첨단독성시험(New Approach Methodologies, NAMs) 결과를 활용한 농약의 갑상선 영향 연구

실험물질

본 연구에서는 갑상선 영향을 평가하고자 동물시험에서 갑상선 영향이 있는 것으로 분류된 농약 3종(Table 1)을 선정하여 실험을 수행하였다(EFSA, 2019; EFSA, 2024). 사용된 농약은 Folpet(Hankook samgong Co. Ltd., Seoul, South Korea), Bromoxynil(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Fenoxycarb(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이었으며 Dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 녹여 시험 당일에 사용하였다.

Table 1.

Pesticides tested in this study

세포주 배양

본 연구에서는 갑상선 세포독성 평가를 위해 인체 갑상선 여포 상피세포주 Nthy-ori 3-1(#90011609, Merck, Rahway, NJ, USA)를 사용하였다. RPMI 1640(Gibco, Thermofisher-Scientific, Waltham, MA, USA) 배지에 2 mM Glutamine와 10% FBS(Gibco, Thermofisher-Scientific, Waltham, MA, USA)를 혼합한 배지를 사용하였다. Nthy-ori 3-1 세포는 T75 플라스크에 3 × 10³/well/100 μL/96 well plate로 분주하여 37^oC, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 모든 세포주는 계대수(Passage number) 10 이내로 제한하여 실험을 수행하였다.

갑상선 호르몬 수용체 리포터 분석을 위해 Human TRα/TRβ Reporter assay kit(Indigo biosciences, Stage college, PA, USA)에 포함된 인체 유래 갑상선 리포터(Reporter) 세포주를 사용하였다. 동결된 세포는 Kit 내 동봉된 Cell Recovery Medium과 혼합하여 37^oC 항온수조에서 10분간 해동 및 안정화시킨 후 사용하였다.

세포 생존률 분석

실험농약 원액(stock solution)은 DMSO에 용해하여 1 M 농도로 제조하였으며, 사용 직전에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다. Folpet은 실험에 필요한 최고농도를 1250 µM, Bromoxynil 및 Fenoxycarb는 10000 µM로 하였다. 실험농약은 4반복 처리하였으며, 물질처리를 위해 96-well plate의 12열에 최고농도의 실험농약이 포함된 배지를 분주하였다. 이후 11열부터 2배 단계희석(Serial dilution) 방식으로 처리하였고, 1열은 배지대조군으로 설정하였다. 실험물질 처리 후 24시간 동안 37°C, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

세포 생존률은 WST-1 assay(#5015944001, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험농약 노출 종료 2시간 전에 각 well에 WST-1 시약을 10 µL씩 처리한 후, 37°C 배양기에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)(Thermofisher-Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 420~480 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 배지대조군과 양성대조군(Full kill well, DMSO 50–100%)을 기준으로 정규화하여 분석하였다. 세포 생존률 데이터를 기반으로 GraphPad Software(San Diego, CA, USA)을 사용하여 IC₅₀를 산출하였다.

갑상선 호르몬 수용체(TRα, TRβ) 활성화(Agonist) 반응 분석

세포 현탁액을 96-well plate에 well당 200 μL씩 분주하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂조건의 배양기에서 4~6시간 동안 전배양한 후, 시험농약을 처리하였다. 실험농약(Bromoxynil, 100 μM; Fenoxycarb, 900 μM; Folpet, 30 μM)은 각 최고 농도를 기준으로 DMSO를 사용하여 3배 희석(Serial dilution)하여 처리하였다.

갑상선 호르몬 수용체 활성화 반응 분석실험에서 희석배지는 Human TRα/TRβ Reporter assay kit에 동봉된 Compound Screening Medium(CSM)을 사용하였다. 음성 대조군으로는 희석배지인 CSM을 사용하였고, 양성대조군은 150 nM T3(3,3′,5-Triiodo-L-thyronine)를 사용하였다. 처리 후 세포는 37°C, 5% CO₂조건의 배양기에서 24시간 배양하였다.

