과수화상병 방제를 위해 수간주입한 스트렙토마이신의 잔류특성

서 론

과수 화상병은 사과, 배 등 장미과 기주에 병원균인 Erwinia amylovora에 의해 감염되어 일으키는 병으로 발병된 나무는 잎, 꽃, 가지, 과실 등이 불에 탄 것처럼 마름 증상이 나타나며 과수 전체에 고사를 일으킨다(Billing, 2011). 또한, 발병한 과원은 폐원 후 발생한 감염주는 물론 인접주까지 매몰조치 되므로 농업인의 경제적Ÿ·정신적 피해가 상당하다. 따라서 화상병균은 위험도가 매우 높아 식물방역법상 도입 금지 병원균으로 지정 및 관리되고 있다.

화상병은 1780년 미국의 뉴욕에서 최초 발생 보고된 후 뉴질랜드, 유럽, 중앙아시아 등 세계의 여러 나라에서 발생하고 있으며(van der Zwet et al., 2012), 우리나라의 경우 2015년 경기도 안성 소재의 배 과원에서 화상병 발병이 최초로 보고된 후(Park et al., 2016) 안성, 천안의 배 과원 및 제천, 천안의 사과 과원에서 화상병 발병이 연달아 보고된 바 있다(Myung et al., 2016).

화상병균의 안착을 막기 위해 방제권역별 설정된 공적방제 범위에 따라 발생지역 또는 발생주 100 m 이내 과원을 방제구역으로 설정하여 기주식물은 매몰·Ÿ폐기 되며, 주변 2 km 이내는 위험구역으로 설정하여 적극적인 화학적 방제와 발생 상황 예찰을 실시하고있다. 또한, 5 km 이내는 관리구역으로 설정하여 화학적 방제 및 주기적인 모니터링을 통해 예방하고있다(Park et al., 2017). 우리나라의 관리 방법과 비슷한 외국의 사례의 경우 대표적으로 스위스와 이스라엘이 있다. 두 나라 모두 화상병 발병 후 완전 박멸을 위해 기주식물 매몰 및 방제 등 국가적 총력에도 불구하고 산발적으로 확산된 후 전국적으로 확대되었다(Ham et al., 2020).

화상병은 완벽한 예방과 박멸이 어려우며, 잠복기가 길고 전염성 또한 강하여 확산을 최소화 시키거나 치료 목적의 약제 개발 등 추가적인 연구가 필요한 실정이다. 그러나, 화상병은 도입 금지 검역병으로써 일반적인 포장시험은 불가능하여 격리된 시설 또는 시험구역에서 진행되어야 하지만(Ham at al., 2023), 과수 재배환경 특성상 비Ÿ·바람 등 환경적인 요인에 의한 감염과 확산에 매우 취약하여 시험시설의 섭외는 사실상 불가능에 가깝다. 이에 따라, 화상병에 등록되어 사용되는 대부분의 약제는 국내의 사과와 배에 다른 병해충 방제로 등록된 약제를 약해 시험만을 거쳐 직권등록한 후 사용되고 있는 실정이다(Lee at al., 2018).

화상병의 예찰Ÿ·방제 방법에는 시기에 따라 물리적, 생물학적, 화학적 방제로 나뉜다. 이 중 화학적 방제는 대부분 항생제를 활용한 경엽처리로 이루어지며 약제는 대표적으로 스트렙토마이신(Streptomycin), 옥시테트라사이클린 (Oxytetracycline) 옥솔린산(Oxolinic acid) 등이 있다.

과수 재배 환경 특성상 경엽처리는 기상 조건의 영향을 받아 비산에 의한 약제의 손실이 있을 수 있으며, 약액이 표면에 붙어 수체 내부로 침투Ÿ·이행되는 양이 적다. 반면, 수간주입법은 나무에 천공을 뚫고 약제를 직접 주입하기 때문에 손실 없이 모든 부위에 침투시켜 경엽처리 대비 병원균 제어에 더욱 효과적이다(Lee et al., 2009, Cha et al., 2020).

Streptomycin은 아미노글리코사이드계 항생제로써 광범위한 병원균의 단백질 합성을 저해시키며, 선행연구에 따라 단제의 경우 화상병을 대상으로 한 방제가가 가장 높아 효과가 입증되어 연구Ÿ·개발 대상약제로 선정되었다(Sundin et al., 2008; Tancos et al., 2016, Ham et al., 2023).

