볏짚 사일리지에 대한 잔류농약 다성분 동시분석

시료의 조제

본 연구에 사용된 볏짚 사일리지는 경상북도와 경상남도 TMR사료 제조업체에서 2013년과 2015년에 곤포로 제조한 시료를 분양받아 사용하였다. 시료는 5 cm 정도로 세절하고 초저온 냉동(-60^oC)후 드라이아이스를 첨가하여 homogenizer(Artlon Gold Mix DA338-G, Korea)를 이용하여 균질화하고 분석 때까지 -20^oC에서 냉동보관하였다.

시험농약 및 시약

국내「사료 등의 기준 및 규격」(농식품부 고시 제2015-101호, 2015.8.21.) 자료를 참고하여 농식품부 상시관리대상 농약성분 중 사료 35 성분, 볏짚 26 성분과 국외 사료 및 볏짚 잔류농약허용기준을 조사하여 미국 44 성분, 일본 120 성분, CODEX 100 성분 및 농약원제 자체의 인축독성이 높은 농약(급성경구독성이 LD₅₀ 50 mg/kg b.w. 이하) 14 성분을 합하여 특수한 전처리를 해야 하는 성분을 제외하고 다성분 동시 분석이 가능할 것으로 판단되는 171 성분을 선정하였다.

분석과 stock solution 제조에 사용된 용매인 acetonitrile, acetone, dichloromethane, methanol 및 toluene은 Merck사 (Darmstadt, Germany)의 HPLC grade로 구입하여 사용하였다. Formic acid (>98% purity)와 ammonium acetate (99% purity)는 Sigma Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였으며, glacial acetic acid (100%)는 Merck사 (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 3차 증류수 제조장치는 Millipore사의 Milli-Q system (Bedford, USA)을 사용하였다.

QuEChERS 제품은 Agilent (San Francisco, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료추출단계는 Agilent QuEChERS Extract Kit AOAC 2007.01.(6 g MgSO₄, 1.5 g NaAcetate)와 Agilent QuEChERS Extract Kit EN 15662(4 g MgSO₄, 1 g NaCl, 1 g NaCitrate, 0.5 g disodium citrate sesquihydrate)을 사용하였으며, 정제단계는 Agilent QuEChERS Dispersive SPE 2 mL Drug Residues in Meat (150 mg MgSO₄, 25 mg C₁₈)와 Agilent QuEChERS Dispersive SPE 2 mL Fatty and wax (150mg MgSO₄, 50 mg C₁₈, 50 mg PSA)를 사용하였다.

표준용액 및 혼합표준용액 조제

분석에 사용한 표준품은 Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany)와 Wako (Osaka, Japan)사에서 구입하여 사용하였으며, 각각의 농약은 acetone과 acetonitrile을 이용하여 stock solution 1,000 μg/mL를 만들었다. 단, DDT 4종과 BHC 4종은 toluene, bitertanol은 dichloromethane을 이용하여 stock solution 1,000 μg/mL을 만들었다. Carbendazim은 methanol을 이용하여 stock solution 100 μg/mL으로 만들었으며, oxolinic acid는 0.25 M NaOH가 0.05% 함유된 methanol을 이용하여 100 μg/mL을 만들었다. Captan, carbaryl, chlorothalonil, cyfluthrin, methiocarb, phosphamidon, trichlorfon 및 trifloxystrobin은 acetonitrile에서 불안정한 화합물로 염기성 조건하에서 분해되기 쉽기 때문에 acetic acid가 0.4% 함유된 acetonitrile로 1,000 μg/mL을 만들었다(Mastovsaka, 2004). 각 농약을 혼합한 후, acetonitrile로 희석하여 50, 25, 12.5, 5, 2.5 및 1 μg/mL의 농약 첨가용 혼합표준용액을 제조하였다. 내부표준물질(internal standard, ISTD)은 atrazine D₅, linuron D₆ 및 pirimicarb D₆를 acetonitrile로 혼합하여 10 μg/mL로 제조하여 시료에 첨가하였고 triphenylphosphate는 formic acid가 0.5% 함유된 acetonitrile을 이용하여 2 μg/mL로 제조하여 QC 표준용액으로 사용하였다.

시료의 수분함량 측정

120^oC dry oven에 미리 칭량한 알루미늄 칭량병을 넣고 2 시간 가열한 뒤 데시케이터에 옮겨 실온에 도달할 때 무게를 칭량하였다. 칭량병의 무게가 변하지 않을 때까지 건조와 방냉을 반복한 뒤 분쇄한 시료를 칭량병에 넣고 무게를 칭량하여 같은 방법(식품공전, 2016)으로 칭량병과 시료의 무게가 변하지 않을 때까지 반복하여 다음과 같은 식으로 수분함량을 계산하였다.