실험농약 처리 후 각 well에 제조사에서 제공하는 Luciferase Detection Reagent 100 μL를 첨가하고, 실온에서 5분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더기(Thermofisher-Scientific, Waltham, MA, USA)의 luminescence 기능을 사용하여 발광값(Relative Light Units, RLU)을 측정하였다.

실험농약의 갑상선 수용체 활성화 반응은 참조 양성대조물인 T3에 대한 상대활성(Percent Relative Activity, %RA)으로 산출하였다. 실험농약의 상대활성 값이 10% 이상이면 활성있음(Active)로 판정하였다(Caviola E and Sherf B, 2023).

$$ \mathrm{\%}RA=\frac{\left(RL{U}_{sample }-RL{U}_{blank }\right)}{\left(RL{U}_{T3,\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-RL{U}_{blank }\right)}\times 100$$

고속대량시험(High-Throughput Screening, HTS) 데이터 비교·분석

미국 EPA ToxCast/Tox21 프로그램에서 제공하는 갑상선 관련 HTS 자료를 수집·검토하였다. ToxCast에서 갑상선 교란과 관련된 시험법은 크게 수용체 반응(Thyroid hormone Receptor, TR; Thyroid-Stimulating Hormone Receptor, TSHR 등), 호르몬 합성(Thyroid peroxidase, TPO; Iodothyronine deiodinases, DIO; iodotyrosine deiodinase, IYD 등), 요오드 흡수·수송(Sodium-iodide symporter, NIS) 범주로 구분되며, 관련된 HTS 결과는 Hit call, Scaled_top, Emax, Cutoff, AC₅₀, Cytotox burst(세포독성 급증농도) 수치 이용하여 분석하였다(Tables 2, 3). Scaled_top은 최대반응영향(Emax)을 Cutoff로 정규화한 값이며, 이 값이 1 이상일 경우 Hit call에서 활성(Active)으로 판정하였다. AC₅₀은 최대반응의 50%를 보이는 농도이며, Cytotox burst는 세포독성과 관련된 활성 폭증 농도로 데이터 해석에 활용하였다(Judson Richard et al., 2016; Natalia Ryan, 2017).

Table 2.

ToxCast/Tox21 high-throughput screening (HTS) Assays

Table 3.

Summary of ToxCast/Tox21 high-throughput screening (HTS) results for pesticides

QSAR 모델을 이용한 예측

갑상선 호르몬 수용체 작용 이외에 교란을 유발하는 다른 기작을 예측하기 위해 공개 QSAR 플랫폼인 VEGA(Mario Negri Institute, Milan, Italy)와 Danish QSAR(National Food Institute and Technical University of Denmark)를 활용하였다.

VEGA 플랫폼에서는 Thyroid receptor α effect(NRMEA v1.0.1), Thyroid receptor β effect(NRMEA v1.0.1), Thyroperoxidase(TPO) inhibitory activity(OBERON v1.0.1) 모델을 대상으로 각 농약의 활성(Active/Inactive)을 예측하였다. 이때 적용범위(Applicability Domain, AD) 및 신뢰도(Reliability)를 고려하였으며, 적용범위 지수(Applicability Domain Index, ADI)가 0.85 이상인 경우 신뢰 가능한 예측 결과로 판단하여 활용하였다(VEGA HUB).

Danish (Q)SAR database에서는 Iodothyronine deiodinase (DIO1, DIO2, DIO3) 억제, Thyroperoxidase(TPO) 억제, Thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) 억제, sodium/iodide symporter(NIS)와 관련된 모델을 활용하였다. Danish (Q)SAR Database에서는 QMRF(QSAR Model Reporting Format) 문서(DTU Food, 2018)에 따라 모델의 적용범위(AD)를 구조적 유사도(Structural domain)와 예측확률(Predicted Value)을 기준으로 정의하였다. 구조적 적용범위는 예측 농약과 학습세트 간의 Tanimoto 유사도를 이용하여 평가하였으며, 예측확률이 0.7 이상인 경우 활성(Positive), 0.3 이하인 경우 비활성(Negative)으로 분류하였다. 0.3~0.7 구간의 농약은 경계값(out of AD)으로 간주하여 예측의 신뢰도를 평가하였다.