따라서 본 연구는 streptomycin을 사과나무와 배나무에 수간주입한 후 수체 내 이동성과 지속성을 확인하여 약제 개발 가능성을 검토하고자 하였다.

재료 및 방법

수간주사 방법

선행 연구에 따르면 화상병의 발병 후 확산은 수령이 10년 이하인 과수에서 빠르다는 보고가 있었다(Johnson & Temple., 2016). 또한, 수령이 5년인 사과 과원과 수령이 10년 이하인 배 과원에서 감염 확산이 빠르다는 보고가 있었다(Lee at al., 2020). 간접적으로 수령이 어린 나무에서 확산이 빠르다는 것을 추정하여 본 연구에서도 수령이 어린 나무를 대상 작물로 선택하였다.

대상 작물의 수령과 품종은 사과나무의 경우 수령이 4년인 감홍(흉고직경 2~3 cm, 평균수고 2 m)이었으며, 배나무의 경우 수령이 4년인 신고(흉고직경 3~4 cm, 평균 수고 1.5 m)를 대상으로 하였다.

수간주사 방법은 사과나무는 2022년 4월 23일, 배나무는 2022년 4월 7일 지상부 20 cm에 전동드릴(3 mm)을 이용하여 한 개의 천공을 한 다음, 5 mL 사이즈의 원뿔형 팁을 꽂은 후 streptomycin 1% 액제를 흉고직경(cm) 당 원액 1 mL씩 중력에 의해 주입하였다(Fig. 1).

Fig. 1

Trunk injection method per chest height diameter.

시료채취 방법

수간주입 후 10, 20, 30 및 50일 차에 뿌리를 제외한 지상부 10 cm 위로 나무를 절단하였다(Fig. 2). 절단한 나무의 총 높이를 동일한 비율로 상, 중, 하를 나누어 전지가위를 사용하여 부위별로 잘랐다. 이후 잎을 제거한 다음 나무의 몸통과 가지부분만 분쇄기로 마쇄하여 분석 전까지 -20^oC 냉동고에 보관하였다.

Fig. 2

Days after trunk-injection sampling parts of height.

LC-MS/MS 기기분석 조건

Streptomycin 및 dihydrostreptomycin의 분석은 Shimadzu(Kyoto, Japan)사의 액체크로마토그래프(Nexera UPLC)와 질량분석기(LCMS-8060)를 사용하였다. 기기분석에 사용된 칼럼은 streptomycin의 경우 Waters(Milford, MA, USA)사의 Xbridge^® Amide (3.5 µm, 2.1 I.D.×100 mm L.)를 사용하였으며, dihydrostreptomycin의 경우 OKAKA SODA (Osaka, Japan)사의 CAPCELL PAK C18 MG III (5 µm, 2.0 mm I.D.×100 mm L.)를 사용하였으며 기기분석 조건은 Table 1과 같다.

Table 1.

Analytical condition for determination of streptomycin and dihydrostreptomycin

두 성분 모두 각 성분에 맞는 이동상으로 기울기 용리 방식을 통해 분석 대상 물질을 분리시켰으며, ESI (Electrospray ionization)의 positive mode로 cone voltage, collision energy 및 정량이온과 정성이온을 선택하였다. 확립된 질량분석 조건은 Table 2와 같다.

Table 2.

LC-MS/MS condition for streptomycin and dihydrostreptomycin

잔류분석법 검증

확립된 전처리 방법과 기기분석법으로 정확성(Accuracy), 재현성(Reproducibility), 직선성(Linearity), 검출한계(Limit of detection) 와 정량한계(Limit of quantitation)를 검증하였다. 표준용액과 무처리 시료의 기기분석 결과를 비교하여 간섭물질의 영향이 없음을 확인하였으며(Fig. 3), 무처리 시료와 표준용액으로 matrix-matched하여 분석한 다음 peak의 면적으로 검량선을 작성한 후 결정계수(R², Coefficients of determination)를 산출하였다. 또한, 검출한계 및 정량한계의 최소검출량을 peak의 S/N (Signal-to-noise ratio)비가 각각 3과 10 이상으로 나타났음을 확인하였다. 검출한계와 정량한계는 최소검출량, 시료 무게, 희석배수, 주입량을 사용하여 산출하였다. 분석법의 정확성을 판단하기 위해 정량한계와 정량한계의 10배 수준에 해당되는 스트렙토마이신 및 디히드로스트렙토마이신 혼합표준용액을 첨가하여 상기 분석법과 동일하게 3반복으로 분석한 다음 회수율의 평균과 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)를 산출하였다.

