고추탄저병 병원균(Colletotrichum coccodes)에 대한 배초향(Agastache rugosa)의 지상부로부터 항진균 활성물질 탐색

서 론

식물탄저병은 Colletotrichum gloeosporioides, C. dematium, C. acutatum, C. coccodes 등의 C. spp.로 분류되는 균주들에 의해 발병한다(Park & Kim, 1992). 그 중 C. coccodes는 Ascomycota문, Sordariomycetes강, Glomerellales목, Glomerellaceae과에 속하는 진균으로써, 균사에 격막이 존재하지 않는 다수의 핵을 가진 균사체를 형성함과 더불어 무성포자에 의해 번식이 이루어지는 식물병원균이다. 주로 감자의 흑점뿌리썩음병(black dot)과 토마토의 탄저병(anthracnose)을 유발하는 것으로 알려져 있고(Thirumalachar, 1967; Mohan & Davis, Dillard, 1989), 박과(cucurbitaceae), 콩과(leguminosae) 및 가지과(solanaceae) 식물의 병균에 해당하며, C. gloeosporioides, C. acutatum 등과 더불어 고추를 포함한 경제적 작물의 생산에 피해를 주는 다범성 진균에 속한다.

식물탄저병 감염의 경우 균류는 검은 반점과 괴사성 병변이 형성(Johnson and Miliczky 1993)되고 식물의 잎과 다른 지상 부분에 검은점병이 발생하여 대량의 포자가 형성되며, 이 포자는 다른 식물 기관으로 고온다습기에 빗방울이나 토양으로 인한 상처와 관련이 있으며 관개수 혹은 바람으로 감염시킨다. 감염된 식물은 시들어 보이고 아래쪽과 가운데 잎은 엽록소가 없어지며 짙은 갈색에서 검은색으로 변한다(Mogan et al.,1992 ; Johnson, 1994).

국내에서는 1988년도 충남에서 발견된 것을 시작으로 국내의 고추와 토마토 등의 가지과 식물에 대해 지속적인 피해를 일으키고 있다(Oh et al., 1988). C. coccodes를 비롯한 C. spp. 속이 일으키는 고추 탄저병의 피해를 막기 위해 농가에서는 경종적 방제, 물리적 방제, 화학적 방제를 비롯한 방법으로 대처하고 있으며, 최근에 는 탄저병의 저항성 모종을 사용한 대처법도 확립되었다. 하지만 현행 농가에서는 여전히 Thiabendazole, Prochloraz, Thiram, Imazalil, Captafol 등을 이용하여 제조된 화학적 방제제를 사용한 대처에 의존하고 있으나 그에 따른 대가로 일부 지역의 균주들에게서 Propineb, Pyraclostrobin, Chlorothalonil 등의 화학적 방제제에 대한 내성균이 발생하는 사례가 보고되고 있으며(Ju et al., 2021), 열매부위의 잔류농약 및 오남용으로 인한 부작용의 위험이 보고되었다. 친환경제제의 경우 Bacillus sp. SW29-2 등의 방선균을 이용한 제제 등이 확인되었으나 그 수가 화학적 방제제에 비해 적은 편에 속한다(Yi et al., 2005). 따라서 탄저병의 주요 원인균이 될 수 있는 C. coccodes에 대한 신규 천연물 방제제의 개발이 필요한 것으로 판단되었다.

배초향(Agastache rugosa, AR)은 Korean mint라고도 불리는 한국, 중국, 일본 등의 동아시아권에서 자생하는 꿀풀과의 식물이다(Park, 2018). 한약재로서 사용될 때는 곽향이라고 불리며 소화불량, 감기 등에 약재로서 쓰인다(Zou, 1832). 배초향에서 유래된 생리활성 물질은 menthone, isomenthone, dihydrocarvone, anethole, vanillin, eugenol, methyl eugenol, β-caryophyllene, β-caryophyllene oxide, estragole 등이 밝혀졌다(Kim & Hong, 2021). 배초향의 메탄올 추출물에서 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 등의 균주에 대해 항균활성 효과를 나타냈으며(Hong et al., 2020) 성분 중 하나인 estragole은 Cryptococcus neoformans, Blastoschizomyces capitatus 등의 진균에 대해 항진균 활성효과를 나타내었다는 보고가 있다(Kim et al., 1999).