두 가지 QSAR 플랫폼에서의 예측 결과는 본 연구에서 수행한 세포 기반 갑상선 수용체 리포터 시험 결과와 국외 in vitro 및 in vivo 시험 결과와 비교 분석에 활용하였다.

갑상선 세포독성 및 갑상선 호르몬 수용체(TR) 활성화(Agonist) 반응 분석

EFSA에서 갑상선에 영향이 있을 것으로 우려하는 농약 3종(EFSA, 2019; EFSA, 2024)을 선정하고 갑상선 세포독성 실험을 수행하였다. 실험결과 Folpet의 반최대억제농도(IC₅₀, half maximal inhibitory concentration)는 25.31 μM, Bromoxynil은 2268 μM, Fenoxycarb는 1990 μM이었다.

갑상선 영향 작용 기작 중 갑상선 호르몬 수용체(TR) 활성화 반응에 대한 영향을 in vitro luciferase 시험을 통해 평가하고자 하였다. TRα 및 TRβ 대한 활성화 시험을 수행하였으며, 양성대조군으로는 T3를 사용하였다. 실험 농도는 갑상선 세포독성 평가의 결과(Fig. 1)에 따라 세포독성이 없는 농도에서 수행하였다. 시험 결과, 양성대조군에서의 갑성선 수용체 활성(relative activation, %) 반응은 확인된 반면, 실험농약은 0.1% 내외의 활성을 보여 모두 갑상선 호르몬 수용체에 유의한 활성화 영향은 없는 것으로 확인되었다(Fig. 2).

Fig. 1.

Cell viability of human thyroid cells after 24-h exposure to test pesticide. Data represent mean ± SD (n = 4). IC50 value, defined as the concentration of a test substance that reduces cell viability by 50%, was calculated using nonlinear regression (normalize response curve fitting) in GraphPad Prism 10.

Fig. 2.

Agonist activity of test pesticides in TRα and TRβ reporter gene assays. Relative activation (%RA) was calculated based on the response induced by positive control, T3. Data represent mean ± SD(n = 3)

고속대량시험(HTS) 데이터 분석

In vitro 갑상선 호르몬 수용체 시험은 현재 활성화(agonist) 시험 결과의 활용에만 권고하고 있기 때문에 길항(antagonist) 영향 평가에 제약이 있다(OECD, 2024). 또한 갑상선 영향은 단일 경로가 아닌 여러 분자개시사건(Molecular Initiating Event, MIE)과 하위 생물학적 단계의 상호작용에 의해 나타나므로(EFSA, 2019) 다중 기전을 검토하기 위해 미국 EPA의 CompTox Chemical Dashboard(v2.6.0) 에 수록된 ToxCast/Tox21 in vitro HTS 데이터를 수집·분석하였다(Table 2).

Folpet은 갑상선과 관련된 여러 어세이(TSHR, TR, TPO, NIS)에서 최대반응영향(Emax)을 Cutoff로 정규화한 Scaled_top값이 1 이상이므로 Hit call에서 활성(Active)으로 수집되었다(Table 3). 그러나 각 실험 별 AC₅₀와 세포독성(cytotox burst 또는 viability assay 결과)을 비교한 결과, 세포독성에 의한 비특이적인 반응 가능성이 높은 것으로 판단되었다. CCTE_Simmons_AUR_TPO 실험의 경우, AC₅₀ (25.65 µM)가 세포독성 급증농도 (Cytotox Burst, 14.08 µM)보다 높은 농도에서 관찰되어 세포독성에 의해 유도된 반응일 가능성이 높았다. TOX21_TR_LUC_GH3_Antagonist 실험의 경우, AC₅₀(1.88 µM)가 세포독성 급증농도(14.08 µM)보다 낮았으나, 동일 세포주를 이용한 세포생존율 실험 (TOX21_TR_LUC_GH3_Antagonist viabliltiy)의 AC₅₀(2.3 µM)와 유사하였다. 즉 세포독성(viability) AC₅₀/Antagonist AC₅₀의 비율 (1.22)이 5를 초과하지 않아 세포독성에 의한 영향을 배제하기 어렵다고 판단하였다(Debabrata Mahapatra et al., 2018). TOX21_TSHR_HTRF_Agonist_ratio 실험 및 CPHEA_Stoker_NIS_Inhibition_RAIU 실험은 대조군 세포생존율 실험(CCTE_Simmons_CellTiterGLO_HEK293T)과 비교 시, 세포독성이 나타난 농도(AC₅₀ 9.76 µM)보다 높은 농도에서 활성이 관찰되어, 세포독성에 의한 비특이적인 반응으로 간주되었다.

