풋고추 농약다성분분석 정도관리용 분석표준물질 개발

대상농약성분 및 시약

풋고추는 마트에서 구입하여 분석표준물질에 해당하는 농약성분이 검출되지 않은 것을 확인하는 과정을 거친 후 사용하였다. 분석표준물질의 조제에 사용된 농약은 2014년 농산물의 국가잔류 조사결과(National Agricultural Products Quality Management Service (NAQS), 2015) 자료를 검토하여 농산물 내 검출빈도가 높은 상위 10종(Bifenthrin, Chlorfenapyr, Chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, Fenitrothion, Fenpropathrin, Iprobenfos, Isoprothionlane, Kresoxim-methyl, Procymidone)의 농약성분을 선정하였다. 각각의 농약 성분은 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다.

저장표준용액(stock solution)의 조제와 분석시료의 전처리에 사용한 유기용매acetone과 acetonitrile은 HPLC 등급으로 Burdick&Jackson (Muskegon, MI, USA)로부터 구입하여 사용하였고, QuEChERS법 추출을 위해 QuEChERS Extract Kit (magnesium sulfate; 98.5~101.5%, sodium chloride; ≥ 99.5%, sodium citrate; 99.9%, disodium citrate sesquihydrate; 99%)와 정제를 위해 사용된 QuEChERS dispersive SPE 2 mL (primary secondary amine(PSA), octadecysilane end-capped, magnesium sulfate; 98.5~101.5%)은 Agilent (Boblingen, Germany)로부터 구입하여 사용하였다.

농약다성분의 동시분석법 확립

10종의 농약 표준품을 acetone으로 용해하여 100 ppm 또는 1,000 ppm 농도의 stock solution을 만든 후, acetone을 사용하여 각 농약성분이 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 ppm이 되도록 혼합용액을 조제하였다. 조제된 혼합용액으로부터 약 2 mL을 취한 후, GC-ECD 또는 NPD에 주입하여 각 농약성분에 대한 검량선을 작성하였다. 분석한 농약의 검출 기명 분류는 Table 1과 같다.

Table 1.

Pesticides categorized with instrumental detectors for multi-residue analysis

회수율시험 농도는 분석표준물질과 동일한 농도가 되도록 풋고추 분말가루 5 g에 대상농약성분의 농도가 0.5 μg/g(bifenthrin, chlorfenapyr, lambda-cyhalothrin fenpropathrin, isoprothionlane, procymidone) 또는 1.0 μg/g (chlorpyrifos, fenitro thion, iprobenfos, kresoxim-methyl)이 되도록 처리한 후, 증류수 10 mL을 넣고 1시간 방치한 후, acetonitrile 10 mL과 ceramic homogenizer (Agilent Technologies)을 넣고 약 1분간 진탕하였다. 진탕한 시료는 원심분리기를 이용하여 4,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 상징액을 QuERChERS extraction kit (4 g MgSO₄, 1 g NaCl, 1 g sodium citrate tribasic dihydrate, 0.5 g sodium citrate dibasic sesquihydrate)에 적용하여 1분간 진탕 후, 3,000 rpm (4^oC)에서 5분 동안 원심분리하여 추출액과 시료층이 분리되도록 하였다. 상징액 7 mL을 취하여 QuERChERS d-SPE-5 mL kit (900 mg MgSO₄, 150 mg PSA, 150 mg C18E)을 넣고 1분간 진탕한 뒤, 3,000 rpm (4^oC)에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상징액 3 mL을 취하여 N₂ gas로 농축한 후, acetone 1.5 mL로 정용하였으며, 이 중 1 mL을 취하여 QuERChERS d-SPE-2 mL kit (150 mg MgSO₄, 25 mg PSA, 25 mg C18E)을 넣어 1분간 vortex mixer로 혼합하였다. 원심분리기로 12,000 rpm(4^oC)에서 5분간 원심분리 한 후, 상징액 0.5 mL과 acetone 0.5 mL을 혼합하고 PTFE 0.2 μm syringe filter로 여과하여 Table 2의 분석조건에 따라 3반복으로 수행하였다.

