감나무속 식물 Diospyros melanoxylon으로부터 잿빛곰팡이균 (Botrytis cinerea)에 대한 항진균 활성물질 분리 및 구조 규명

서 론

Botrytis cinerea (잿빛곰팡이균)는 전 세계적으로 심각한 식물 진균 중 하나로, 딸기, 토마토, 포도 등 원예작물의 수확 전후에 큰 손실을 초래하고 있다(Prins et al., 2000). B. cinerea 병징은 작은 수침상 반점에서 회색의 포자덩어리가 빠르게 형성되고, 2 ~ 3일 내에 기주식물 전체로 확산된다(Williamson et al., 2007). 이러한 괴사영양균(necrotrophic)은 식물에 기생하여 감염된 식물 세포를 직접 사멸시키고, 그 죽은 조직의 영양분을 흡수하는 특성을 가지고 있다(Paul et al., 1998). 저온다습한 환경에서 바람과 관수, 접촉 등을 통해 쉽게 전파되고, 특히 시설재배의 경우 비가 자주 오거나 하우스 내부가 과습할 때 급증한다고 보고되고 있다. 최근 기후 변화에 따른 시설 재배 면적의 확대와 고온다습한 환경의 영향으로 잿빛곰팡이균의 발생 빈도와 피해 강도가 더욱 높아지고 있다(Romanazzi and Feliziani, 2014).

B. cinerea의 방제는 전통적으로 작물 생육 기간 동안 합성 살균제를 주기적으로 살포하는 화학적 방제에 주로 의존해 왔다(Li et al., 2018). 그러나 특정 계통 살균제의 반복적·지속적 사용 및 오남용으로 인해 약제에 대한 저항성(내성) 균주가 빠르게 출현하고 있으며, 농산물 내 잔류 농약에 대한 소비자들의 안전성 우려 또한 지속적으로 제기되고 있다(Rosslenbroich and Stuebler, 2000). 이러한 화학적 방제의 한계를 극복하기 위해 기존 살균제의 사용량을 줄이면서 방제 효율을 높일 수 있는 합성 살균제와 천연 화합물 또는 비화학적 방제법의 병용 처리가 시도되고 있다(Abbey et al., 2019). 나아가 환경 독성을 최소화하고 내성균 발생 위험을 근본적으로 낮추기 위해, 기존 화학 살균제를 대체하거나 보완할 수 있는 식물 유래 천연물(natural products) 제제 기반의 친환경 방제 기술 개발이 강력한 대안으로 주목받고 있다(Yigal and Shtienberg, 1995).

본 연구에 사용된 Diospyros melanoxylon Roxb.은 감나무과(Ebenaceae)의 다년생 목본으로, 인도와 스리랑카 등 건조한 열대·아열대 기후 지역에 자생한다(Saraf et al., 2024). 해당 종은 최대 15 m까지 자라는 중간 크기의 관목성 나무로, 건조하고 견고한 외피를 형성하는 것이 특징이다(Chandrashikha, 2021). 잎은 호생 또는 대생으로 착생하며 최대 길이는 35 cm에 이르고, 꽃은 연보라색의 자웅이주 형태를 보인다(Kalpana et al., 2014). D. melanoxylon은 강력한 약리 활성을 지녀 인도 전통 의학에서 설사, 이질, 콜레라와 같은 소화기계 증상과 기관지염, 폐렴, 잇몸 출혈 등의 질환을 치료하는 처방에 빈번히 사용되었으며(Rathore, 1972) Diospyros속 식물 유래의 naphthoquinone계 화합물인 plumbagin, diospyrin 등은 다양한 식물병원성 진균 및 세균에 대해 우수한 항균 활성을 나타내어 농업 병해 제어를 위한 천연 살균제 및 생물학적 방제 소재로서의 높은 잠재력이 보고된 바 있다(Lajubutu, 1995). 이러한 천연 퀴논계 유도체들은 병원균의 포자 발아 억제 및 균사 생장 저해 효과가 우수하여 실제 식물 병해 방제제로의 적용 가능성이 지속적으로 입증되고 있다(Ryu, 2012).

