QoI계 살균제에 대한 사과점무늬낙엽병균 Alternaria alternata f. sp. mali의 저항성 검정

서 론

사과는 국내 과수산업에서 생산액 비중이 가장 높은 주요 과수 작물 중 하나이다. 그러나 최근 농촌 고령화에 따른 노후 과원 폐원, 재배면적 감소 및 병해충의 피해 등의 영향으로 국내 사과 생산량은 2022년 566,041톤에서 2023년 394,428톤으로 30.3% 감소하였으며, 2024년에는 460,088톤으로 일부 회복되었으나 여전히 2022년 수준에는 미치지 못하였다(Ministry of Data and Statistics, 2024). 한국식물병목록에 의하면 국내 사과에는 60종의 병해가 발생하는 것으로 보고되어 있지만 경제적으로 피해를 주기 때문에 안정적인 수확을 위해 살균제 등을 이용하여 방제하는 대표적인 곰팡이병에는 탄저병, 겹무늬썩음병, 갈색무늬병, 부란병, 점무늬낙엽병 등이 있다(Back et al., 2025; KSPP, 2024). 이러한 주요한 곰팡이병 중에서 사과 점무늬낙엽병(Alternaria leaf spot)은 Alternaria alternata f. sp. mali에 의해 발병하며 병징은 주로 잎에 주로 발생하여 갈색 소형반점이 암갈색 또는 회갈색의 병반으로 확대되는 특징이 있으며 4월 하순부터 발병이 관찰되기 시작하여 사과 생육기간동안 점차 증가하였다가 9월에 가장 높은 발병율을 보이며 수확기인 10월까지 발병이 지속된다(Cheon and Jeon, 2015; Cheon et al., 2018). 사과 품종인 ‘홍월’, ‘홍옥’, ‘쓰가루’, ‘국광’, ‘조나골드’, ‘골든 델리셔스’ 등은 점무늬낙엽병에 저항성인 것으로 확인되었으나 농가 및 소비자의 선호도가 높은 품종인 ‘홍로’, ‘감홍’, ‘선홍’ 등은 감수성으로 나타났다(Kim and Hwang, 2004). 따라서 사과 재배농가에서는 점무늬낙엽병을 방제하기 위해서 저항성 품종 재배, 월동 후 1차 전염원이 되는 낙엽 제거와 같은 과원 관리와 함께 살균제 살포가 이루어지고있다(Cabrefiga et al., 2023). 사과 점무늬낙엽병 방제를 위한 살균제로는 전세계적으로 보호살균제, quinone outside inhibitor(QoI), demethylation inhibitors(DMI), succinate dehydrogenase inhibitors(SDHI) 등이 주로 이용되어지고 있다(Cabrefiga et al., 2023; Verma and Khosla, 2018).

QoI계 살균제는 진균의 미토콘드리아 내막에 있는 cytochrome b의 Qo 부위에 결합하여 전자전달계를 저해함으로써 ATP 생성을 중단시켜 진균의 에너지 대사를 억제하는 작용기작을 가진 작물보호제로 식물병원성 곰팡이에 대한 우수한 방제 효과를 나타낸다(Bartlett et al., 2002; Gisi et al., 2002). 그러나 QoI계 살균제가 광범위하게 사용됨에 따라 다양한 식물병원성 곰팡이에서 저항성 발생이 보고되고 있다. 최초로 밀흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. tritici)에서 저항성이 보고된 이후, 포도노균병균(Plasmopara viticola), 사과검은 별무늬병균(Venturia inaequalis), 감자겹둥근무늬병균(Alternaria solani)등 다양한 작물의 병원균에서 QoI계 살균제에 대한 저항성 균주가 확인되었다(Bartlett et al., 2002; Campbell et al., 2021; Lesniak et al., 2011; Nottensteiner et al., 2019; Sierotzki et al., 2000). QoI계 살균제에 대한 저항성은 cytochrome b의 유전자의 점돌연변이에 의해 발생하며, 대표적인 저항성 관련 돌연변이에는 F129L, G137R, G143A 등이 보고되어 있다(Gisi et al., 2000; Gisi et al., 2002; Grasso et al., 2006; Sierotzki et al., 2007). 이들 돌연변이 중 F129L 및 G137R 돌연변이는 일반적으로 중간 수준의 저항성을 보이며 권장 사용농도에서 일정 수준의 방제효과가 유지되는 반면, G143A 돌연변이는 높은 수준의 저항성을 나타나 QoI계 살균제에 대한 방제효과를 현저하게 감소시키는 것으로 보고되었다(Fernández-Ortuño et al., 2008).