Bromoxynil은 갑상선 관련 두 개의 어세이에서 모두 활성(Active)으로 수집되었다(Table 3). 갑상선 호르몬 수용체 길항 반응 시험(TOX21_TR_LUC_GH3_Antagonist)에서의 AC₅₀ (51.61 µM)은 세포독성 급증농도(55.77 µM)와 유사하였고, 같은 세포계를 이용한 세포생존율 실험에서는 2.3 µM 농도에서 독성이 관찰되었다. 따라서 51.61 µM에서의 길항 활성은 비특이적 세포 독성 영향에 의한 것으로 판단하였다. 한편 갑상선호르몬 반응성 유전자(THRSP) 발현 어세이 (LTEA_HepaRG_THRSP)에서는 AC₅₀ 26.5 µM로 세포독성 급증 농도(55.77 µM) 이하에서 활성이 나타났다. 그러나 THRSP 유전자는 간세포의 지질·대사 조절에도 관여하는 것으로 알려져 있으므로(Yao et al., 2016) 갑상선호르몬계 반응으로 판단하기 위해서는 추가적인 자료 분석이 필요하다고 사료되었다.

Fenoxycarb는 요오드 흡수·수송 경로에 대한 어세이 결과를 확인할 수 있었다. NIS 억제 어세이(CPHEA_Stoker_NIS_Inhibition_RAIU)는 활성으로 분류되었으나(AC₅₀: 40.21 μM), 세포독성 급증농도(40 μM)와 유사하였다. 또한 세포독성 대조 어세이(CPHEA_Stoker_NIS_Cytotoxicity)에서 세포독성이 더 낮은 농도(AC₅₀: 34 μM)에서 관찰되어 비특이적 세포독성에 기인했을 가능성이 높다고 판단하였다.

QSAR 모델을 이용한 갑상선 영향 평가

국외 고속대량시험(HTS) 데이터에서도 분자개시사건에 대한 자료 공백이 확인되었기 때문에 이를 보완하고자 in silico QSAR 모델을 적용하여 잠재적 갑상선 영향을 추가로 확인하고자 하였다.

Folpet, Bromoxynil, Fenoxycarb 모두 VEGA 플랫폼의 갑상선 관련 3가지 모델에서 일관되게 비활성(negative)으로 예측되었다(Table 4). Thyroid receptor α 및 β effect (NRMEA v1.0.1), Thyroperoxidase (TPO) inhibitory activity (OBERON v1.0.1) 모델에서 세 농약의 적용범위(Applicability Domain, AD) 지수는 0.92~1.0으로 평가되어 모두 적용범위 내(in AD)에 포함되었다. 또한 일부 모델에서는 실험값이 함께 포함되어 예측의 신뢰도가 높은 것으로 평가되었다. 이를 종합할 때, 세 가지 실험농약은 갑상선 호르몬 수용체(TRα, TRβ) 및 TPO 억제 활성 기작을 통해 갑상선 기능에 영향을 미칠 가능성이 낮을 것으로 판단하였다.

Table 4.

Vega QSAR model predictions for thyroid hormone system-related endpoints

Danish (Q)SAR에서는 Folpet의 경우, 8개의 모델에서 모두 비활성(negative)으로 예측되었다(Table 5). Thyroid peroxidase (TPO) inhibition QSAR1 모델과 Thyroid-stimulating hormone receptor(TSHR) inhibition에서는 예측확률이 각각 0.326 및 0.338로 나타나 경계값(0.3–0.7 범위)에 해당되어, 적용범위 밖(out of AD)으로 판정되었다. 다만 TSHR inhibition 모델에서는 비활성의 실험값이 존재하여 최종 비활성으로 판단하였다. 나머지 6개의 모델(TPO inhibition, NIS sensitivity, NIS specificity, DIO1 inhibition, DIO2 inhibition, DIO3 inhibition)은 적용 범위 내에서 비활성으로 예측되어 이와 관련된 기작으로 갑상선 기능에 영향을 미칠 가능성은 낮은 것으로 판단하였다.

