HPLC를 이용한 아족시스트로빈과 이미다클로프리드, 메타벤즈티아주론의 토양 잔류분석 숙련도시험

시험시료 제조

시험 표준물질 제조와 균질도 등의 확인과정은 Kim 등(2013)의 방법에 따랐다. 국립농업과학원 시험포장에서 채취한 후 5년간 습토상태로 보관하여 농약의 잔류수준이 매우 낮을 것으로 기대되는 밭토양으로 시험시료를 조제하였다. 토양을 음지에서 말린 다음 2 mm체를 통과시켜 사용하였으며 시험물질 제조에 약 35 kg의 토양이 사용되었다.

시험시료를 조제하기 전에 시험농약의 목표 잔류수준을 결정하였는데 잔류수준은 평가용과 평가수준의 50-150%인 확인용으로 구분하였다. 토양시료를 2개 군으로 구분하여 1군(S1)에는 평가수준으로 2종 농약을 처리하고, 나머지 1종 농약은 확인수준으로 처리하였고. 2군(S2)은 평가수준 1종과 확인수준 2종의 농약을 처리하였다. S1은 3개 조합, S2는 6개 조합이었다. Azoxystrobin과 imidacloprid, methabenzthiazuron을 acetonitrile에 녹여 각각의 1000 mg/L 표준용액을 만들고, 처리조합별로 3종 농약을 적절한 비율로 혼합하고 acetone으로 희석하여 각각의 성분농도가 10-30 mg/L이 되도록 9종의 혼합표준용액을 준비하였다.

토양 1 kg을 스테인리스 스틸 재질 사각용기에 고르게 펴고 혼합표준용액 10 mL를 홀 피펫을 사용하여 점적한 다음 용매가 날아간 후 시약숟갈로 잘 저어 혼합하였다. 이 작업을 반복하여 필요량만큼씩 준비한 토양을 각각의 농도조합별로 밀폐용기에 합하여 고르게 혼합하였다. 제조한 토양시료를 200 g씩 폴리에틸렌 재질 지퍼백에 담아 포장하였는데 제조한 토양시료 전체량은 S1과 S2 각각 12 kg이었다. 제조한 토양시료는 -20°C의 냉동고에 시료배부 전까지 보관하였다.

시험시료의 균질도와 안정성

시험시료의 균질도를 확인하기 위하여 냉동고에 저장한 시료(S1)를 조합별로 5개씩 임의로 선택하고(대상농약의 평가수준별로는 10개의 시료가 됨), 각각의 시료로부터 25 g씩 2반복으로 분석시료를 취하였다(Analytical Methods Committee, 2009). 전처리와 기기분석과정은 난수를 활용하여 임의의 순서대로 실시하였다. 정량은 평가수준 목표농도에 맞춘 1-point 표준농도로 계산하였다. 통계평가는 IUPAC와 ISO, AOAC에서 발표한 International Harmonized Protocol (Thompson et al., 2006)에 따라서 다음과 같은 절차로 수행하였다. 토양시료 분석결과에 대하여 Cochran's test를 실시하여 분석 이상치를 확인하였다. 토양시료의 분석반복의 차(D)와 차의 제곱(D²), 합(S)을 계산하고, Cochran's test의 통계량인 차의 제곱합(ΣD²)에 대한 차의 제곱의 최대값(Max (D²))의 비를 구하고 Cochran's test의 통계량 표에서 시료 수(m)에 해당하는 95% 또는 99% 신뢰수준에서의 기준값과 비교하여 이상치 여부를 판정하였다. 이상치 시료를 제외한 후 다음과 같이 균질도 판정을 위한 절차를 실시하였다(Analytical Methods Committee, 2004a). 분석편차의 제곱(S_an² = ΣD²/2 m)과 분석반복 차의 합의 분산(V^S = Σ(Si-Mean(S))²/(m-1))을 구하여 분석편차를 제외한 시료편차(S_sam)를 시료편차의 제곱(S_sam² = (V_S/2-S_an²)/2)으로 계산하였다. 시료편차의 제곱이 음수인 경우에는 0으로 처리하였다. 균질도 판정의 기준값(c = F₁σ_all² + F₂S_an²)은 허용 가능한 시료의 변이수준(σ_all² = (0.3σ_p)²)과 분석편차의 곱과 시료 수(m)에 대한 각각의 계수로부터 계산하였다. 숙련도평가에 대한 표준편차(σ_p)는 잔류시험 기준의 변이계수 20%를 균질도 판정에 사용된 전체 토양시료 분석값의 평균에 곱하여 계산하였다. 시료편차의 제곱값이 균질도 기준값보다 작으면 균질한 것으로 판정하였다.