QoI계 살균제는 1990년대 후반 상업화된 이후 국내 사과 재배지에서 점무늬낙엽병을 비롯한 주요 병해 방제에 널리 사용되어 왔다. 대표적인 QoI계 살균제로는 kresoxim-methyl, trifloxystrobin, pyraclostrobin 및 azoxystrobin 등이 있으며, 현재까지도 사과 병해 방제 프로그램의 핵심 약제로 이용되고 있다(Back et al., 2025). 그러나 동일한 작용기작을 가진 살균제의 반복적인 사용은 저항성 균주의 발생을 야기할 수 있으며, 이에 따라 QoI계 살균제에 대한 저항성 발생 가능성이 지속적으로 제기되어 왔다. 그러나 국내 사과점무늬낙엽병균의 살균제 저항성에 관한 연구는 Kim과 Lee(1987)에 의해 iprodione 저항성 균주가 최초로 보고된 이후 매우 미비한 실정이다. 특히 장기간 사용되어진 QoI계 살균제에 대한 점무늬낙엽병균의 저항성 발생 현황에 대한 연구는 전무한 실정으로, 국내 사과 재배지에서의 저항성 발달 여부를 모니터링할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 사과 재배지 4개 지역에서 Alternaria alternata f. sp. mali를 채집, QoI 살균제에 대해 한천희석법을 통한 포자발아 억제율을 이용하여 EC₅₀ 값 확인 및 저항성에 주요한 역할을 하는 타겟 유전자를 분석하여 저항성 발달 여부를 확인하였다. 추가적으로 allele-specific PCR과 PCR-restriction fragment length polymorphism 분자진단 기법을 확립함으로써 살균제 저항성 모니터링 및 방제 전략 수립에 도움을 주고자 하였다.

재료 및 방법

사과점무늬낙엽병균 채집 및 분리

2021년 5월에서 8월까지 사과 재배지인 충주, 장수, 제천, 진안 등 4개 지역 홍로 품종에서 사과 점무늬낙엽병에 걸린 잎들을 채집하여 병원균을 분리하였으며 분리균주수, 채집 지역, GPS 좌표 등의 정보는 Table 1에 제시하였다. 병원균 분리는 병징 부위와 건전 부위가 절반씩 포함된 1 cm² 크기의 사과 잎 절편을 70% 에탄올에서 30초, 1% 차아염소산 나트륨에서 30초간 표면 소독을 한 뒤, 멸균수에서 세척 후 멸균 filter paper에서 건조하였다. 절편을 PDA 배지(potato dextrose agar, Becton, Difco^TM) 배지 중앙에 치상한 후, 25°C, 암조건, 상대 습도 90%로 설정된 배양기에서 5일간 배양한 후 형성된 균총 끝부분을 절단하여 새로운 PDA 배지에 치상하는 방법을 반복하여 순수분리 하였다.

Table 1.

Collection information for Alternaria alternata f. sp. mali isolates obtained from four apple-growing regions in Korea in 2021

분자생물학적 동정을 위해 internal transcribed spacer(ITS) 및 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자 영역을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. ITS 영역은 ITS1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)/ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) primer를 사용하였으며, GAPDH 영역은 gpd1(5’-CAA CGG CTT CGG TCG CAT TG-3’)/gpd2(5’-GCC AAG CAG TTG GTT GTG C-3’) primer를 이용하여 증폭하였다(Berbee et al., 1999; White et al., 1990).

