살균제 사용량과 기상학적 발병 위험도가 고추 탄저병균의 Fluazinam 저항성 발생 정도에 미치는 영향에 대한 혼합효과모델링 연구

서 론

Colletotrichum spp.에 의해 발생하는 탄저병은 전 세계의 다양한 작물에 심각한 경제적 피해를 초래하는 것으로 보고되고 있다(Bosland and Votava, 2012; Shin et al., 2022). 국내 고추 재배 농가에서도 지속적으로 탄저병이 발생하고 있으며 연간 20~30%에 달하는 수량 손실이 발생하는 것으로 알려져있다(Kim et al., 2008). 또한, Ahn et al. (2014) 이 수행한 기후변화 영향평가에 의하면 2050년대까지 국내 고추 탄저병의 발병 위험도가 지속적으로 증가할 것으로 예상되었다.

전세계적으로 고추 탄저병을 효과적으로 관리 및 방제하기 위해 오랜 기간 화학 농약이 사용되어왔다(Lamsal et al., 2011). 국내에서 고추 탄저병 방제를 위해 등록된 살균제는 총 513종으로, 이 중 피라클로스트로빈(pyraclostrobin)계열이 93종, 플루아지남(fluazinam)이 40종, 테부코나졸(tebuconazole)이 106종, 프로클로라즈(prochloraz)가 11종이다(Rural Development Administration, 2024). 페닐피리디아민(phenylpyridinamines)계열에 속하는 플루아지남은 식물 병원성 곰팡이의 미토콘드리아에서 산화적 인산화를 저해함으로써 에너지 생성 효율을 낮추어 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Vitoratos, 2014). 이러한 화학 살균제의 광범위한 사용은 식물병 관리 및 방제에는 효과적이었으나, 동시에 살균제 저항성 균주 출현이라는 새로운 문제를 야기했다(Beever et al., 1989; Raposo et al., 2000). 최근까지 Colletotrichum spp. 균주에서도 살균제 저항성이 보고되었으며, 특히 methyl-benzimidazole carbamates, 퀴논 외부 저해제(QoI), 그리고 탈메틸화(demethylation) 저해제에 대한 저항성이 확인되었다(Cortaga et al., 2023). 살균제 저항성 균주의 출현 원인 중 하나는 특정 생화학적 기작에 영향을 주는 살균제를 빈번하게 사용함으로써 저항성 선택압을 증가시켰기 때문이다(Cortaga et al., 2023; Genet et al., 2006). 한편, Zhang et al. (2017) 은 고온과 아졸계 성분이 많은 환경에서 열충격으로 자낭포자 발아가 유도되며, 이는 유전자 재조합에 대한 선택압을 증가시키는 결과를 보여주었다. 이는 살균제 저항성 균주 발현에 살균제 사용량뿐 아니라 기온과 같은 환경요인도 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 실제로 다양한 연구 결과로부터 포장에서의 기상환경 혹은 식물병의 발병률 정도가 살균제 저항성 균주의 발생정도에 영향을 미칠 수 있음을 추정할 수 있다(Brent and Hollomon, 1998; Hahn, 2014; Salazar-Hamm and Torres-Cruz, 2024; Van Rhijn and Bromley, 2021). 따라서, 본 연구에서는 데이터 기반 혼합효과모델(mixed effect model)을 활용하여 살균제 사용량과 기상학적 발병 위험도가 고추 탄저병균의 플루아지남 저항성 발생 정도에 미치는 영향을 구명하고자 한다.

재료 및 방법

병원균의 동정

고추탄저병균의 동정을 위해서 Table 1과 같은 4개 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 수확한 탄저병균의 균사체를 2 mL tube에 glass beads (지름; 0.1 mm)와 함께 넣어 -70^oC에서 12시간 이상 동결 건조하고 bead beater(bullet blender, NEXTADVANCE, USA)에서 마쇄하였다. Exgene Plant SV kit (Exgene^TM Plant SV, GENEALL BIOTECHNOLOGY, KOREA)를 이용하여 마쇄한 균사체에서 gDNA를 추출한 후, -20^oC에서 보관하며 실험에 사용하였다. 추출한 gDNA는 nano drop (OPTIAEN NanoQ, KLAB, KOREA)를 사용해 순도와 농도를 확인하였고, 모든 gDNA는 50 ng/mL로 희석하여 실험에 이용하였다. 유전자증폭을 위하여 희석된 gDNA 2 μL, EzPCRTM 5x PCR Master Mix 4 μL, 각각의 primer 1 μL, 멸균증류수 12 μL를 혼합해 총 20 μL의 PCR 반응액을 준비하였다. 각 유전자의 영역을 증폭하기 위한 반응 조건은 94^oC에서 5분간 pre-denaturation을 수행한 뒤, 94^oC에서 1분간의 denaturation 단계, 1분간의 annealing 단계, 72^oC에서 1분간의 extension 단계를 총 35회 반복하였고, 72^oC에서 7분간의 final extension 단계를 거친 뒤 반응을 종료하였다. Annealing 온도는 각각의 primer마다 달랐으며, ACT 61^oC, CHS-1 58^oC, GAPDH 56^oC, ITS는 55^oC로 실시하였다. PCR 산물의 확인은 ITS영역의 유전자 증폭 시와 동일하였으며, Expin^TM PCR SV kit (Expin^TM PCR SV kit, GENEALL BIOTECHNOLOGY, KOREA)를 사용하여 정제한 후, Macrogen (Daejen, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 분석한 염기서열을 가지고 MEGA X v. 11.0.10로 Construct/Test Maximum Likelihood tree로 다중 유전자 계통 분석을 실시하여 병원균을 동정하였다.