따라서, 본 논문에서는 C. coccodes에 대한 화학적 방제제의 오남용을 줄이기 위한 대처방안으로 친환경 유기농자재를 이용한 방제 가능성의 탐구를 위해 배초향 지상부 유래 항진균 활성물질의 구명 및 항진균 활성을 실시하였다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

배초향(Agastache rugosa) 지상부에서 추출한 배초향 메탄올 추출물은 고추 탄저병의 원인균 중 하나인 C. coccodes에 대하여 강한 활성을 나타내는 것으로 나타났다(Fig.1).

Fig.1

Antifungal activity of MeOH extract against C. coccodes at 1,000 ppm concentration. A: Control, B: MeOH extract.

A. rugosa 지상부의 항진균 활성물질을 구명하기 위하여 A. rugosa 지상부의 메탄올 추출물을 n-hexane, CHCl₃, EtOAc, BuOH, H₂O로 용매분획하여 얻은 각각의 fraction들을 대상으로 100 ppm농도에서 항진균 활성을 검정한 결과, hexane fraction에서 가장 강한 활성을 나타내었다(Fig.2).

Fig.2

Antifungal activities of solvent fractions from MeOH extract against C. coccodes at 100ppm concentration.A: Control, B: Hexane fraction, C: CHCl₃ fraction, D: EtOAc fraction, E: BuOH fraction, F: Aqueous layer.

Hexane fraction 9.65 g을 silica gel (7734) 300 g이 충진된 silica gel column chromatography에 loading하고 CHCl3:MeOH (9:1, v/v)의 용매계로 isocratic elute 방식으로 순차적으로 용출하여 50 ml씩 30개의 fraction(HS-1~HS-30)을 얻었다. 30개의 fraction들을 대상으로 항진균 활성검정을 진행한 결과 강한 활성을 나타낸 HS-3 fraction 1.9 g을 얻었다.

1.9 g의 HS-3 fraction을 2차로 silica gel(7734) 250 g이 충진된 open column chromatography에 loading하고 CHCl3:MeOH(9:1,v/v)의 용매계로 순차적으로 용출하여 10 ml씩 20개의 subfraction (HSS-1~HSS-20)을 얻었다. 20개의 subfraction들을 대상으로 항진균 활성검정을 진행한 결과 HSS-13 subfraction에서 강한 활성을 나타내어 최종적으로 활성분획 HSS-13 subfraction 0.14 g을 순수 분리·정제하였다.

항진균 활성이 확인된 HSS-13 subfraction을 GC/MS로 분석한 결과 GC chromatogram에서 13.45 min에서 나타난 A peak가 main peak로 확인되었다(Fig.3).

Fig.3

GC chromatogram of HSS-13 subfraction.

HSS-13 subfraction의 GC chromatogram 상에서 13.45 min에 나타난 A peak의 mass spectrum과 Wiley library의 mass spectrum을 비교 분석한 결과, A peak는 87% quality로 (1R,4S,4aS,6R,8aS)-4,8a,9,9-tetramethyldecahydro-1,6-methanonaphthalen-1-ol(Patchouli alcohol)화합물로 추정되었다(Fig.4).

Fig.4

Mass spectra of A peak (A) and Patchouli alcohol (B) in Wiley library.

이 항진균 활성물질로 추정되는 화합물을 명확히 구명하기 위하여 시판되고 있는 표준품 Patchouli alcohol을 ChemFaces사에서 구매하여 GC-MS로 비교 분석을 진행하였다.

분석결과 표준품 Patchouli alcohol는 13.385min에서 peak가 확인되었으며(Fig.5) 해당 peak의 MS spectrum(Fig.6)과 HSS-13 subfraction A peak의 MS spectrum의 비교분석을 진행한 결과 일치하였다.

Fig.5

GC Chromatogram of Patchouli alcohol.

Fig.6

Mass spectrum of Patchouli alcohol.

따라서, HSS-13 subfraction에서 분리된 항균활성 화합물은 Patchouli alcohol로 동정되었다.

Patchouli alcohol은 1869년도에 Gal이 Patchouli에서 처음으로 분리하였으며 해당물질의 화학적 조성을 Montgolfier가 C₁₅H₂₆O로 구명하였다(Büchi et al., 1961). Patchouli alcohol은 대장암, 유방암, 췌장암 등의 종양형성과 염증반응을 억제하고, 경구 투여했을 경우 식세포 능력의 향상 및 체액성 면역 반응 증가에 영향을 끼쳐 임상용 면역 조절제로서 연구되어지고 있으며 쥐를 대상으로 한 실험에서 LD₅₀값이 4.693 g/kg로 확인되어 생물에 대한 독성이 낮은 것으로 알려져 있다(Liao et al., 2013). 항균효과에 대해서 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus proteus, Shigella dysenteriae, Bacillus thuringiensis 등에 강한 항균활성을 가지는 것으로 보고된 바 있으며(Yang et al., 2013) anti-influenza virus 실험에서도 인플루엔자 바이러스에 대해 억제반응을 내는 것으로 알려져 있고(Kiyohara et al., 2012) 항진균 실험에서는 Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae 등의 곰팡이에 대해 무성번식을 억제함으로써 곰팡이 군집의 성장률을 감소시키는 것으로 확인되었다(Kocevski et al., 2013).