단포자 분리를 위하여 Alternaria alternata f. sp. mali 균주를 V8 juice agar 배지에 계대배양한 후, 25°C 명조건에서 14일간 배양하여 포자를 형성시켰다. 형성된 포자는 멸균수와 Miracloth(Merck, NJ, USA)를 이용하여 회수하였다. 회수된 포자 현탁액은 1 × 10⁴ spores/mL로 조정한 후, 1.5% water agar가 분주된 90 mm petri dish (SPL, Pocheon, Korea)에 20 μL씩 도말하였다. 접종 6시간 후 현미경하에서 발아한 단포자를 분리하여 PDA 배지에 치상한 후 25°C에서 5일간 배양하였다. 이후 형성된 균총의 선단부에서 직경 5 mm의 균사 절편을 채취하여 20% glycerol 용액에 현탁한 후 -80°C에서 보존하였다.

병원균의 cytochrome b 유전자 증폭 및 염기서열 분석

QoI 살균제에 대해서 저항성 발달 여부를 확인하기 위해 96개 Alternaria alternata f. sp. mali 분리 균주의 cytochrome b 유전자 염기서열 분석을 통해 점돌연변이를 확인하였다. 유전자 증폭을 위하여 Table 2에 제시된 AF(5’-ACA CTG CTT CAG CAT TTT TCT TCA TAG-3’)/AR(5’-TTG TCC AAT TCA TGG TAT AGC ACT CA-3’) primer를 제작하였다(Ma et al., 2003). DNA 추출을 위해 PDA에서 7일간 25°C, 암조건으로 배양한 후 균사를 모아 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 i-genomic BYF DNA extraction mini kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출, PCR 반응을 진행하였다. PCR premix인 2X Topsimple^TM DyeMIX(aliquot)-nTaq (Enzynomics, Korea)에 genomic DNA 1µL, 10 pmole primer 각각 1 µL, 멸균된 증류수 7 µL, 총 20 µL의 반응액을 조성하였다. 반응 조건은 95°C에서 3분간 pre-denaturation 진행 후, 94°C에서 40초간 denaturation, 58°C에서 40초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension을 35회 반복하였고 72°C에서 10분간 반응 시킨 후 종료하였다. 최종산물을 1% agarose gel에 전기영동 하여 확인하고 증폭이 확인된 PCR 산물은 Dokdo-Prep^TM PCR purification kit(ELPIS Biotech, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제산물은 macrogen에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다. 분석된 염기서열은 Bioedit 프로그램을 이용하여 정리하고 분석하였다.

Table 2.

Primer sequences used for amplification of the cytochrome b gene and detection of the G143A mutation in Alternaria alternata f. sp. mali

결과 및 고찰

사과점무늬낙엽병균 동정 및 QoI 살균제에 대한 포자발아 억제 효과

2021년 국내 사과 재배지 충주, 장수, 제천 및 진안 지역에서 사과 점무늬낙엽병 증상을 보이는 홍로 품종의 사과 잎으로부터 총 96개 병원균을 분리하여 실험에 사용하였다. 분리한 96개 균주의 분자생물학적 동정을 위해 ITS 및 GAPDH 유전자 영역을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열의 길이는 ITS 420 bp와 GAPDH 534 bp였다. 이들 염기서열을 GenBank에 등록된 A. mali type strain CBS 106.24 및 A. mali isolate FC-3659(LC206592), EGS 38-029(AY762945, AY762955) 등과 유사도를 비교한 결과, 99.7−100%의 염기서열 상동성을 나타내었다. 따라서 본 연구에 사용된 균주들은 사과점무늬낙엽병균인 Alternaria mali로 동정되었다(Woudenberg et al., 2015). 전통적으로 사과점무늬낙엽병균은 Alternaria mali Roberts로 알려져 왔으나, 최근에 분류학적 연구에서는 A. mali가 Alternaria alternata species complex에 포함되어 사과에 특이적인 병원성을 나타내는 A. alternata f. sp. mali로 분류되고 있다(Cao et al., 2024). 따라서 본 연구에서도 A. alternata f. sp. mali로 명명하였다.