확인용 시료(S2)에 대한 균질도 시험도 동일하게 수행하였다. 그리고 시료배포 과정에서의 안정성은 토양시료를 실온에서 일정기간 방치한 후 조합별로 4반복 이상이 되도록 분석하여 확인하였다.

잔류분석

토양 25 g을 300 mL Erlenmeyer flask에 넣고 0.2 NNH₄Cl용액 30 mL를 가하여 토양을 팽윤시킨 다음, acetone 80 mL를 가하고 1시간 동안 진탕하였다. 추출액을 흡인여 과하고 acetone 약 50 mL를 사용하여 토양잔사와 용기를 씻어 여과액과 합하였다. 추출액을 1 L 분액여두에 옮기고 포화식염수 50 mL과 탈이온수 450 mL를 넣어준 후, dichloromethane 50 mL로 3회 분배하여 추출하였다. 유기용매 층을 무수 황산나트륨층에 통과시켜 수분을 제거하고 40°C에서 감압농축한 후 dichloromethane 5 mL로 용해하였다. Dichloromethane 10 mL로 활성화시킨 Florisil (1 g) cartridge에 추출액 2 mL를 가한 다음 dichloromethane 10 mL로 용출시켜 버리고 15% ethylacetate in dichloromethane 용액 10 mL로 azoxystrobin과 methabenzthiazuron을 용출시켰다. 이어 4% acetone in dichloromethane 10 mL를 흘려버리고 45% acetone in dichloromethane 15 mL로 imidacloprid를 용출시켰다. 각각의 용출액을 감압상태에서 농축하여 용매를 완전히 날려 보내고 acetonitrile 2 mL로 재용해하여 HPLC로 분석하였다.

HPLC 분석에는 diode-array detector (DAD)와 자동시료 주입기가 장착된 Hewlett Packard사의 HP 1100 액체크로마토그래프를 사용하였다. 고정상으로는 Merck사의 Purospher STAR RP-18 endcapped (4.0 mm i.d. × 250 mm, 5 μm spherical) 역상 분리관을 사용하였으며 30°C로 유지하였다. Azoxystrobin과 methabenzthiazuron 분석은 acetonitrile/ deionized water 60/40 (v/v), imidacloprid 분석에는 acetonitrile/ deionized water 40/60 (v/v) 이동상을 분당 1 mL의 속도로 흘려주었다. 검출파장은 azoxystrobin 230 nm, imidacloprid와 methabenzthiazuron은 270 nm이었고 시료주입량은 20 μL이었다.

숙련도시험 실시

숙련도시험은 2012년 11월에 실시하였는데 시험참여기관 각각에게 3성분의 농약이 평가수준과 확인수준으로 처리된 토양시료 2점과 무처리 토양 1점 및 3종 농약의 표준용액(농도 10 mg/L)을 제공하였다. 시료 S1의 목표처리농도는 azoxystrobin-imidacloprid-methabenzthiazuron 순으로 0.2-0.2-0.1 mg/kg, 0.2-0.1-0.2 mg/kg 및 0.1-0.2-0.2 mg/kg의 3조합이었고, 시료 S2의 처리농도는 azoxystrobin-imidaclopridmethabenzthiazuron 순으로 0.1-0.3-0.2 mg/kg, 0.3-0.1-0.2 mg/kg, 0.1-0.2-0.3 mg/kg, 0.3-0.2-0.1 mg/kg, 0.2-0.1-0.3 mg/kg 및 0.2-0.3-0.1 mg/kg의 6조합이었다. 시험기관별 배부시료 중 목표처리농도는 Appendix 1과 같았다. 토양시료는 2012년 11월 7일 숙련도시험 설명회를 통하여 참가기관에게 배포되었고 결과의 제출 마감기한은 2012년 11월 30일이었다. 시험시료에서 대상농약성분의 정량을 방해하는 성분의 확인과 회수율시험에 사용하고, 필요한 경우 matrixmatched 표준용액을 사용할 수 있도록 무처리 토양시료가 제공되었다.