Table 5.

Danish QSAR model predictions for thyroid hormone system-related endpoints

Bromoxynil의 경우, Danish (Q)SAR Database의 8개 갑상선 관련 모델 중 6개 모델에서 예측확률이 0.3~0.7 범위에 해당하여 불확정(inconclusive)으로 판정되었으며, 동시에 모델의 적용범위 밖(out of AD)으로 분류되었다. 그러나 이중 TPO inhibition 2개의 모델에서 비활성의 실험값이 존재하여 최종 비활성인 것으로 판단하였다. DIO2 inhibition 모델에서는 활성(positive)으로 예측되었으나, 결과가 적용범위 밖(out of AD)으로 분류되어, 해당 예측의 신뢰도는 제한적인 것으로 사료되었다. TSHR inhibition 모델에서는 비활성(negative, in AD)으로 예측되어, Bromoxynil은 TSHR inhibition, TPO inhibition 기작을 통해 갑상선 기능에 영향을 미칠 가능성은 낮은 것으로 판단되었다.

Fenoxycarb의 경우, Danish (Q)SAR Database의 8개 갑상선 관련 모델 중 TPO inhibition QSAR1 및 QSAR2, NIS (higher sensitivity/specificity) 모델에서 예측확률이 각각 0.43~0.53 범위로 나타나 불확정(inconclusive)으로 판정되었으며, 동시에 적용범위 밖(out of AD)으로 분류되었다. 다만, TPO inhibition 모델 2가지의 경우, 비활성의 실험값이 존재하여 비활성으로 판단하였고 NIS 모델 2가지만 예측 신뢰도가 제한적인 것으로 판단하였다. 반면 DIO1, DIO2, DIO3, TSHR inhibition 모델에서는 적용범위 내(in AD)에서 비활성(negative)으로 예측되었으며, 특히 DIO1 inhibition 모델 및 TSHR inhibition 모델은 실험값이 비활성으로 확인되었다. 이를 바탕으로 Fenoxycarb는 TPO, DIO, TSHR 등 갑상선 관련 주요 기작을 통해 갑상선 기능에 영향을 미칠 가능성이 낮은 것으로 사료되었다.

In vivo, in vitro, in silico 갑상선 영향 결과 비교

농약에 의한 갑상선 교란은 시상하부-뇌하수체-갑상선축(HTP axis)의 조절 경로를 방해함으로써 갑상선 호르몬의 합성, 대사, 운반, 수용체 결합 등 여러 단계에서 일어날 수 있다고 알려져 있다(Antonio et al., 2020; Leemans et al., 2019; EFSA 2024). 대표적으로 일부 농약은 시상하부나 뇌하수체 수준에서 TRH(Thyrotropin-releasing hormone) 또는 TSH(Thyroid-stimulating hormone) 분비를 변화시켜 갑상선 자극 신호에 영향을 유발할 수 있다. 또한 갑상선호르몬(T3, T4)은 NIS(Sodium/iodide symporter)를 통한 요오드 흡수, TPO(Thyroperoxidase)에 의한 산화, Tg(Thyroglobulin)에 결합 등 복잡한 생합성 과정을 거치는데, 이러한 단계에 작용하여 갑상선호르몬 합성 또는 분비에 영향을 유발할 수 있다. 이외에도 혈중 운반단백질(Transthyretin, TTR; Thyroxin-binding globulin, TBG; 알부민)과 결합 방해, 세포막 수송체(Monocarboxylate Transporter 8, MCT8) 및 핵 내 갑상선 호르몬 수용체(TRα, TRβ) 교란 등이 갑상선 기능 이상을 초래할 수 있다고 보고되어 있다.