따라서 본 연구에서는 잿빛곰팡이병의 화학적 방제를 대체하기 위하여 친환경 농자재 개발을 목적으로 D. melanoxylon 목질부로부터 잿빛곰팡이병 병원균인 B. cinerea에 대한 항진균 활성물질을 탐색 및 구명하였다.

재료 및 방법

결과 및 고찰

D. melanoxylon 목질부의 MeOH 추출물을 잿빛곰팡이병 병원균인 B. cinerea에 대하여 1,000 ppm 농도에서 생물검정한 결과 80.9% 균사체 억제능을 나타내었다(Fig. 1).

Fig. 1.

Antifungal activity of MeOH extract from the woody part of D. melanoxylon against mycelial growth of B. cinerea at 1,000 ppm concentration. (A) Control; (B) MeOH extract.

D. melanoxylon 목질부로부터 항진균 활성물질을 구명하고자 D. melanoxylon 목질부의 MeOH 추출물을 hexane, CHCl₃, EtOAc, BuOH, aqueous로 용매분획하여 얻은 각각의 용매분획을 대상으로 100 ppm에서 항진균 활성을 검정한 결과, hexane fraction에서 가장 강한 활성을 나타내었고 다음으로 CHCl₃ fraction에서 강한 활성을 나타내었다(Fig. 2).

Fig. 2.

Antifungal activities of each fractions of MeOH extract the woody part of D. melanoxylon against mycelial growth of B. cinerea at 100 ppm concentration. (A) Control; (B) Hexane fraction; (C) CHCl3 fraction; (D) EtOAc fraction; (E) BuOH fraction; (F) Aqueous layer.

가장 강한 활성을 나타낸 hexane fraction을 대상으로 항진균 활성물질을 분리 및 정제하고자 hexane fraction 7.53 g을 silica gel 650 g이 충진된 open column chromatography에 charge하고 hexane : EtOAc (7 : 3, v/v)의 용매계로 isocratic 방식으로 순차 용출하여 200 mL씩 총 46개의 fractions (HS-1 ~ HS-46)을 얻었다. 46개 fractions을 대상으로 항진균 활성검정한 결과 HS-24 ~ HS-26 fraction에서 강한 활성을 나타내었다.

HS-24 ~ HS-26 fraction 110 mg을 silica gel 30 g이 충진된 54 mL cartridge column에 loading하고 Hexane : EtOAc (3 : 4, v/v) 용매계로 용출하여 15 mL씩 50개의 subfraction (HSC-1 ~ HSC-50)을 얻었다. 50개의 subfraction을 항진균 활성검정한 결과 HSC-8 subfraction에서 활성이 나타나 최종적으로 항진균 활성물질 HSC-8 subfraction 15 mg을 얻었다.

최종적으로 항진균 활성물질로 분리한 HSC-8 subfraction을 GC-MS로 분석한 결과, GC chromatogram에서 14.26 분에 나타난 peak가 면적대비 97.9%로 추정되었으며(Fig. 3), Mass spectrum에서 m/z 202에서 M⁺ peak (base)가 검출되었고 주요 fragmentation으로 m/z 187, 173, 156 등이 검출되었다(Fig. 4).

Fig. 3.

GC chromatogram of HSC-8 subfraction.

Fig. 4.

Mass spectrum of HSC-8 subfraction.

HSC-8 subfraction을 CDCl₃용매로 용해시켜 NMR로 구조분석하였다.

¹H-NMR spectrum을 분석한 결과, aromatic 영역 δ 7.77 (dd, J = 1.1, 7.6 Hz), 7.66 (dd, J = 7.6, 8.4 Hz), 7.29 (dd, J = 0.9, 8.6 Hz)에서 vicinal trisubstituted aromatic ring, δ 6.74 (q, J = 1.6 Hz)에서 alkenyl proton, δ 4.01 (s)에서 methoxy protons, δ 2.14 (d, J = 1.4 Hz)에서 allylic methyl doublet이 관찰되어 methoxy기와 methyl기가 치환된 naphthoquinone 유도체로 추정되었다.