분석결과에 대한 숙련도는 목표 표준편차(σ_p)에 대한 참가기관의 분석농도(x)와 처리농도 설정값(X^)의 차의 비인 Z-score로 평가하였다. 이상치를 제거하지 않고 전체 참가기관 분석농도의 중앙값을 설정값으로 활용하였고 목표 표준편차는 합목적(fitness-for purpose) 표준편차(Analytical Methods Committee, 2002 and 2005; Thompson, 2000)를 사용하여 토양잔류시험의 변이계수 허용한계 20%를 적용하여 계산하였다. Horwitz 식으로 구한 목표 표준편차를 적용했을 때와도 비교하였다(Analytical Methods Committee, 2004b and 2005). Z-score의 값은 -2 ≤ Z ≤ 2는 적합, -3 ≤ Z < -2 또는 2 < Z ≤ 3은 의심, Z < -3 또는 Z > 3은 부적합으로 구분된다. 전체농약에 대한 종합평가는 개별농약의 Z-score의 절대값의 평균으로 하였다.

토양시료의 균질도

Azoxystrobin의 분석 회수율과 분석반복의 차와 합 및 차의 제곱을 Table 1에 나타내었다. Cochran's test의 통계량은 0.230으로 10개 시료에 대한 95% 유의수준에서의 임계값 0.602보다 작아 이상치는 없는 것으로 판정되었다. 따라서 토양시료 10쌍의 분석성적 모두를 균질도 판정절차에 이용하였다. 시료편차의 제곱은 4.4로 산출되었고 균질도 판정 기준값은 32.2로 계산되어 azoxystrobin 처리 토양은 숙련도 시험 시료로 적합한 것으로 판정되었다.

Table 1.

Duplicated results for 10 distribution units of soil analyzed for azoxystrobin (recovery, %), together with some intermediate stages of the ANOVA calculation

Imidacloprid의 분석 회수율과 분석반복의 차와 합 및 차의 제곱을 Table 2에 나타내었다. Cochran's test의 통계량은 0.302로 10개 시료에 대한 95% 유의수준에서의 임계값 0.602보다 작아 이상치는 없는 것으로 판정되었다. 따라서 토양시료 10쌍의 분석성적 모두를 균질도 판정절차에 이용하였다. 시료편차의 제곱은 -4.8로 산출되어 0으로 처리하였고 균질도 판정 기준값은 39.2로 계산되어 imidacloprid 처리 토양은 숙련도시험 시료로 적합한 것으로 판정되었다.

Table 2.

Duplicated results for 10 distribution units of soil analyzed for imidacloprid (recovery, %), together with some intermediate stages of the ANOVA calculation

Methabenzthiazuron의 분석 회수율과 분석반복의 차와 합 및 차의 제곱을 Table 3에 나타내었다. Table 3에는 나타내지 않았지만 10개 시료에 대한 Cochran's test의 통계량은 0.795로 95% 유의수준에서의 임계값 0.602보다 크므로 분석반복의 차가 가장 큰 S1-117을 이상치로 판정하여 제외하고 다시 Cochran's test를 실시하였다. 토양시료 9개에 대한 Cochran's test의 통계량은 0.598로 95% 유의수준의 임계값 0.638보다 작아 더 이상의 이상치는 없는 것으로 판명되었다. 시료편차의 제곱은 7.6으로 산출되었고 균질도 판정 기준값은 48.3으로 계산되어 methabenzthiazuron 처리 토양도 숙련도시험 시료로 적합한 것으로 판정되었다.