전처리 방법

시료 3 g을 50 mL 원심분리튜브에 칭량하고 증류수 10 mL를 첨가하여 30분간 방치한 후 acetonitrile 10 mL와 내부표준물질 용액 100 μL를 첨가하였다. 샘플을 진탕기로 1시간 동안 진탕한 후 4 g MgSO₄, 1 g NaCl, 1 g trisodium citrate dihydrate 및 0.5 g disodium hydrogencitrate sesquihydrate를 넣고 손으로 1분간 흔들어 혼합한 후, 2분간 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 각각 1 mL의 상등액을 150 mg MgSO₄, 50 mg C₁₈ 및 50 mg PSA함유 정제튜브에 첨가하여 30초간 vortexing하고 10,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 2,4-D, dicamba, MCPA, haloxyfop, oxolinic acid 및 prohexadione와 같은 carboxylic acid의 작용기를 가진 농약은 PSA와 흡착되는 경향이 있으므로(Koesukwiwat et al., 2010), PSA가 함유되지 않은 150 mg MgSO₄ 및 25 mg C₁₈함유 정제튜브를 사용하였다. 2 mL vial에 상등액 400 μL, 2 μg/mL QC용액(triphenylphosphate) 40 μL 및 acetonitrile 40 μL을 넣어 LC-MS/MS용 시료 및 GC-MS/MS용 시료를 준비하였다.

Pymetrozine의 경우에는 위의 방법과 동일하나 시료추출 단계에서 6 g MgSO₄ 및 1.5 g NaOAc를 넣어 추출하였다.

기기분석 조건

분석에 사용한 LC는 Agilent Technologies사의 1200 series (USA), MS/MS는 AB Sciex사의 3200Qtrap (USA)를 사용하였고 데이터 처리는 Analyst 1.6.2 소프트웨어를 사용하였다. 이동상은 positive mode에서 precursor ion인 [M+H]⁺이온의 생성을 돕기 위해 formic acid와 [M+NH₄]⁺ 이온을 생성하는 몇가지 농약을 위해서 ammonium formate를 첨가하였고 negative mode에서는 precursor ion인 [M-H]⁻ 이온의 생성을 방해하지 않으면서 분석 성분이 비극성 컬럼에 머물 수 있도록 0.01% formic acid를 사용하였다(Kwon et al., 2011). Positive mode로 분석하는 농약성분의 경우 106 성분으로 농약 성분간의 방해를 피하기위해 3 group으로 나누어(Group 1 : 45 성분, Group 2 : 32 성분, Group 3 : 29 성분) 최소 20 ms의 각 이온쌍 체류시간을 확보하였고 scheduled MRM모드로 분석하였으며 분석조건은 Table 2, 3, 4와 같다.

Table 2.

Analytical conditions of LC-MS/MS with positive mode

Table 3.

Analytical conditions of LC-MS/MS with negative mode

Table 4.

Detection ions and retention time of pesticide ingredients for LC-MS/MS analysis

분석에 사용한 GC는 Agilent Technologies사의 7890B (USA), MS/MS는 7000C를 사용하였고 데이터 처리는 Mass Hunter^® Workstation acquisition 프로그램을 사용하였다. 시료주입은 programmable temperature vaporization (PTV) 주입기를 사용하여 열에 불안정한 성분의 회수율을 더 좋게 하고 시료 내에 존재하는 비휘발성 물질의 GC 컬럼내의 유입을 적게 하여 오염을 줄이고자 하였다(Ju et al., 2011). 이온화 방법은 electron impact ionization (EI) mode를 사용하였고 solvent delay time은 3분으로 설정하여 용매를 통과시켰으며 time segment를 사용하여 시간 별로 농약성분의 이온을 설정하여 효율을 높였다. 각 이온쌍 체류 시간을 적절하게 설정하여 최소 3 cycle/s 이상을 갖도록 총 129 성분을 지정하였으며 분석조건은 Table 5, 6과 같다.

Table 5.

GC-MS/MS operating condition for analysis

Table 6.

Detection ions and retention time of pesticide ingredients for GC-MS/MS analysis

농약이 검출되었을 때 LC-MS/MS와 GC-MS/MS를 이용한 중복 검증이 가능하도록 두 기기 모두에서 분석이 가능한 농약은 두 기기 모두에서 분석법을 검증하였다.