Table 2.

GC-ECD/NPD conditions for the analysis of 10 pesticide residues

분석표준물질의 조제

분석표준물질의 조제는 일정한 크기로 세절한 풋고추를 동결건조 한 후, 분쇄하여 미세한 분말가루 형태로 만들었다. 분쇄한 풋고추 분말가루 1 kg에 acetone으로 용해된 1,000 μg/mL 용액을 0.5 mL 및 1.0 mL을 처리하여 각 농약성분이 0.5 μg/g (Bifenthrin, Chlorfenapyr, Cyhalothrin-lambda, Fenpropathion, Isopro thionlane, Procymidone) 또는 1.0 μg/g(Chlorpyrifos, Fenitrothion, Iprobenfos, Kresoxim-methyl)이 되도록 처리하고 증류수 500 mL을 넣어 약 1시간 동안 혼합하였다. 초저온(-80^oC)에서 약 1일 동안 동결 시킨 후, 약 7일 동안 동결건조하여 수분을 제거하였다. Grinder로 30분 동안 분쇄하여 풋고추 분말시료 내에 10종의 농약성분이 균질하게 분포되도록 분석표준물질을 조제하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

Procedure for development of analytical reference material of a green-pepper.

균질성

균질성 시험을 위해 분석표준물질 50 g을 100 mL 갈색 bottle에 옮겨 담은 후, 무작위로 10개의 bottle를 선정한 후, 5 g씩 3반복 채취하여 병간(between- bottle)과 병내(withinbottle)의 균질성을 확인하였다. 제조된 분석표준물질에 대한 균질성은 KS Q ISO Guide 13528(2009), KS A ISO Guide 35(2005) 및 EURL-PT protocol (Amadeo et al., 2014)의 방법을 적용하여 평가하였다.

KS Q ISO Guide 13528에서 제시하는 균질도 평가는 아래의 공식 (1), (2), (3)에 따라 시료간의 시료 내(s_w)와 시료 간의 표준편차(S_s)를 구하였으며, 본 시험의 허용표준편차(σ)는 인증값(설정값)의 25%를 설정하여 계산하였다.

X_t : 균질도 평가를 위해 측정된 데이터
$$ \stackrel{\text{̅}}{X}$$ : 전체평균
t : 병간시료 (t=1, 2......, g)
W_t : 시험용 시료간의 범위
s_x : 시료평균의 표준편차
s_w : 시료 내 표준편차
s_s : 시료 간의 표준편차

KS A ISO Guide 35에 제시하는 방법에 따라 병간 표준편차(between-bottle variance, s_bb)와 병내 표준편차(withinbottle variation, s_wb)를 5% 유의수준에서 아래의 공식 (4), (5)에 따라 산출하였다. 본시험의 n₀은 누락된 데이터가 없기 때문에, 분석결과의 수 n과 같았다.

s_a : 병간의 분산
M_among : 병간의 평균제곱
M_within : 병내의 평균제곱
n₀ : 각 bottle의 분석결과 수 (=n)

또한, 유럽에서 제시하는 EURL-PT의 공식 (6), (7)에 따라 Cochran’s test를 수행하여 이상치(outlier)를 확인한 후 F-검정에 의한 분석시료들의 허용편차 기준값을 산출하고 시료들의 분석결과 편차가 기준값 이내 인 것을 확인하였다(Kim et. al., 2010; Thompson et al., 2006). 본 시험의 허용 표준편차는 인증값(설정값)의 25%를 설정하여 계산하였다.

s_s : 시료 간의 표준편차
s_x : 시료평균의 표준편차
s_w : 시료 내 표준편차
σ_all : 인증값의 허용표준편차
F₁, F₂ : 1.88, 1.01

안정성 및 수분함량

안정성시험은 균질성이 확인 된 분석표준물질이 각 분석기관에 송부될 때 실온상태에서 배송되고, 다양한 조건 하에 보관 후, 분석하는 상황을 고려하여 실온(20~30^oC)에서 7일, 냉동(-20^oC)에서 30일, 초저온 조건(-80^oC)에서 245일 동안 보관하면서 풋고추 분석표준물질 내의 각 농약성분의 안정성을 확인 하였다.