Table 1.

Primers used in the experiment to amplify the gene of Colletotrichum sp.

결과 및 고찰

데이터의 공간 분포 조사

2022년과 2023년에 걸쳐 전국에서 채집된 균주들에 대해서 저농도(0.1 μg/mL) 플루아지남에서의 균사 생장 억제율(GIR)을 지역(시군구) 단위로 평균을 내어 조사하였다. 2022년에는 정선, 예천 등에서 채집된 균주들이 30% 미만의 억제율을 보였고, 안동, 진안, 음성에서 채집한 균주들이 50% 초과의 억제율을 보였다(Fig. 1A). 한편, 2023년에는 고창, 정읍, 임실, 괴산 등에서 20% 미만의 낮은 억제율을 보였고, 의왕, 보은, 평창, 영양 등에서는 55% 초과의 높은 억제율을 보였다(Fig. 1D). 결과적으로 2년간 채집한 균주들의 억제율은 높은 억제율부터 낮은 억제율까지 다양한 분포를 보이는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 저농도의 플루아지남에서 균주 별 살균제에 대한 저항성 정도가 다르다는 사실을 도출하였다. 또한, 전국에서 채집한 균주들 중 약 절반의 균주들이 50% 이상의 억제율을 보이고 있음을 확인하였으므로 저농도 살균제에서의 균사 생장 억제율에 관한 모델 제작이 가능할 것이라고 판단하였다.

Fig. 1.

Spatial distribution of Growth Inhibition Ratio (GIR), Disease Risk Score (DRS), and Fungicide Usage Amount (FUA). (A), (B), and (C) represent data from 2022, while (D), (E), and (F) show data from 2023. (A) and (D) represent GIR data, (B) and (E) show DRS data, and (C) and (F) represent FUA data. The maps display mean values for each variable at the district (si-gun-gu) level. District not surveyed are shown in light gray.

한편, 모델을 활용해 추정한 고추 탄저병 발병 위험도(DRS)는 2022년 영월, 진안 등에서 50 미만의 낮은 수치를 보였고, 진천, 정선, 단양, 파주 등에서는 100초과의 높은 수치를 보였다(Fig. 1B). 2023년의 경우 제천, 안동 등에서는 40 이하의 낮은 수치를 보였고, 곡성, 순천, 부여, 태안 등에서는 100 이상의 높은 수치를 보였다(Fig. 1E).

2022년 농가의 단위 면적 당 사용된 플루아지남의 유효성분량(FUA)은 양평과 충주 지역 외 다른 지역에서는 0.1 kg/ha(또는 L/ha) 미만으로 추정되었다(Fig. 1C). 반면 2023년에는 총 6개 지역에서 0.1 kg/ha(또는 L/ha) 초과의 플루아지남이 사용된 것으로 보였고, 그 중 밀양, 안성, 포천 등의 지역은 0.3 kg/ha(또는 L/ha) 이상이 사용된 것으로 추정되었다(Fig. 1F).

GIR과 DRS 및 FUA와의 관계 분석

저농도의 플루아지남에서의 GIR와 FUA의 관계를 Pearson 상관관계 분석을 통해 분석하였다. 분석 결과, FUA와 GIR의 상관관계는 0.1로 상관관계가 없었다(Fig. 2A). DRS과 GIR 간 상관관계 또한 -0.04로 서로 간 상관관계가 없음을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 이러한 낮은 상관관계가 나온이유 중 하나는 수집한 데이터에 연구에서 고려하지 못하고 있는 노이즈가 존재하기 때문으로 생각되어진다.

Fig. 2.

Analysis of the relationships between GIR and FUA, and GIR and DRS. (A) shows the relationship between GIR and FUA, while (B) shows the relationship between GIR and DRS using scatter plots. The red lines represent the regression equations for the two variables. r indicates the Pearson correlation coefficient.

