Allium 속 작물의 시료 조제 온도 조절에 따른 LC-MS/MS의 매질효과

서 론

Allium 속 작물은 약 500여 종으로 구성되며, 대표적으로 양파(Allium cepa L.), 파(Allium fistulosum L.), 마늘(Allium satWivum L.) 등이 포함된다. 이들 작물은 풍부한 영양성분과 기능성 물질을 함유하고 있어 전 세계적으로 널리 소비되며, 다양한 생리활성 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있다 (Choi et al., 2024; Hawng et al., 2021; Kim et al., 1999; Lee et al., 2009; Song et al., 2009). 각 종(species)마다 함유된 화합물의 양과 종류는 차이가 있으나, 공통적으로 황 원자를 포함하고 있음이 밝혀졌다(Kim et al., 1999). 이러한 황화합물은 강한 생리활성을 가지며, 항균성, 항암성, 항 혈전성, 항산화성과 같은 다양한 기능성을 통해 건강기능식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Choi et al., 2007; Kim et al., 1999; Song et al., 2009). Allium 속 작물의 독특한향은 황 함유 휘발성 물질에서 기인하며, 절단 과정에서 세포가 파괴됨에 따라 다양한 황화합물이 생성된다. 특히, allin 및 isoallin과 같은 황화합물은 분석 과정에서 간섭물질로 작용할 가능성이 높다(Do et al., 2015; Hawng et al., 2021; Park et al., 2010; Song et al., 2009). 마쇄 과정에서 세포 내 존재하는 allinase 효소의 활성에 의해 allicin이 thiosulfinates로 전환되며, 이들은 화학적으로 매우 불안정하여 분자 구조의 재배열을 거쳐 allyl disulfide, diallyl sulfide, diallyl disulfide, dimethyl sulfide 등의 다양한 황화합물로 분해된다(Block, 1992; Do et al., 2015; Lanzotti, 2006; Park et al., 2010). 이러한 황화합물들은 농약 성분과 유사한 극성을 가지며, 구조적으로도 비슷하기 때문에 Allium 속 작물 분석 시 농약 성분과 간섭물질이 중첩되거나 근접하여 분석 과정에서 방해 요소로 작용할 가능성이 크다(Do et al., 2015; Michael et al., 2007; Park et al., 2010). 이에 따라, 정확하고 신뢰성 높은 농약 분석을 위해 황화합물과 유사한 매질의 간섭을 최소화할 수 있는 보다 효과적인 방안 마련이 필요하다.

잔류농약 분석 시 Allium 속 작물에서 발생하는 간섭 물질을 제거하기 위한 다양한 연구가 진행되어왔다. Park et al., (2009)은 florisil이 포함된 SPE cartridge에 AgNO₃를 처리하여 은이온을 흡착시킨 후, 황화합물과 유사한 간섭 물질을 효과적으로 제거하는 방법을 보고하였다(Park et al., 2010). Kruve and Leito (2013)는 LC-MS/MS 분석 시 마늘과 양파에서 발생하는 매질효과(matrix effect)를 최소화하기 위해 매질 보정법, 희석법, 표준물질 첨가법, 내부표준물질 첨가법, post-column법을 비교 분석하여 가장 적절한 방법을 제시하고자 하였다(Kruve and Leito, 2013). 또한, Kwon (2017)은 분쇄 조건과 d-SPE 중 PSA를 활용하여 양파와 마늘의 잔존 불순물 및 매질효과를 비교 분석한 연구를 수행하였다 (Kwon, 2017). 그러나 기존 정제방법들은 cartridge 코팅 과정에서 추가적인 시간과 비용이 소요될 수 있으며, 다성분 분석 시 특정 성분이 정제 sorbent에 흡착되어 분석 효율이 저하될 가능성이 있다. 또한 Allium 속 작물의 간섭 물질 제거를 위해 지속적인 정제 단계를 거칠 경우, 분석 대상 성분의 회수율이 낮아질 우려가 있다. 따라서, Allium 속 작물에 간섭 물질로 인식될 수 있는 황화합물로 인한 문제를 해결하기 위해 시료 조제 과정을 살펴볼 필요가 있다. 특히, 절단 및 마쇄 과정에서 효소 활성으로 인해 생성되는 황화합물의 변화를 고려하여, 시료 조제 시 온도 변화를 조절함으로써 생성물질의 변화 양상을 분석하는 것이 중요하다(Schwimmer et al., 1963; Wafler et al., 1994).

이에 본 연구에서는 Allium 속 작물(양파, 대파, 마늘)에 등록된 농약인 dimethoate, etofenprox, metconazole, pydiflumetofen을 대상으로 시료 조제 과정에서 온도 변화가 매질효과에 미치는 영향을 평가하고자 한다. 이를 통해, 온도 조절이 Allium속 작물에서 발생하는 황화합물의 영향을 줄이고, 농약 성분의 정밀한 분석을 가능하게 하는지 검토하여 신뢰성 높은 분석법 확립을 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.