Table 3.

Duplicated results for 10 distribution units of soil analyzed for methabenzthiazuron (recovery, %), together with some intermediate stages of the ANOVA calculation

확인용 시료의 경우도 Cochran's test를 통한 분석 이상치 확인과정에서 azoxystrobin과 methabenzthiazuron에서 분석 이상치가 발생하였으나 분석 이상치 1쌍을 제외한 결과 더 이상의 분석 이상치는 없었다. 시료의 균일도 평가에서도 시료편차의 제곱값이 잔류시험의 변이계수 허용한계인 20%뿐 아니라 10%를 적용하여 계산한 균일도 판정기준치보다도 작았다. 이로써 농약 3성분이 처리된 토양시료의 균질도가 숙련도시험에 적합함이 확인되었다.

토양시료의 안정성

실온에서 방치하였을 때의 농약성분의 안정성시험 결과를 아래에 균질도시험 성적과 비교하여 Table 4에 회수율로 나타내었다. Azoxystrobin과 imidacloprid는 실온에서 3일까지는 큰 변화가 없었다. Methabenzthiazuron은 3일 후에 초기량에 비하여 30% 이상 감소하여 시료의 분배와 운반과정에서 주의가 필요한 것으로 나타났다.

Table 4.

The evaluation of stability of pesticides in test soil sample during distribution of sample

숙련도 평가

시험결과를 제출한 48개 기관별 분석농도를 Appendix 2에 시험기관이 표현한 것과 동일한 유효숫자 형식으로 나타내었다. 이것을 다시 평가용 농도와 확인용 농도로 구분하여 소수점 이하 3자리에서 반올림하여 Appendix 3에 나타내었는데 Excel 프로그램을 이용한 계산에서는 원래의 값으로 처리하였다. 평가용에 대한 분석결과를 요약하면 Table 5와 같다.

Table 5.

Statistic summarizing results reported for the assessment sample

일부 심각한 이상치가 있어 평균값이 처리농도에서 심하게 벗어났던 2011년 결과(Kim et al., 2013)에 비하여 비정상적으로 높거나 낮게 보고된 사례는 없었다. 중앙값을 사용하여 계산한 Horwitz의 상대표준편차가 20% 가량으로 나타나 변이계수 20%를 적용하는 것이 적절하다고 생각되었다.

평가용 수준 처리에 대한 분석결과로 Z-score를 계산한 결과는 Appendix 4의 우측에 나타내었고 성분별로 Fig. 1, 2, 3으로 나타내었으며 Table 6으로 요약하여 나타내었다. 처리농약별로는 전체 대상기관 48개소 중 46-48개 기관이 숙련도 평가결과 적합하였다. Methabenzthiazuron의 경우는 2개 기관의 Z-score 절대값이 2와 3 사이로 나타났고 imidacloprid의 경우는 2개 기관의 Z-score 절대값이 3을 초과하였다. 그러나 시험기관별 3종 농약의 Z-score의 절대값의 평균은 모든 기관이 2 미만으로 나타나 모든 기관의 숙련도가 적합한 것으로 평가되었다(Fig. 4). 각기 처리농도가 달라 직접비교가 곤란한 확인용의 경우는 처리농도를 기준으로 환산한 농도로 계산하여 Appendix 4의 좌측에 나타낸 Zscore도 평가용의 결과와 일치하는 것으로 나타났다. 특히 imidacloprid에 대한 Z-score가 -3 이하였던 두 기관은 확인용에서도 -3 이하의 값을 나타내었고, methabenzthiazuron에 대하여 Z-score가 2를 초과하는 두 기관 중 한 기관은 확인용에서도 2를 초과하는 값을 나타내었다.

Fig. 1.

Z-score for azoxystrobin in the assessment sample.

Fig. 2.

Z-score for imidacloprid in the assessment sample.

Fig. 3.

Z-score for methabenzthiazuron in the assessment sample.

Table 6.

Z-score for azoxystrobin, imidacloprid and methabenzthiazuron in the assessment sample

Fig. 4.

Z-score for all three pesticides in the assessment sample.