본 연구에서는 국외에서 갑상선 영향 우려가 제기된 농약 3종을 대상으로 in vitro 및 in silico 실험을 통해 잠재적 갑상선 영향 기전을 예측하고, 그 결과를 in vivo 독성시험 결과와 비교하고자 하였다.

Folpet의 경우, 2년 랫드 발암성시험에서 갑상선여포세포 과형성이 관찰되어 갑상선 영향 가능 물질로 분류되었다(EFSA 2019; EFSA 2024). 그러나 다른 문헌에서는 T4 호르몬의 감소가 최대내약용량(Maximally Tolerated Dose, MTD)을 초과하고 전신독성이 나타나는 용량에서만 보고되었다(EFSA, 2023; EPA, 2015). 본 연구의 in vitro 및 in silico 분석 결과에서도 Folpet은 TPO, TR, NIS 등 주요 갑상선 영향 경로에서 비활성으로 예측되어 in vivo에서 관찰된 T4 저하, 갑상선여포세포 과형성은 갑상선의 직접적 영향보다는 고용량 노출에 따른 2차적인 효과로 해석하는 것이 타당하다고 사료되었다.

Bromoxynil의 경우, 90일 랫드 반복투여경구독성시험에서 갑상선여포세포 과형성이 관찰되어 갑상선 영향 가능 물질로 분류되었다(EFSA 2019; EFSA 2024). 또한 설치류 및 비설치류 반복투여독성시험에서 갑상선비대 및 소포세포 비대/증식이 보고되었으며, 일부시험에서 T4의 농도 감소가 나타났다(EFSA, 2017). 그러나간에서의 microsome 효소 유도가 확인되어 bromoxynil의 갑상선 영향은 간 대사 효소에 의한 2차적 영향으로 보고하였다(EFSA, 2017). 본 연구의 in vitro 분석의 갑상선호르몬 반응성 유전자(THRSP) 발현 어세이(LTEA_HepaRG_THRSP)에서 활성이 관찰되었다. 다만 THRSP 유전자는 간세포의 지질·대사 조절에도 관여하는 것으로 알려져 있으므로(Yao et al., 2016), 해당 활성은 갑상선 호르몬계에 특이적인 반응이라기보다는 간 대사 등에 따른 2차적 변화일 가능성을 배제하기 어려웠다. 따라서, 갑상선 관련 활성의 생물학적 의미를 명확히 하기 위해 추가 기전 검증이 필요하다고 사료되었다.

Fenoxycarb는 90일 랫드 반복투여경구독성시험에서 갑상선여포세포 과형성이 관찰되어 갑상선 영향 가능 물질로 분류되었다(EFSA 2019; EFSA 2024). 그러나 다른 연구에서 갑상선과 관련된 호르몬의 변화, 조직병리학적 변화, 장기무게 변화가 보고되지 않았으며, 대신 간 대사 효소 유도, 간무게 증가 등이 관찰되어 갑상선 영향의 직접적인 기전과 연계성이 낮은 것으로 해당 연구에서는 평가되었다(EFSA, 2010). 본 연구에서는 HTS 어세이 중 NIS inhibition 어세이의 고농도에서만 활성이 관찰되었으나 이는 세포독성에 의한 것으로 판단하였고 in silico 모두 비활성으로 예측되어 갑상선 영향 가능성은 낮은 것으로 판단하였다.

농약은 병해충·잡초로부터 작물을 보호하고 농산물의 생산성과 품질향상에 기여해 왔다. 그러나 일부 농약 성분은 내분비계(endocrine system)에 영향을 줄 수 있다는 가능성이 보고되고 있다(Mnif et al., 2011). 내분비계 영향 물질로 평가할 시에는 단순한 표면적인 관찰보다는 기전에 기반한 시험방법을 적용하여 내분비계 영향 가능성이 있는 물질과 2차적인 영향에 의한 물질인지 구분할 필요가 있다. 이러한 측면에서 in vitro 및 in silico 기반의 시험법은 동물시험의 대체뿐 아니라 내분비계 영향 가능성을 조기에 탐지할 수 있는 과학적 스크리닝 도구로서 유용하다고 판단된다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.