromatogram of HSSC-8 subfraction.

Fig. 6.

Mass spectra of B peak and Wiley library.

최종적으로 Mesua ferrea 열매로부터 C. fructicola ICKb132 병원균에 대한 항진균 활성물질로 α-copaene과 kaur-16-ene으로 구조 동정하였다(Fig. 7).

Fig. 7.

Chemical structures isolated from Mesua ferrea fruit as antifungal active compound. A : a-copaene, B : kaur-16-ene.

구조 동정한 α-copaene은 열대 고등식물에서 검출되는 oily liquid hydrocarbon으로 농업 해충인 지중해 초파리(Ceratitis capitata) 수컷의 강력한 유인 물질로 살충제와 함께 사용되는 천연 유인성분으로 보고되고 있다(Nishida et al., 2000). 미국의 경우 심각한 침입 해충인 딱정벌레의 피해에 대처하기 위해 α-copaene 성분을 강화하여 대량의 딱정벌레를 포획한 연구결과가 보고된 바 있다(Kendra et al., 2016).

Kaur-16-ene은 일부 양치류, Pteris semipinnata 등에서 발견되는 다기능 생화학 물질로 항암, 항염, 폐렴과 같은 염증성 질환, 피부 미백, 색소 침착 장애에 대한 치료물질로 사용된다는 연구 결과가 보고되고 있다(Hamamoto et al., 2020).

Mesua ferrea 열매로부터 분리한 항진균 활성물질 α-copaene과 kaur-16-ene 화합물의 C. fructicola ICKb132에 대한 항진균 활성을 검토하였다(Fig. 8).

Fig. 8.

Antifungal activities of a-copaene and kaur-16-ene against Colletotrichum fructicola ICKb132. A : a-copaene, B : kaur-16-ene.

Bioassy 결과 α-copaene 화합물의 EC₅₀은 73.4 ppm, kaur-16-ene 화합물의 EC₅₀은 57.3 ppm으로 kaur-16-ene이 α-copaene 보다 다소 강한 활성을 나타내었다(Table 2).

Table 2.

EC50 (effective concentration inhibiting by 50% of mycelial growth) value of α-copaene and kaur-16-ene against Colletotrichum fructicola ICKb132

결론적으로 연구 결과 Mesua ferrea 열매로부터 분리한 α-copaene과 kaur-16-ene은 탄저병의 원인균인 C. fructicola ICKb132에 대한 항진균 활성물질로 구명되었으며, 이 활성물질은 탄저병 방제를 위한 친환경 농자재 개발에 기여할 수 있을 것으로 판단되었다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.

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