검량선 작성

동량의 농약 첨가용 혼합 표준용액, 3개의 내부표준물질 (atrazine D₅, linuron D₆, pirimicarb D₆) 및 0.5% formic acid가 함유된 acetonitrile을 혼합하여 농약은 0.1, 0.25, 0.5, 1.25, 2.5 및 5 μg/mL 농도로 조제하였으며, 각 농도당 내부 표준물질은 1 μg/mL 수준이 되도록 acetonitrile로 희석하여 혼합 검량선용 용액을 제조하였다. 제조한 용액 40 μL, 각각의 무처리 추출용액 400 μL 및 2μg/mL QC용액 (triphenylphosphate) 40 μL을 넣어 matrix matched standard solution을 제조하여 검량선을 작성하였다.

Matrix 영향 검증

3개의 각각 무처리 시료 추출용매를 이용하여 검량선 작성시 만든 matrix matched standard solution과 물을 시료로 하여 전처리한 추출용액으로 동일하게 제조한 reagent blank standard를 비교하여 matrix effect를 조사하였다.

Matrix effect 산출은 reagent blank standard의 피크 면적과 matrix matched standard의 피크 면적의 비교로 판단하며 다음과 같은 식으로 산출하였다.

회수율 실험

기기의 성능에 따라 감도의 차이가 있고 분석 농약마다 감도도 다르기 때문에 본 실험에서 사용한 기기상의 감도로 최대한 많은 농약이 EU 가이드라인(SANTE 11945/2015)의 잔류분석법 기준(회수율: 70~120%, RSD: ≤ 20%)을 만족할 수 있는 최저의 첨가농도를 정량한계(limit of quantitation, LOQ)로 정하였으며 LOQ를 기준으로 LOQ, 2.5LOQ 및 10LOQ 수준으로 회수율 실험을 진행하였다. 시료에 5, 12.5 및 50 μg/mL의 혼합표준용액을 각각 100 μL씩 첨가하여 각각 0.17, 0.425 및 1.7 μg/g의 첨가농도수준에서 회수율 실험을 실시하였다.

Matrix 영향 검증

Matrix matched standard와 reagent blank standard를 비교하여 matrix 영향을 산출한 결과 LC-MS/MS에서는 117 성분 중 44 성분이 0% ~ 20%, 38 성분이 20% ~ 50%였으며, 약 70%의 성분이 주로 0% ~ 50%의 수준으로 enhancement 되는 경향을 보였다. GC-MS/MS에서는 -50% ~ 0%와 0% ~ 50%의 수준의 농약 성분이 각각 54 성분, 55 성분으로 비슷한 양상을 보였으며 129 성분 중 약 84%였다. Matrix 영향 판단 시 ±20%의 수준은 영향이 미비한 수준이고, ±20 ~ 50%의 수준은 약간의 영향을 받는 수준이며, 그 이상은 matrix에 강한 영향을 받는 수준으로 평가한다(Niessen et al., 2006; Gwon et al., 2014). 따라서, 대부분의 성분이 -50% ~ 50%의 수준으로 볏짚의 matrix 영향을 받기 때문에 matrix matching이 필요할 것으로 판단된다(Fig. 1).

Fig. 1.

Matrix effect of rice straw silage in LC-MS/MS and GC-MS/MS.

표준 검량선 작성

정량분석을 위해 matrix matched standard를 조제하여 혼합표준곡선을 작성하였으며, 각 농약성분의 결정계수 R²은 최소 0.990 이상으로 양호하였다.

시료량 및 첨가 물량의 결정

7지역에서 채취한 볏짚 사일리지의 수분함량 측정 결과는 16.3 ~ 66.5% (Table 7)로 시료마다 편차가 심하였다. 가장 수분함량이 적은 7번 시료를 기준으로 50 mL 원심분리관을 사용하는 QuEChERS 분석이 가능하도록 시료의 양과 그에 따른 첨가해야 할 물의 양을 비교하였다(Fig. 2). 시료의 양은 3 g과 5 g을 칭량하여 비교하고 첨가해야 할 물의 양은 시료 3 g에 물 15 mL 첨가, 3 g에 물 10 mL 첨가, 그리고 5 g에 물 10 mL를 첨가하여 육안으로 비교하였다. 시료의 양은 시료의 수분함량이 매우 적어 50 mL 원심분리관에 5 g 칭량으로도 많은 부피를 차지하는 것을 확인할 수 있었다. 첨가해야 할 물의 양은 시료 3 g에 물 15 mL를 첨가하였을 때 물이 과다하여 시료와 물이 분리가 되었고, 시료 5 g에 물 10 mL를 첨가하였을 때는 물의 양이 적어서 시료 전체를 습윤화시키지 못하였으며 시료 3 g에 물 10 mL를 첨가하였을 때 적절하게 습윤화되었다. 따라서, 시료의 양은 3 g으로, 첨가해야 할 물의 양은 10 mL로 설정하였다.

Table 7.

Moisture content of rice straw samples

Fig. 2.