재료 및 방법

LC-MS/MS 기기분석 조건

분석기기는 LC-MS/MS를 사용하였으며, LC는 Shimadzu UHPLC system Nexera 40 series (Kyoto, Japan), MS/MS는 AB SCIEX Triple QuadTM 5500+ (SCIEX, Redwood City, CA, USA)사를 사용하였다. 기기분석에 사용된 컬럼은 Kinetex C18 (1.7 μm, 100 × 2.1 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)이었으며, 이동상은 0 .1% formic ac id와 5 mM ammonium formate가 포함된 water와 methanol을 사용하였다. Allium 속 작물의 간섭 신호를 확인하기 위해 full sc an mode로 분석을 수행하였으며, 해당 분석 조건은 Table 1과 같다. 분석 대상 농약은 이온화 방식으로 ESI (Electrospray ionization)를 적용하였으며, positive mode로 최적화된 MRM (Multiple reaction monitoring) 조건을 확립하였다. 확립된 기기분석 조건은 Table 2와 같다.

Table 1

LC-MS/MS full scan conditions for detecting interference signals in Allium Crops

Table 2

LC-MS/MS condition for dimethoate, etofenprox, metconazole and pydiflumetofen

결과 및 고찰

시료 조제 방법에 따른 작물별 온도 측정 결과

시료 조제 방법에 따른 작물별 온도를 측정하기 위해 22~24^oC로 유지된 동일한 실험실에서 실온, 드라이아이스 첨가, 초저온 냉동고 동결의 세 가지 조건으로 시료를 준비하였다. 이후, 마쇄 직후 즉시 휴대용 디지털 핀 온도계를 이용하여 시료의 온도를 확인하였다. 실온 조건에서 측정된 온도 범위는 양파 8.8~10.6^oC, 대파 20.6 ~ 21.3^oC, 마늘 13.7 ~ 15.0^oC였으며, 평균 온도는 양파 9.7^oC, 대파 20.7^oC, 마늘 14.3^oC로 나타났다. 드라이아이스를 첨가한 시료는 양파 −43.7 ~ −39.5^oC, 대파 −29.9 ~ −26.8^oC, 마늘 −41.2 ~ −30.3^oC였으며, 평균 온도는 양파 −41.6^oC, 대파 −28.2^oC, 마늘 −37.5^oC였다. 초저온 냉동 상태의 시료는 양파 −21.7 ~ −20.5^oC, 대파 −11.6 ~ −10.0^oC, 마늘 −16.3 ~ −13.7^oC의 온도 범위를 보였으며, 평균 온도는 양파 −21.1^oC, 대파 −10.7^oC, 마늘 −15.0^oC로 확인되었다(Fig. 1). 동일한 시료 조제 방법을 적용하였음에도 불구하고 작물별로 측정된 온도 차이가 존재하였다. 이는 양파와 마늘의 경우 조직이 부드럽고 수분 함량이 높아 쉽게 마쇄되는 반면, 대파는 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스 함량이 양파와 마늘보다 높아 조직 강도가 강해 기계적 가공 시 마찰열이 증가하여 온도가 더 높게 측정된 것으로 판단된다(Choi et al., 2022; Ivanova et al., 2024; Kim et al., 2023).

Fig. 1.

Temperature by sample preparation method

시료 조제 과정과 전처리 방법에 따른 크로마토그램 변화

시료 조제 과정 및 전처리 방법은 분석 대상 성분의 회수율과 정량적 신뢰성에 영향을 미치는 중요한 요소이며, 특히 매질 간섭(matrix interference)을 효과적으로 제거하는 데 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 양파, 대파, 마늘을 대상으로 시료 조제 과정과 전처리 방법이 미치는 영향을 확인하고자 full scan mode로 100~500 m/z의 범위에서 각각의 농약이 처리되지 않은 크로마토그램을 확인하였다(Fig. 2). 그 결과 모든 시료에서 1.0~1.5분 및 2.0~4.0분 사이에 매질 간섭 신호가 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 초반의 검출된 매질 간섭 신호는 추출 과정에서 가장 뚜렷하게 나타났고, 분배 및 정제 과정 이후에는 감소하는 경향을 보였다. 이는 적절하게 전처리한 시료의 경우 시료 내 불순물이 효과적으로 제거된다는 것을 보여 주었다. 두 번째로 검출된 2.0∼4.0분 사이 신호는 시료 조제 과정에 따라 차이를 보였는데, 실온 시료의 경우 가장 높게 나타났으며, 드라이아이스 첨가한 시료 및 동결한 시료에서는 상대적으로 감소하는 경향을 보였다. 이러한 경향은 해당 신호가 Allium 속 작물이 마쇄되는 과정에서 조직 파괴로 인해 활성화된 효소 반응에 의해 생성된 황화합물 (sulfur-containing compounds)과 유사한 간섭 물질 또는 Allium 속 작물로부터 추출된 미지의 물질로 추정된다(Mu et al., 2024; Ramirez et al., 2017). 본 연구에서는 저온 보관된 시료에서 해당 신호가 감소하는 것은 낮은 온도에서 효소와 기질 간 분자 충돌 빈도가 감소하고 반응 속도가 저하됨에 따라 효소 활성화가 제한되어 황화합물과 유사한 물질의 생성이 억제된 결과로 추측된다(Coolong, 2000; Mu et al., 2024). 따라서 Allium 속 작물의 시료 조제 시 저온 환경을 유지하는 것이 중요하며, 적절한 분배 및 정제 과정이 매질 간섭을 효과적으로 감소시키는 방법이 될 것으로 판단된다.