Fig. 3

Chromatograms of streptomycin and dihydrostreptomycin. (A) matrix-matched standard 0.1 ng, (B) control, (C) recovery test 0.2 mg/kg, (D) sample

본 시험에 사용된 표준물질은 streptomycin sulfate 및 dihydrostreptomycin sesquisulfate를 사용하였으므로 각각 streptomycin, dihydrostreptomycin으로 환산하였으며, streptomycin의 잔류물의 정의는 streptomycin 모화합물과 dihydrostreptomycin의 합이므로 streptomycin의 잔류량 값에 dihydrostreptomycin의 잔류량에 환산계수를 곱한 값을 더하여 최종 산출하였다.

• Total streptomycin = [streptomycin의 잔류량 × ¹⁾환산계수(1.25)] + [Dihydrostreptomycin 잔류량 × ²⁾환산계수(1.25) × ³⁾환산계수(0.997)]
• ¹⁾환산계수(1.25) = 1457.3 (Streptomycin sulfate의 분자량) / 581.6 (Streptomycin의 분자량) × 2분자
• ²⁾환산계수(1.25) = 730.7(Dihydrostreptomycin sesquisulfate의 분자량) / 583.6(Dihydrostreptomycin의 분자량)
• ³⁾ 환산계수(0.997) = 581.3(Streptomycin의 분자량) / 583.6 (Dihydrostreptomycin의 분자량)

결과 및 고찰

분석법의 유효성 검증

Streptomycin 및 dihydrostreptomycin 두 성분 모두 머무름 시간에 방해물질이 검출되지 않아 높은 분리능과 선택성으로 분석을 진행하였다. Matrix가 90% 함유된 0.0005 mg/L 부터 0.02 mg/L의 matrix-matched standard를 이용하여 검량선을 작성하였다. 결정계수(r²) 값은 0.99 이상으로 높은 직선성을 나타냈다. 검출한계는 0.01 mg/kg, 정량한계는 0.02 mg/kg이었다. 회수율 시험 결과는 평균 70~120% 이내로 나타났으며, 상대표준편차는 20% 미만으로 산출되어 Codex 가이드라인의 잔류농약 분석 기준(CAC/GL 40-1993, 2003) 및 농촌진흥청의 농약 및 원제의 등록기준에 적합하였다(Table 3).

Table 3.

Recovery result and Limit of quantitation

• 정량한계(mg/kg)= ¹⁾정량한계 최소검출량(ng) × (최종정용부피(mL) / 시료무게(g)) × (1 / 주입량(µL))= 0.005 ng × (400 mL / 10 g) × (1 / 10 µL) = 0.02 mg/kg¹⁾ 정량한계 최소검출량= 기기상 정량한계(ng/µL) × 주입량(µL)

Streptomycin의 이동성과 지속성

나무 내 유효성분의 이동성과 지속성을 조사하기 위해 수간주입 후 시간 경과 및 나무의 높이에 따라 시료를 채취한 뒤 잔류량을 조사하였다. 결과는 Table 4와 같으며 대사체인 dihydrostreptomycin은 사과나무와 배나무 모든 시료에서 정량한계 미만으로 검출되었다.

Table 4.

Total streptomycin residues in the apple and pear trees after trunk injection

수간주입 후 streptomycin은 사과나무의 경우 10일차 시료부터, 배나무의 경우 20일차 시료부터 중·상부에 잔류가 확인되어 수체 내 이동성을 가졌음을 알 수 있었다. 또한, 사과나무와 배나무 모두 30일차 시료부터 중·상부에서 잔류량이 확연히 증가하는 것을 확인하였다(Table 4). 이는 시간 경과에 따라 꽃의 만개와 함께 잎의 수도 많아지므로 활발한 광합성에 의해 하부에서 상부로 이동하는 물의 양 또한 많아지는 것이 원인이라 판단하였다.