국내 사과 재배지에서 주요 병해 방제에 장기간 사용되어진 QoI계 살균제에 대한 점무늬낙엽병균의 저항성 발생 연구가 거의 이루어지지 않았기에 본 연구에서 분리한 96개 균주를 대상으로 살균제 저항성 여부를 확인하고자 하였다. QoI계 살균제는 병원균의 초기 생육 단계에서 미토콘드리아 호흡을 저해함으로써 병원균의 포자 발아 및 발아관 신장을 억제하므로 감염 초기 살포 시 우수한 방제효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Bartlett et al., 2002). 이러한 작용 특성을 고려하여 Alternaria solani 및 Pyrenophora tritici-repentis 등 일부 병원균의 QoI계 살균제 감수성 평가는 포자발아 억제율을 기반으로 수행되었다(Pasche et al., 2005; Sautua and Carmona, 2021).

분리된 사과점무늬낙엽병균 96개와 한국농업미생물자원 센터에서 분양 받은 KACC 40030을 포함한 총 97개 균주를 대상으로 QoI계 살균제인 kresoxim-methyl의 포자발아 억제 효과를 조사하였으며 이를 바탕으로 균주별 EC₅₀ 값을 산출하였다. Kresoxim-methyl에 대한 EC₅₀ 값은 충주 지역 21개 균주 중 14개 균주, 장수 지역 25개 균주 전부, 제천 지역 25개 균주 중 23개 균주, 그리고 진안 지역 25개 균주 중 21개 균주에서 100 µg/mL 이상으로 나타났다. 따라서 총 96개의 분리 균주 중 83개 균주(86.5%)가 100 µg/mL 이상의 EC₅₀ 값을 나타냈다(Fig. 1). 본 연구에서는 EC₅₀ 값이 100 µg/mL 이상의 균주들의 EC₅₀ 값은 100 µg/mL로 처리하였다. 반면 EC₅₀ 값이 100 µg/mL 미만으로 나타난 KACC 40030을 포함한 14개 균주는 0.00µg/mL − 0.09 µg/mL 범위로 나타났다. 이와 같이 저항성 균주와 감수성 균주 사이의 EC₅₀ 값은 뚜렷한 차이를 보여 두 집단이 명확하게 구분되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 본 연구에서 조사한 4개 지역 사과 재배지의 점무늬낙엽병균에서 QoI계 살균제인 kresoxim-methyl에 대한 저항성이 높은 빈도로 분포하고 있음을 보여준다.

Fig. 1.

Distribution of EC50 value of Alternaria alternata f. sp. mali isolates from Chungju (A), Jangsu (B), Jecheon (C), and Jinan (D) to kresoxim-methyl. KACC 40030 was included as the 22nd isolate in Group A (Chungju) in addition to the 21 field isolates. EC50 value indicate the concentrations required to inhibit spore germination by 50%.

Kresoxim-methyl과 trifloxystrobin은 모두 QoI계 살균제로서 cytochrome b의 Qo 부위에 작용하는 동일한 작용기작을 가진다. 기존 연구에서 QoI계 살균제 간 교차저항성이 보고되었으며 kresoxim-methyl에 저항성을 보이는 균주가 trifloxystrobin을 비롯한 다른 QoI계 살균제에도 낮은 감수성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Park and Kim, 2022). 이에 본 연구에서는 Alternaria alternata f. sp. mali 집단에서 QoI계 살균제 간 교차저항성 여부를 확인하기 위하여 trifloxystrobin에 대한 감수성을 추가로 평가하였다. Kresoxim-methyl에 대해 100 µg/mL 이상의 EC₅₀ 값을 나타낸 83개 균주(86.5%)가 trifloxystrobin에 대해서도 100 µg/mL 이상의 EC₅₀ 값이 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 국내 사과점무늬 낙엽병균 집단에서 kresoxim-methyl과 trifloxystrobin에 대한 동시 저항성이 존재함을 확인한 것으로 QoI계 살균제 간 교차저항성의 가능성을 시사한다. 이와 동일한 결과는 2017년과 2018년에 브라질 상파울루 지역의 tangerines 과원에서 분리한 A. alternata 균주에서도 확인되었다. Azoxystrobin과 pyraclostrobin에 대한 감수성을 조사한 결과, 하나의 QoI계 살균제에 저항성을 나타낸 균주가 다른 QoI계 살균제에도 저항성을 나타내어 두 약제 간 교차저항성이 존재함을 확인하였다(Chitolina et al., 2021). 이러한 현상은 A. alternata 뿐만 아니라 다른 식물병원균에서도 확인되었다. 오랜기간 QoI계 살균제가 사용된 사과 과수원에서 분리한 Venturia inaequalis를 조사한 결과, kresoxim-methyl에 대한 저항성을 나타내는 균주가 trifloxystrobin에 대해서도 감수성이 감소하는 경향을 보여 QoI계 살균제 간 교차저항성이 존재함을 보고하였다(Köller et al., 2004).