Fig.7

Chemical structure isolated from Agastache rugosa aerial part as antifungal active compound.

항진균 활성 평가

A. rugosa 지상부로부터 활성물질로 분리 동정된 Patchouli alcohol 화합물의 C. coccodes에 대한 정확한 항균활성을 검정하기 위하여 표준품 Patchouli alcohol을 메탄올 용매에 녹인 후 최종농도가 0, 1, 10, 50, 100 ppm이 되도록 PDA배지에 첨가하여 실험배지를 제조하였다. 시험균주를 배지 중앙에 치상하여 25℃ incubator에서 6일간 배양 후 항진균 활성을 검정하여(Fig. 8) EC₅₀값을 산출하였다.

Figure.8

Antifungal activities of Patchouli alcohol against C. coccodes.A, Control ; B, 1 ppm ; C, 10 ppm ; D, 50 ppm ; E, 100 ppm.

생물검정을 진행한 결과 Patchouli alcohol은 C. coccodes에 대해 50 ppm 이상 농도에서 항진균 활성을 나타냈으며 100 ppm 이상의 농도에서 C. coccodes 균주 생육을 확연하게 억제되는 것이 확인되었다. Patchouli alcohol EC₅₀ 값을 측정한 결과 48.911 ppm에서 50% 이상의 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.

A. rugosa 지상부로부터 분리 및 동정된 Patchouli alcohol은 포도나무와 담배에 괴사성병변을 일으키는 주요원인균인 Botrytis cinerea에 대하여 200 ppm의 농도에서 생장을 억제하는 것으로도 확인되었다(Vallejo et al., 2001).

결과적으로 A. rugosa 지상부로부터 분리 및 동정된 Patchouli alcohol은 C. coccodes에 대한 항진균억제능이 확인되었기에 친환경 유기농자재로서의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.

이해상충관계

저자는 이해 상충관계가 없음을 선언합니다.