그러나, 시간경과에 따른 사과나무와 배나무의 잔류분포 양상은 다르게 나타났다(Fig. 4). 사과나무의 경우 30일 이후부터 하부의 잔류량이 감소하고 중·상부의 잔류량이 점차 증가하는 경향을 보인 반면, 배나무의 경우 50일차까지 하·중·상부의 잔류량이 전부 증가하는 양상으로 나타났다. 이는, 수체 내 증산류는 언제나 아래에서 위, 뿌리에서 잎으로 이동한다고 알려져 있으므로 시간 경과에 따른 잔류 양상은 하부에서 점차 소실되고, 상부에서 대부분의 잔류가 확인되었어야 한다. 그러나, 많은 선행연구에 따라 수간주입된 물질은 모든 방향으로의 이동성을 가진 것이 확인된 바 있으며(Tattar and Tattar, 1999, VanWoerkom, 2012, Lee et al., 2014, Cha et al., 2019), 사과나무와 배나무의 생육 과정과 수체 내부의 특성 등 여러 요인에 의한 결과로 사료된다.

Fig. 4

Average residual amount graph over time after trunk-injection as apple tree & pear tree.

주입된 약액의 이동성을 결정하는 요인은 나무의 생리적 특성, 목질부의 형태, 수관의 상태, 기후 및 토성 환경, 물질의 화학적 특성 및 제형 등이 있다(Reil, 1979, Perry et al., 1991, Tattar, 1989, Sánchez-Zamora and Fernández-Escobar, 2000, Sur and Stork, 2003; VanWoerkom, 2012, Aćimović et al., 2016).

나무의 생리적 특성에서 수종에 따른 목질부의 형태와 구조는 이동성에 큰 영향을 미친다. 목질부의 구성 세포로는 도관(vessel), 가도관(tracheid), 섬유(fiber) 및 유조직(peranchyma) 등 네 가지로 이루어져있으며, 목질부의 구성에 따라 이동량 차이가 있다. 도관은 지름이 커서 많은 양의 이동성을 가지며(Chaney, 1986), 가도관은 도관에 비해 좁고 끝이 막혀있는 구조이므로 상대적으로 이동성이 낮다(Sinclair, 1981). 통도세포에 따른 나무의 재(wood)는 산공재(Diffusive porous wood), 환공재(Ring porous wood), 무공재(Non-porous wood) 등이 있다. 수체 내 물의 이동속도는 대략적으로 환공재 > 산공재 > 무공재 순이다. 또한, 침엽수와 활엽수에서 오는 차이점도 있다. 활엽수는 도관과 가도관이 적절히 혼합되어 있는 반면, 침엽수는 주로 가도관으로 이루어져있다. 사과나무와 배나무는 산공재 활엽수에 해당되어(VanWoerkom, 2012) 수체 내 물의 이동에 따라 약액이 상층부까지 적절히 이동되는 것을 알 수 있었다.

또한, streptomycin의 물리화학적 특성 중 물에 대한 용해도는 >2×104 mg/L (pH 7, 28^oC)으로 높은 극성을 가졌고(MacBean, 2013), 사용한 농약의 제형은 액제로써 streptomycin을 물에 녹인 다음 계면활성제를 첨가하여 제제화한 액상제형으로 물에 대한 용해도가 높다. 따라서 수관 내 물관에 효율적으로 이행되어 양호한 이동성을 가졌을 것이라 사료된다.

주입 시기와 환경 또한 약액의 이동성에 큰 영향을 미친다. 선행연구에 따르면 사과나무와 자두나무에서 열매를 수확 후 곧바로 수간주입 했을 때 보다 월동 후 발아직전 또는 개화기에 수간주입 했을 때 약액이 물관부로만 이동하여 이동성이 뛰어났다(Clifford et al., 1987). 또한, 그 밖의 많은 연구에서도 생육 후기보다 초기에 수간주입이 더 적절하다고 보고되었다(Cha et al., 2003, Sánchez-Zamora and Fernández-Escobar, 2000 , Tattar and Tattar, 2007).