안정성의 적합성 여부는 KS A ISO Guide 35(2005)에서 제시하는 아래의 공식 (8)~(11)을 적용하여 확인하였다.

b₁ : 기울기
b₀ : 회귀선의 절편
X_i와 Y_i : 시간 경과와 시간경과에 따른 상대적인 농도
$$ \stackrel{\text{̅}}{X},\stackrel{\text{̅}}{Y}$$ : X_i, Y_i 의 평균값

수분함량의 측정은 균질화된 시료 0.5 g을 취하여 desiccator(P₂O₅)안에서 1주일 동안 방치 한 후, 질량변화를 측정하였으며 3반복 수행하였다.

인증값(설정값) 및 표준불확도의 산출

인증값은 균질성이 확인된 분석표준물질을 30반복 추출 및 분석하여 산출된 평균값을 적용하였으며, KS A ISO Guide 35(2005)에서 제시하는 병간 불균질성으로 인한 표준불확도(u_bb)는 아래의 공식 (12)에 따라 산출하였다.

M_among : 병간의 평균제곱
M_within : 병내의 평균제곱
vM_within : M_within의 자유도 수
n : 시료의 갯수

숙련도 평가

균질성, 안정성, 표준불확도 그리고 수분함량이 적합한 농약다성분 풋고추 분석표준물질을 잔류농약 분석을 수행하는 8기관에 송부하여 풋고추 분석표준물질 내에 함유되어 있는 10종의 농약성분에 대한 정량(quantification)과 정성(qualitative) 분석을 할 수 있도록 하였으며, 정량/정성분석 시 30종의 농약 solution과 list를 제공하여 비교분석 할 수 있도록 하였다. 각 시험소의 정도관리평가는 KS Q ISO Guide 13528(2009)에 제시된 아래의 공식 (13)에 따라 z-value의 통계처리로 전환된 z값을 평가기준을 적용하였다(Table 3).

x : 참가시험기관의 측정값
X : 인증값(설정값)
σ : 결과값의 분산정도(25%의 표준편차)

Table 3.

Interpretation of z-score for proficiency testing

동시다성분 분석법의 확립

10종의 농약성분에 대한 분석장비 및 분석방법의 검출한계, 직선성 그리고 회수율의 결과는 Table 3과 같다. 회수율은 88.7~138.6%였으며, 변동계수(coefficient of variation)은 0.03% 이하였다. 그리고, 직선성은 모든 농약성분이 0.999 이상으로 우수하여 분석표준물질의 인증값(설정값)을 산출하는데 적합하였다(Table 4). 또한, 농약을 처리하지 않은 무처리시료에서 불순물에 의한 방해 또는 간섭요인은 확인되지 않았다(Fig. 2).

Table 4.

Results of method validation for 10 pesticides

Fig. 2.

Chromatograms of control and treated samples for 10 pesticides by GC-NPD and ECD analysis.

농약다성분 풋고추 분석표준물질의 적합성

농약다성분 풋고추 분석표준물질의 적합성여부는 균질성, 표준불확도, 안정성, 수분함량의 결과를 바탕으로 확인하였다. 균질성이 적합하지 못할 경우에는 숙련도평가의 적합성 평가에 매우 심각한 문제가 발생할 수 있기 때문에 균질성의 평가는 매우 중요한 사항이다(Kim et al., 2010). 본 시험에서 개발한 분석표준물질의 균질성은 KS Q ISO 13528(2009)에서 제시하는 측정기준에 근거하여 평가한 결과, 대상 농약성분들의 시료 간의 표준편차(s_s) 값이 0.3σ 값보다 작아서 통계학적으로 균질성이 매우 우수하였으며, EURLPT, IUPAC, AOAC International Harmonized Protocol에서 요구하는 Cochran’s test를 통해 s_s² 값이 c 값 보다 작아 각 농약성분이 매우 균질하게 분포되어 있음을 확인할 수 있었다(Table 5). 또한, 일원분산분석법(ANOVA test)에 의해 산출된 병내 표준편차(within-bottle variation, s_wb)와 병간 표준편차(between-bottle variance, s_bb)는 인증값(설정값)의 1.7~3.7%의 범위로 정도관리 및 숙련도 시험에 적용될 수 있는 분석표준물질인 것으로 확인하였다(Table 6).