Fig. 2.

Distribution of EC50 values for trifloxystrobin among 83 Alternaria alternata f. sp. mali isolates exhibiting high resistance to kresoxim-methyl (EC50 > 100 µg/mL).

본 연구의 결과 국내 주요 사과 재배지의 점무늬낙엽병균 집단에서 QoI계 살균제 간 교차저항성의 가능성이 확인된 만큼 QoI계 살균제의 저항성이 광범위하게 확산되어 있으므로 향후 방제 전략 수립 시 저항성 관리가 매우 중요함을 시사한다 하겠다.

사과점무늬낙엽병균의 cytochrome b 유전자 분석 및 돌연변이 여부 확인

QoI계 살균제 저항성과 관련된 돌연변이를 확인하기 위해 작용 부위인 미토콘드리아 cytochrome b 유전자의 일부 영역을 AF와 AR primer를 이용하여 증폭하였으며 227 bp 크기의 PCR 산물을 확보하였다. 증폭한 유전자 단편의 염기서열을 분석한 결과, EC₅₀ 값이 100 µg/mL 미만인 KACC 40030을 포함한 14개 균주에서는 143번째 코돈이 GGT(glycine)로 확인되었다. 반면 EC₅₀ 값이 100 µg/mL 이상인 83개 모든 분리균주에서는 143번째 코돈인 GGT(glycine)에서 GCT(alanine)로 치환된 것으로 나타났다(Table 3). 따라서 저항성 균주에서 cytochrome b 유전자의 G143A 돌연변이가 예외 없이 검출되었으며, 해당 돌연변이와 kresoxim-methyl 저항성 간의 강한 연관성이 확인되었다.

Table 3.

Kresoxim-methyl resistance found in Alternaria alternata f. sp. mali in Korea

QoI계 살균제에 대한 저항성은 다양한 식물병원성 곰팡이에서 보고되어 왔다. 현재까지 보고된 cytochrome b 유전자의 저항성 관련 돌연변이로는 G143A, F129L 및 G137R이 있으며, 이 중 G143A 돌연변이가 가장 널리 분포하는 것으로 알려져 있다(Dorigan et al., 2023). 특히 F129L 돌연변이는 상대적으로 낮은 수준의 저항성을 부여하여 살균제 권장 농도에서 방제가 가능한 반면, G143A 돌연변이는 높은 수준의 저항성을 유발하여 QoI계 살균제의 방제 효과를 현저히 감소시키는 것으로 보고되었다(Fernández-Ortuño et al., 2008). 또한 G143A 돌연변이를 보유한 Alternaria spp.는 감수성 균주에 비해 QoI계 살균제에 대한 EC₅₀ 값이 현저히 증가하는 것으로 알려져 있다(Chitolina et al., 2021; Ma et al., 2003).