시료 수확 최대 기간인 50일차 까지 잔류가 지속되었음을 확인하였다(Table 4). 지속성을 결정하는 요인은 수간주입시 약제의 양이 적고 수용성이 높을수록 수체 내 약효 지속시간도 길어진다고 보고된 바 있다(Lee at al., 2020). 따라서, 개화전 streptomycin 액제를 흉고직경당 1 mL씩 수간주입 하였을 때 나무의 생리적 특성, 주입 시기와 환경 특성, 물질의 물리화학적 특성, 제형의 특성, 약제 주입량 및 잔류분석 결과를 토대로 수체 내 이동성과 지속성에 미치는 영향들은 모두 양호하다고 판단하였다. 그러나, 사과나무와 배나무의 이동성 차이의 원인 규명을 위해 잎과 뿌리 등 분석 부위 추가, 50일 이후 약액의 지속성과 잔류분포 양상 확인을 위한 시료 채취 기간의 증가 등 추가연구가 필요하다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청의 연구비 지원에 의하여 수행되었습니다(PJ015059).

References

• Aćimović, S. G., VanWoerkom, A. H., Garavaglia, T., Vandervoort, C., Sundin, G. W., & Wise, J. C. (2016). Seasonal and cross-seasonal timing of fungicide trunk injections in apple trees to optimize management of apple scab. Plant Disease, 100(8), 1606-1616. [https://doi.org/10.1094/PDIS-09-15-1061-RE]
• Billing, E. (2011). Fire blight. Why do views on host invasion by Erwinia amylovora differ?. Plant Pathology, 60(2), 178-189. [https://doi.org/10.1111/j.1365-3059.2010.02382.x]
• Cha, B., Kim, M., Kim, J., Kim, C., & Lee, K. J. (2019). Influence of the injection wound size and the crown condition on the trunkinjection efficiency in Zelkova trees. The Journal of Agriculutre Life Science 53(1), 73-84. [https://doi.org/10.14397/jals.2019.53.1.73]
• Cha, B. J., Han, S. S, Kim, K. W, Kim, D. S & Lee, D. W. (2020). Improving Strategies for Trunk Injection Considering Tree Anatomy and Physiology. The Korean Journal of Pesticide Science, 24(2), 344-351 [https://doi.org/10.7585/kjps.2020.24.2.218]
• Chaney, W. R. (1986). Anatomy and physiology related to chemical movement in trees. Arboriculture & Urban Forestry (AUF), 12(4), 85-91. [https://doi.org/10.48044/jauf.1986.019]
• Clifford, D. R., Gendle, P., & Holgate, M. E. (1987). Uptake and movement of the fungicide imazalil following trunk injection into apple and plum trees by a novel, rapid technique. Annals of applied biology, 111(3), 541-551. [https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.1987.tb02012.x]
• Ham, H. H, Lee, K. J., Hong, S. J., Kong, H. G., Lee, M. H., Kim, H. R., & Lee, Y. H. (2020). Outbreak of fire blight of apple and pear and its characteristics in Korea in 2019. Research in Plant Disease, 26(4), 239-249. [https://doi.org/10.5423/RPD.2020.26.4.239]
• Ham, H. H, Lee M. H., Roh, E. J., Lee, W. H., Choi, H. W., Yang, M. S., & Lee, Y. H. (2023). Effect of the Registered Control Agents for Fire Blight on Fire Blight Disease at Flowering Stage of Apple in Korea. The Korean Journal of Pesticide Science, 27(4), 344-351. [https://doi.org/10.7585/kjps.2023.27.4.344]
• Heo, G. I., Shin, D. S., Son, S. H., Oh, C. S., Park, D. H., Lee, Y. K., & Cha, J. S. (2017). On-site diagnosis of fire blight with antibody-based diagnostic strips. Research in Plant Disease, 23(4), 306-313. [https://doi.org/10.5423/RPD.2017.23.4.306]
• Johnson, K. B., & Temple, T. N. (2016). Comparison of methods of acibenzolar-S-methyl application for post-infection fire blight suppression in pear and apple. Plant Disease, 100(6), 1125-1131. [https://doi.org/10.1094/PDIS-09-15-1062-RE]
• Lee, H. S., Do, J. A., Park, J. S., Park, S. M., Cho, S. M., Shin, H. S., Jang, D. E., Choi, Y. N., & Lee, K. (2019). Development of simultaneous analytical method for streptomycin and dihydrostreptomycin detection in agricultural products using LC-MS/MS. Journal of Food Hygiene and Safety, 34(1), 13-21. [https://doi.org/10.13103/JFHS.2019.34.1.13]