Table 5.

Results of homogeneity test for 10 pesticides in analytical reference material of green-pepper

Table 6.

Within-bottle (swb), between-bottle variation (sbb) and uncertainty (ubb) estimation from homogeneity test for 10 pesticides

표준불확도는 병간의 불균질성으로 인해 발생한 값으로서, KS A ISO Guide 35(2005)에서 제시하는 통계적인 방법으로 산출된 각 농약성분들의 표준불확도는 인증값(설정값)의 0.8~1.1%로 매우 미미한 수준이었으며, 이 값은 정도관리 및 숙련도 평가에 미치는 영향이 매우 낮아 농약다성분 분석표준물질로 사용하기에 적합한 것으로 확인되었다(Table 6).

실온(20~30^oC), 냉장(4~8^oC), 냉동(-20^oC), 초저온 상태(-80^oC)에서의 풋고추 표준물질의 안정성 결과는 Table 7에 나타내었다. 안정성의 적합성 여부는 아래의 공식 (14)에 따라, 각 농약성분의 시간과 농도에 따른 추세선의 기울기 절대값(b₁)이 ISO Guide 35에서 제시하는 s(b₁)에 n − 2 자유도(degree of freedom)와 p=0.95일 때(95% 신뢰수준) Student's t-factor의 값을 곱한 값보다 작을 경우에 불안정성이 관찰되지 않은 것으로 판단하였다.

Table 7.

Stability assessment at the various storage conditions

풋고추 분석표준물질은 실온에서 7일, 냉동에서 30일 동안 매우 안정한 것으로 확인하였으며, 초저온 상태에서는 245일 동안 bifenthrin, fenpropathrin 물질을 제외하고 안정성이 유지 되는 것을 알 수 있었다. Bifenthrin, fenpropathrin은 초저온 보관에서 245일 동안 초기농도 대비 40~50%가 감소하여 장기보관은 어려운 것으로 판단되었으나, 냉동보관 최초 30일 이내의 기간 동안은 안정성이 유지 되는 것으로 보아 풋고추 분석표준물질은 농약분석기관에 적용하여 정도관리 및 숙련도 평가 시에는 활용될 수 있을 것으로 사료된다(Table 7).

풋고추 분석표준물질의 수분함량은 0.03%로 매우 낮아, 칭량 시 수분에 의한 보정 없이 사용할 수 있을 것으로 보여진다(Table 8).

Table 8.

Measurement of moisture content for analytical reference material

숙련도시험

농약다성분 분석표준물질의 숙련도시험 검증을 위해 농촌진흥청의 협조로 농약시험분석 기관에 송부하여 숙련도시험을 수행하였다. 숙련도 시험에 참여한 8개 기관에서 제출한 측정 결과값의 정확성 및 분산정도를 바탕으로 z값을 산출한 후 평가기준에 적용한 결과, F 기관은 bifenithrin (2.0%)과 cyhalothrin-lambda (2.3%) 농약성분에 대해서 의심스러운(questionable) 등급의 평가를 받았으며, D 기관은 iprobenfos(3.7%)이 부적합(unacceptable)을 받았으며 fenitrothion (2.3%)은 의심스러운(questionable)등급으로 평가되었다. G 분석기관에서는 6종의 농약성분(fenitrothion, procymidone, chlorfenapyr, bifenithrin, fenpropathrin, Lambda-cyhalothrin)을 검출하지 못하는 결과를 확인하였다(Table 9). 이와 같은 결과를 통해 분석표준물질의 숙련도 시험에 참여한 분석기관의 숙련도는 전반적으로 양호한 것으로 확인 되었지만 정도 관리 체계마련을 위해 시험약제에 대한 숙련도 시험연구가 지속적으로 수행되어야 될 것으로 판단되었다.

Table 9.

Results of z-value for inter-lab test