References

• AAT Bioquest, Inc. 2024, April 8. Quest Graph™ EC₅₀ Calculator. AAT Bioquest. https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator, .
• A. K. Lees, A. J. Hilton. (2003), Black dot (Colletotrichum coccodes): an increasingly important disease of potato, 20 January 2003. [https://doi.org/10.1046/j.1365-3059.2003.00793.x]
• Büchi, G., Erickson, R., & Wakabayashi, N. (1961). Terpenes. XVI. 1, 2 constitution of Patchouli alcohol and absolute configuration of cedrene. Journal of the American Chemical Society, 83(4), 927-938. [https://doi.org/10.1021/ja01465a042]
• Choi, J. S., Lee, D. W., & Choi, Y. H. (2020). Isolation of Antifungal Activity Substance from Rheum australe D. Don Roots against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Saccardo) Snyder & Hansen. Korean Journal of Organic Agriculture, 28(1), 95-108.
• Han, K. S., Park, J. H., Han, Y. K., & Hwang, J. H. (2009). Pathogenicity and Occurrence of Pepper Seedling Anthracnose Caused by Colletotrichum acutatum. Research in Plant Disease, 15(2), 88-93. [https://doi.org/10.5423/RPD.2009.15.2.088]
• Hong, M. J., Kim, J. H., Kim, H. Y., Kim, M. J., & Kim, S. M. (2020). Chemical composition and biological activity of essential oil of Agastache rugosa (Fisch. & CA Mey.) O. Kuntze. Korean Journal of Medicinal Crop Science, 28(2), 95-110. [https://doi.org/10.7783/KJMCS.2020.28.2.95]
• Hu, G., Peng, C., Xie, X., Zhang, S., & Cao, X. (2017). Availability, pharmaceutics, security, pharmacokinetics, and pharmacological activities of Patchouli alcohol. Evidence-based complementary and alternative medicine, 2017. [https://doi.org/10.1155/2017/4850612]
• Jeon, K. M., & Choi, Y. H., (2023). Antifungal Activity Substances from Mesua ferrea L. fruit against Colletotrichum fructicola. The Korean Journal of Pesticide Science. 27(3), 202-209. [https://doi.org/10.7585/kjps.2023.27.3.202]
• Johnson and Miliczky (1993), Potato Black Dot – The Elusive Pathogen, Disease evelopment and Management, American Journal of Potato Research, Volume 95, pages 340–350, (2018). [https://doi.org/10.1007/s12230-018-9633-5]
• 11. Ju, H. Y., Son, M. R., & Kim, J. W. (2021). Response to Fungicides of Colletotrichum spp. Isolated from Red Peppers in Sunchang, Korea. Research in Plant Disease, 27(4), 164-171. [https://doi.org/10.5423/RPD.2021.27.4.164]
• Kim, J. B., Cho, K. J., Hwang, Y. S., Park, R. D., & Kim, J. B. (1999). Isolation, identification, and activity of rosmarinic acid, a potent antioxidant extracted from Korean Agastache rugosa. Applied Biological Chemistry, 42(3), 262-266.
• Kim, J. Y., Woon, J. S., Kim, H. J., & Kim, S. H. (2018). Molecular markers for the rapid detection of Colletotrichum coccodes, an anthracnose pathogen of tomato. The Korean Journal of Mycology, 46(2), 186-192.
• Kiyohara, H., Ichino, C., Kawamura, Y., Nagai, T., Sato, N., & Yamada, H. (2012). Patchouli alcohol: in vitro direct anti-influenza virus sesquiterpene in Pogostemon cablin Benth. Journal of Natural Medicines, 66, 55-61. [https://doi.org/10.1007/s11418-011-0550-x]
• Kocevski, D., Du, M., Kan, J., Jing, C., Lačanin, I., & Pavlović, H. (2013). Antifungal effect of Allium tuberosum, Cinnamomum cassia, and Pogostemon cablin essential oils and their components against population of Aspergillus species. Journal of Food Science, 78(5), M731-M737. [https://doi.org/10.1111/1750-3841.12118]
• Liao, J. B., Wu, D. W., Peng, S. Z., Xie, J. H., Li, Y. C., Su, J. Y., Chen, J. N., & Su, Z. R. (2013). Immunomodulatory potential of Patchouli alcohol isolated from Pogostemon cablin (Blanco) Benth (Lamiaceae) in mice. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 12(4), 559-565. [https://doi.org/10.4314/tjpr.v12i4.18]
• Oh, I. S., In, M. S., Woo, I. S., Lee, S. K., & Yu, S. H. (1988). Anthracnose of Pepper seedling caused by Colletotrichum coccodes (Wallr.) Hughes. The Korean Journal of Mycology, 16(3), 151-156.
• Park, K. S., & Kim, C. H. (1992). Identification, distribution and etiological characteristics of anthracnose fungi of red pepper in Korea. The Plant Pathology Journal, 8(1), 61-69.
• Park, S., Kwon, T., Lim, Y., Jung, K., & Choi, B. (1996). Disease survey in melon, watermelon, and cucumber with different successive cropping periods under vinylhouse conditions. Korean Journal of Plant Pathology, 12(4), 428-431.
• Ragucci, S., Castaldi, S., Landi, N., Isticato, R., & Di Maro, A. (2023). Antifungal Activity of Ageritin, a Ribotoxin-like Protein from Cyclocybe aegerita Edible Mushroom, against Phytopathogenic Fungi. Toxins, 15(9), 578. [https://doi.org/10.3390/toxins15090578]
• Song, J. H., Kim, M. J., Kwon, K. D., Lee, W. K., & Park, I. H. (1999). Antimicrobial activity and characterization of volatile flavor extracts from Agastache rugosa. Preventive Nutrition and Food Science, 4(2), 97-102.
• Weyerstahl, P., Gansau, C., & Marschall, H. (1993). Structure–odour correlation. Part XVIII. 1 Partial structures of patchoulol with bicyclo [2.2. 2] octane skeleton. Flavour and fragrance journal, 8(6), 297- 306. [https://doi.org/10.1002/ffj.2730080603]
• Yang, X., Zhang, X., Yang, S. P., & Liu, W. Q. (2013). Evaluation of the antibacterial activity of Patchouli oil. Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 12(3), 307.
• Yi, Y. S., Kim, H. S., Choi, G. J., Cho, K. Y., & Lim, Y. H. (2005). Antifungal activity of Bacillus sp. against pepper anthracnose. Journal of Applied Biological Chemistry, 48(3), 151-152.
• H., Park, J. S., Oh, I. S., Wu, I. S., Mathur, S.B. (1987). Colletotrichum coccodes found in seeds of Capsicum annuum and pathogenicity to Solanaceae plants. Korean Journal of Mycology, 15(3), 183-186.