• Lee, S. M., Kim, D. S., Kim, C. S., Choo, H. Y., & Lee, D. W. (2008). Possibility of simultaneous control of pine wilt disease and Thecodiplosis japonensis and or Matsucoccus thunbergianae on black pine (Pinus thunbergii) by abamectin and emamectin benzoate. The Korean Journal of Pesticide Science, 12(4), 363-367. [https://doi.org/10.7585/kjps.2021.25.4.363]
• Lee, S. M., Kim D. S., Kim, C. S., Cho K. S., Choo H. Y., & Lee D. W. (2009). Persistence and Distribution of Trunk-Injected Abamectin in Pinus thunbergii and Pinus koraiensis Tissues. The Korean Journal of Pesticide Science, 13(3), 190-196.
• MacBean, C. (Ed.). (2012). The pesticide manual: a world compendium. Cambridge: BCPC.
• MacBean C, 2012. The pesticide manual: a world com pendium. BCPC. pp.1070-1071.
• Park, D. H., Yu, J. G., Oh, E. J., Han, K. S., Yea, M. C., Lee, S. J., ... & Oh, C. S. (2016). First report of fire blight disease on Asian pear caused by Erwinia amylovora in Korea. Plant Disease, 100(9), 1946- 1946. [https://doi.org/10.1094/PDIS-11-15-1364-PDN]
• Park, D. H., Lee, Y. G., Kim, J. S., Cha, J. S., & Oh, C. S. (2017). Current status of fire blight caused by Erwinia amylovora and action for its management in Korea. Journal of plant pathology, 59-63.
• Perry, T. O., Santamour, F. S., Stipes, R. J., Shear, T., & Shigo, A. L. (1991). Exploring alternatives to tree injection. Journal of Arboriculture, 17(8), 217-226. [https://doi.org/10.48044/jauf.1991.052]
• Reil, W. (1979). Pressure-injecting chemicals into trees. California Agriculture, 33(6), 16-19.
• Sinclair, W. A., & Larsen, A. O. (1981). Wood characteristics related to'injectability'of trees. [https://doi.org/10.48044/jauf.1981.002]
• Sundin, G. W., Werner, N. A., Yoder, K. S., & Aldwinckle, H. S. (2009). Field evaluation of biological control of fire blight in the eastern United States. Plant Disease, 93(4), 386-394. [https://doi.org/10.1094/PDIS-93-4-0386]
• Sur, R., & Stork, A. (2003). Uptake, translocation and metabolism of imidacloprid in plants. Bulletin of insectology, 56, 35-40.
• Tancos, K. A., & Cox, K. D. (2016). Exploring diversity and origins of streptomycin-resistant Erwinia amylovora isolates in New York through CRISPR spacer arrays. Plant Disease, 100(7), 1307-1313. [https://doi.org/10.1094/PDIS-01-16-0088-RE]
• Tattar, T. A., & Tattar, S. J. (1999). Evidence for the downward movement of materials injected into trees. Journal of Arboriculture, 25, 325- 332. [https://doi.org/10.48044/jauf.1999.043]
• Tattar, T. A. (2012). Diseases of shade trees. Elsevier.
• Van der Zwet, T., Orolaza-Halbrendt, N., & Zeller, W. (2012). CHAPTER 6: Growth and Physiology of Erwinia amylovora. In Fire Blight: History, Biology, and Management . The American Phytopathological Society. 83-108 [https://doi.org/10.1094/9780890544839.008]
• Van Der Zwet, T., & Keil, H. L. (1979). Fire blight: A bacterial disease of rosaceous plants (No. 510). US Department of Agriculture.
• VanWoerkom AH, 2012. Trunk injection: a new and innovative technique for pesticide delivery in tree fruits. Masters Thesis. Michigan State University, Ann Arbor, 150pp.
• Zamora, M. S., & Escobar, R. F. (2000). Injector-size and the time of application affects uptake of tree trunk-injected solutions. Scientia Horticulturae, 84(1-2), 163-177. [https://doi.org/10.1016/S0304-4238(99)00095-3]
• Zillmer, R. E., Chaney, W. R., & Holt, H. A. (1991). Structural and biological effects of trunk injected paclobutrazol in yellow poplar. Arboriculture & Urban Forestry (AUF), 17(10), 261-268. [https://doi.org/10.48044/jauf.1991.060]