본 연구에서도 EC₅₀ 값이 100 µg/mL 이상인 83개 모든 분리균주에서 G143A 돌연변이가 검출된 반면, 감수성 균주에서는 해당 돌연변이가 확인되지 않았다. 이러한 결과는 G143A 돌연변이가 국내 사과점무늬낙엽병균의 QoI계 살균제 저항성과 밀접하게 연관되어 있음을 시사한다. 또한 조사된 4개 지역에서 높은 빈도의 저항성 균주가 확인된 점을 고려할 때, 국내 사과 재배지에서는 QoI계 살균제의 방제 효율이 저하되어 있을 가능성이 있다. 따라서 향후 보다 광범위한 국내 사과 재배지를 대상으로 점무늬낙엽병균의 QoI계 살균제 저항성 발생 현황과 G143A 돌연변이 분포를 지속적으로 모니터링할 필요가 있을 것으로 판단된다.

Allele-specific PCR 및 PCR-RFLP를 이용한 살균제 저항성 돌연변이 검정

식물병원균의 살균제 저항성 검정을 신속하고 정확하게 수행할 수 잇는 분자생물학적 방법에는 allele-specific PCR 및 PCR-RFLP이 널리 사용되고 있다(Furuya et al., 2009; Ma et al., 2003). 본 연구에서 먼저 사과점무늬낙엽병균의 cytochrome b 유전자 염기서열의 점돌연변이를 kresoxim-methyl에 대한 저항성 균주와 감수성 균주를 간편하게 구별하기 위해 allele-specific primer인 ARF와 ARR를 제작하고 PCR를 수행한 결과, 83개 저항성 균주에서만 227bp의 PCR 산물이 증폭되었다(Fig. 3). 그리고 G143A 돌연변이를 재검증하는 차원에서 PCR-RFLP 방법을 활용하고자 GGT에서 GCT로 치환됨으로써 GCTGC 염기서열을 인식하는 제한효소인 Fnu4HI를 처리하였다. 그 결과 kresoxim-methyl 감수성 균주에서는 227 bp의 PCR 산물을 확인할 수 있는 반면, kresoxim-methyl 저항성 균주에서는 227 bp의 PCR 산물이 178 bp와 49 bp로 절단된 2개의 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 PCR-RFLP 방법은 Alternaria 속 이외에 Botrytis cinerea, Cercospora beticola, Plasmopara viticola등의 병원균에서 QoI, benzimidazole계 살균제에 대한 저항성 발달을 검정하는데 적용되기도 하였다(Furuya et al., 2009; Malandrakis et al., 2022; Rosenzweig et al., 2015).

Fig. 3.

Allele-specific PCR detection of the G143A mutation associated with kresoxim-methyl resistance in Alternaria alternata f. sp. mali isolates collected from Chungju (A), Jangsu (B), Jecheon (C), and Jinan (D). The 40030 lane in Group A corresponds to the allele-specific PCR result obtained from KACC 40030. Sterile distilled water (SDW) was used as the negative control in place of template DNA.

Fig. 4.

Restriction fragment patterns of PCR-amplified cytochrome b gene fragments from kresoxim-methyl-sensitive and -resistant Alternaria alternata f. sp. mali isolates following digestion with Fnu4HI. Digested products were separated on a 2% agarose gel containing ethidium bromide. M, DNA size marker; S, sensitive isolate; R, resistant isolate.

본 연구에서는 allele-specific PCR과 PCR-RFLP의 두 가지 분자생물학적 방법을 이용하여 사과점무늬낙엽병균의 kresoxim-methyl 저항성을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 분자진단 기법을 확립하였다. Allele-specific PCR은 저항성 관련 돌연변이를 신속하게 검출할 수 있어 대규모 집단의 저항성 모니터링에 적합한 반면, PCR-RFLP는 제한효소 처리에 따른 절편 양상을 통해 저항성과 연관된 염기서열 치환을 정확하고 재현성 있게 확인할 수 있는 장점을 가진다. 따라서 본 연구에서 확립한 분자진단 기법은 사과점무늬낙엽병균 집단의 QoI 계 살균제 저항성을 효과적으로 진단하고 모니터링하는 데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 이를 통해 국내 사과 재배지에서 점무늬낙엽병의 효율적인 방제 전략 수립과 저항성 관리 체계 구축에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgments

이 논문은 전남대학교 연구년교수 연구비(과제번호: 2023-0087-01) 지원에 의하여 연구되었습니다.

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