Fig. 2.

Chromatograms of (A) onion, (B) green onion and (C) garlic according to sample preparation methods.

시료 조제 과정과 전처리 방법에 따른 매질효과 산출 및 변화

양파, 대파, 마늘에서 농약 dimethoate, etofenprox, metconazole, pydiflumetofen의 매질효과를 산출하기 위해 용매 표준검량선과 매질표준용액검량선의 직선성을 확인하였다. 시료 조제 과정과 전처리 방법에 따라 3회 반복 실험을 수행하고, 실험 결과의 평균값과 변동값을 산출하였다. LC-MS/MS의 경우 매질 입자와 분석 대상 농약 성분 간의 이온화 경쟁이 발생하여, 분석 성분의 감응 신호가 감소하는 이온 억제 현상(ion suppression)이 주로 나타나는 것으로 보고되었다 (Côté et al., 2009; King et al., 2000). 본 연구에서도 양파, 대파, 마늘에서 분석된 4종의 농약 대부분이 이온 억제 현상을 보였으며, 일부 성분의 경우 이온 상승 현상을 보였다. 이 때의 농약 4종의 매질효과 변동값의 최대 범위를 산출한 결과, 양파는 –12 ~ 0의 범위를 보였으며, 대파는 –15 ~ 0의 범위를 보였고, 마늘은 0~17의 차이를 나타냈다. 3회 반복 실험 결과, 대부분 성분에서 매질효과가 일관되게 나타났으나, 일부 성분에서는 반복 실험에서도 이온 상승 현상 확인되어 변동 값에서 차이가 발생하였다. 또한, 매질효과의 평균값을 분석한 결과, 실온에서 매질효과가 가장 크게 나타났고 낮은 온도에서는 매질효과가 감소하는 경향을 확인하였다(Fig. 3). 또한 동일한 시료 조제 과정에서 전처리 방법(추출, 분배, 정제)에 따른 매질효과를 비교한 결과, 전처리 방법과 상관 없이 유사한 경향을 보였다. 시료 조제 시 온도에 따른 매질 효과를 비교한 결과, 실온에서 매질효과가 가장 크게 나타난 작물은 대파, 양파, 마늘이었다. 특히, 대파의 경우 잎 조직의 강도가 높아 마쇄 과정에서 마찰열이 증가하고, 이로 인해 온도가 상승하면서 효소가 활성화되어 황화합물과 유사한 물질의 생성이 증가하여 매질효과가 크게 나타난 것으로 추측된다(Schwimmer et al., 1963; Wafler et al., 1994). 반면, 드라이아이스를 첨가하거나 초저온에서 냉동한 시료의 경우 매질효과가 크게 감소하는 경향을 보였다. 이는 낮은 온도에서 효소 활성이 저하되어 황화합물과 유사한 물질의 생성이 억제되었기 때문으로 판단된다(Coolong, 2000). 농약별로 매질효과를 분석한 결과, 4종의 농약 중 모든 작물에서 dimethoate의 매질효과가 가장 크게 나타났다. 이는 크로마토그램에서 약 2.5분에 검출되는 매질 간섭 신호가 분석 대상 성분과 동일한 머무름 시간에 용출되어 이온화 과정에서 경쟁으로 인해 억제 현상으로 판단된다(Rodrigues et al., 2010). 실제 농약 4성분의 머무름 시간은 dimethoate 2.46분, metconazole 2.91분, pydiflumetofen 2.95분, etofenprox 3.76분으로 이 중 dimethoate가 매질 간섭 신호와 가장 근접한 머무름 시간에 위치하여 매질 영향을 가장 크게 받은 것으로 판단된다.

Fig. 3.

Matrix effect of four pesticides in Allium species depending on pretreatment and sample preparation temperature conditions. (A) onion, (B) green onion, (C) garlic. *ULT: Ultra-low temperature

Acknowledgments

본 연구는 국립농업과학원 기관고유 연구사업(과제번호: PJ015920)에 의해 수행되었습니다. 이에 감사드립니다.

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