혼합효과모델 개발 및 모델 적합도 평가

본 연구에서 활용한 균주 및 데이터는 국내 전국에서 확보한 것으로 연구에서 고려하지 못하는 지역 특이적인 효과가 존재할 수 있다고 판단하였다. 다양한 지역에 따른 효과를 추가로 고려하기 위하여 혼합효과모델을 분석에 활용하였다. 만들어진 모델의 적합도(goodness of fit)는 48% 정도로 준수한 성능을 보이는 것을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3.

Goodness of Fit for the developed mixed-effect model. The x-axis represents the predicted GIR values from the model, while the y-axis indicates the observed GIR values. The red line represents the 1:1 line (y = x). The model’s performance was evaluated using the coefficient of determination (R2).

모델을 활용한 변수 간 관계 분석

개발된 모델을 활용하여 변수간 관계를 분석한 결과, 고추 탄저병 발병 정도(DRS)와 단위 면적 당 사용된 플루아지남의 유효성분량(FUA)은 독립적으로 균사 생장 억제율(GIR)에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Table 2). 하지만, DRS와 FUA의 상호작용(Interaction)은 GIR에 유의미한 양의 영향을 미치는 것을 확인하였다(Table 2). 균사 생장 억제율(GIR)과 살균제 내성과는 음의 관계를 가지므로, 살균제 내성은 DRS과 FUA의 상호작용과 음의 관계를 가질 것으로 생각되어진다. 즉, 고추 탄저병 발병률이 낮았을 때 살균제 사용량이 증가한다면 저농도에 대한 살균제 내성 균주 발생 가능성이 높아질 수 있다고 해석할 수 있다. 또한, 고추 탄저병 발병률이 낮았을 때 살균제 사용량이 감소한다면 살균제 내성 균주 발생 가능성도 같이 낮아질 수 있음을 시사한다. 흥미로운 점은 살균제 사용량이 높더라도 고추 탄저병 발병률이 높다면 살균제 내성 균주 발생 비율이 낮아질 수도 있다는 점이다. 실제로 본 연구에서 조사된 데이터에 의하면, 2023년 안성의 살균제 사용량은 2년간 조사된 지점 중 2번째로 많은 량의 살균제가 살포되었지만 발병률이 매우 높았고 균사 생장 억제율은 50% 이상의 높은 억제율을 보이며 낮은 살균제 내성을 보였다.

Table 2.

Summary of the developed mixed-effects model

결 론

플루아지남이 작용하는 부위는 multisite이므로, 단일 site인 다른 살균제 등에 비교하였을 때 상대적으로 저항성 발생 가능성이 낮다고 여겨진다(Gisi and Sierotzki, 2008). 그럼에도 불구하고 일부 식물 병원균에서는 플루아지남에 대한 저항성 균주가 드물게 보고된 바 있다(Leroux et al., 2007; Li et al., 2020). 지금까지 국내 고추 탄저병원균 중 플루아지남 저항성 균주는 없는 것으로 알려져 있다. 하지만 우리는 저농도의 플루아지남에서 균주 별로 균사 생장억제율에 차이가 발생하기 시작되었다는 것을 알 수 있었으며, 이에 플루아지남 내성 균주 발생 기작을 혼합효과모델을 활용하여 이해하고자 하였다. 모델을 활용한 분석 결과, 저농도에 대한 플루아지남 내성 균주는 살균제 사용량과 탄저병 발병 정도의 복합적인 영향을 받는 것으로 나타났다.

일반적으로 살균제 사용량은 저항성 균주 비율을 높이는 것으로 알려져 있다(Cortaga et al., 2023). 그러나 본 연구에서 제시한 모델은 이러한 생태적 특성을 반영하지 못하고 있는데(Table 2), 이러한 결과가 도출된 원인 중 하나는 본 연구에서 활용되고 있는 데이터의 한계로 생각된다. 연구에 활용된 살균제 사용량 데이터는 샘플이 채집된 지점 특이적인 데이터가 아닌 더 큰 범위(시군구 단위)에서 조사된 데이터이므로 지점 특이적인 미세한 변동을 모두 반영하기에 한계가 있었을 것으로 생각되어진다.

본 연구는 엄밀하게 통제된 실험 조건에서 수행된 연구가 아닌 관측 데이터에 기반한 연구이지만, 이러한 연구는 경제학 및 생태학 등 다양한 분야에서 독립변수와 종속변수의 관계를 파악할 때 널리 사용되는 방식이다(Jeong et al., 2014; Jiménez et al., 2016; Shah et al., 2019). 나아가 고추탄저병균의 저항성 발생에 탄저병 발병과 살균제 사용량이 상호작용하여 영향을 미칠 수도 있다는 새로운 시각을 제시하였다는 점에서 의의가 있다. 본 연구를 기반으로 통제된 실험 등을 통한 추가적인 연구가 진행되어 이 관계에 대해 명확히 구명된다면, 살균제 저항성 균주 발생 방지를 위한 전략 수립에 활용 가치가 있을 것으로 사료된다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.

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