¹³C-NMR spectrum을 분석한 결과, 12개 carbon에 상응하는 peak가 검출되었으며 δ 15.8에서 methyl carbon peak가, δ 56.5에서 methoxy carbon peak가, δ 134.6, 134.4, 120.0, 117.7에서 methine carbon peak가, δ 185.8, 184.5에서 carbonyl carbon peak가, δ 159.4, 145.4, 137.9, 119.4 ppm에서 quaternary carbon peak 검출되었다.

¹H-NMR spectrum과 ¹³C-NMR spectrum을 분석한 결과 D. melanoxylon 목질부로부터 순수분리한 HSC-8 subfraction은 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone으로 구조 동정하였으며(Fig. 5), 이 화합물의 구조해석은 Okuyama et al. (1999)의 구조해석과 일치하였다.

Fig. 5.

Chemical structure of 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone isolated from the woody part of D. melanoxylon.

D. melanoxylon 목질부로부터 잿빛곰팡이병 원인균인 B. cinerea에 대한 항진균 활성을 나타낸 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone은 naphthoquinone계 유도체로서 대표적인 생리활성 천연물질인 plumbagin (5-hydroxy-methyl-1,4-naphthoquinone) 화합물의 5번 위치에 있는 hydroxy기가 methoxy기로 치환된 plumbagin methyl ether 화합물이다.

Tezuka et al. (1973)에 의해 D. melanoxylon로부터 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone 화합물이 처음으로 분리되어 구조해석되었다. 그밖에 지금까지 D. melanoxylon 식물체로부터 분리되어 구조해석된 naphthoquinone계 화합물로는 3,3′-bis[6-hydroxy-5-methoxy-2-methylnaphthoquinone] (Sidhu et al., 1973)과 4,11-Dihydroxy-5-methoxy-2,9-dimethyldinaphtho[1,2-b:2′,3′-d]furan-7,12-quinone (Sankaram et al., 1981)이 보고되었다.

5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone 화합물이 식물병원성 곰팡이균인 Alternaria tenuis, Helmin-thosporium spiceferum, Colletotrichum dematium, C. gloeosporioides에서 포자발아 억제활성이 보고되었다(Sankaram et al., 1975).

D. melanoxylon 목질부로부터 순수 분리한 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone 화합물의 잿빛곰팡이병 원인균인 B. cinerea에 대한 항진균 활성을 검정하기 위하여 균사생장 억제능실험을 진행하였다.

5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone의 최종농도가 0 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm 되도록 배지를 조성하여 배지 중앙에 고체배지에서 배양된 B. cinerea 병원균을 치상하고 25^oC incubator에서 4일간 배양 후 항진균 활성을 검정하였다(Fig. 6). 또한 항진균 활성에 대하여 EC₅₀ 값을 산출하였다(Table 1).

Fig. 6.

Antifungal activities at various concentrations of 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone isolated from the woody part of D. melanoxylon against mycelial growth of B. cinerea in vitro. (A) Control; (B) 1 ppm; (C) 5 ppm; (D) 10 ppm; (E) 50 ppm; (F) 100 ppm.

Table 1.

Effective concentration for 50% inhibition (EC50) of 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone against mycelial growth of B. cinerea in vitro

그 결과, 5-Methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone 화합물은 50 ppm 농도 이상에서 B. cinerea의 균사 생장을 억제하는 항진균 활성을 나타내었으며, EC₅₀ 값은 49.12 ppm으로 산출되었다.

따라서, D. melanoxylon 목질부에서 분리한 5-methoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone 잿빛곰팡이병균인 B. cinerea의 생장을 저해하는 활성물질 중 하나로 확인되었으며, 향후 추가적인 in vivo 방제 효과 검정 및 제형 연구가 수반된다면 잿빛곰팡이병 방제를 위한 친환경 천연물 유래 소재로서의 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

이해상충관계

저자는 이해상충관계가 없음을 선언합니다.

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