Comparison of the amount of rice straw and distilled water applied to the study (A: sample 3 g, B: sample 5 g, C: sample 3 g and distilled water 15 mL, D: sample 3 g and distilled water 10 mL, E: sample 5 g and distilled water 10 mL).

회수율 및 정량한계

회수율을 구하기 위하여 첨가한 내부표준물질 중 LC-MS/MS positive mode에서는 pirimicarb D₆, negative mode는 linuron D₆, GC-MS/MS는 atrazine D₅을 사용하여 회수율을 산출하였다. 각 농약 성분의 피크면적을 내부표준물질의 피크면적으로 나눈 면적비로 회수율을 산출하였으며 QC 용액(triphenylphosphate)은 정량에 이용하지 않았다.

분석 대상 농약성분 171 성분 중 LC-MS/MS에서 분석이 가능한 성분은 117 성분이었다. 첨가농도 0.17, 0.425 및 1.7 μg/g에서의 회수율은 52.8~129.0%였으며 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 모든 성분에서 30% 미만이었다(Table 8). 세 농도 수준 모두 회수율 70~130%와 상대표준편차 30% 이하를 만족하는 농약성분은 114 성분이었으며 GC-MS/MS와 중복되는 농약을 제외하고는 39 성분이었다. Clofentezine, dichlorvos, quinoclamine 및 trichlorfon은 감도가 낮아 LOQ 수준에서는 기기상으로 검출 되지않았으며, 특히 quinoclamine은 2.5LOQ 수준에서도 정량이 되지 않았다.

Table 8.

Recoveries and RSDs of pesticide ingredients at three spiking levels by LC-MS/MS

분석 대상 농약성분 171 성분 중 GC-MS/MS MRM 조건을 설정한 농약은 129 성분으로, 첨가농도 0.17, 0.425 및 1.7 μg/g에서의 회수율은 30.6~129.0%였고, 상대표준편차는 isotianil이 24.3%로 가장 높았으며 나머지는 모두 20% 이하였다(Table 9). 세 농도 수준에서 127~128개의 성분이 다성분 동시분석 회수율 70~130%와 상대표준편차 30% 이하를 만족하였다. 세 농도 수준에서 3개 시료 모두 회수율 70~130%와 상대표준편차 30% 이하를 만족하는 농약성분의 수는 127 성분이었으며 LC-MS/MS와 중복되는 농약을 제외하고는 52 성분이었다. 그러나 침투성 약제인 probenazole은 30.6~53.1%의 낮은 회수율을 보였는데 probenazole은 극성이 다소 높아 LC로 분석하기에 적합하나 GC에서는 재현성이 저조하였던 것으로 판단되었다.

Table 9.

Recoveries and RSDs of pesticide ingredients at three spiking levels by GC-MS/MS

분석 대상 농약 성분 171 성분 중 식품공전상 가이드라인 수준인 회수율 70~130%, RSD 30% 이하를 벗어나는 성분은 probenazole, quinoclamine, silafluofen, thiabendazole, tiadinil으로 총 5성분 이었다.

5성분 중 세 농도 수준 모두 가이드라인을 벗어나는 probenazole을 제외하고 quinoclamine은 1.7 μg/g 수준에서 68.6%, thiabendazole은 0.17 및 0.425 μg/g 수준에서 각각 63.6% 및 66.0%, silafluofen은 0.425 μg/g 수준에서 68.1%으로 약간 낮은 회수율을 보였으나 나머지 농도 수준에서는 회수율과 상대표준편차 가이드라인을 만족하여 본 분석방법의 적용이 가능할 것으로 판단된다. 또한 tiadinil의 경우 가장 낮은 LOQ 수준인 0.17 μg/g 수준에서 52.8%의 회수율을 보였으나 국내 사료용 볏짚의 잔류농약 허용기준이 15 ppm으로 높게 설정되어 있으므로 본 분석 방법을 적용할 수 있을 것으로 보인다. 추가적으로 EU 가이드라인(SANTE 11945/2015)의 잔류분석법 기준(회수율: 70~120%, RSD: ≤ 20%)을 벗어나는 농약은 famoxadone, isotianil, methoxy-fenozide, oxolinic acid, parathion-ethyl, triadimenol로 famoxadone을 제외한 대부분의 농약이 높은 LOQ 수준에서 120% 이상의 회수율을 보였다. 그러나 식품공전상 다성분 분석 기준(회수율: 70~130%, RSD: ≤ 30%)은 만족하므로 국내 사료용 볏짚의 잔류농약 모니터링 목적으로는 적용할 수 있을 것으로 판단된다.

Pymetrozine은 citrate buffer로 추출하였을 때 36.4~47.9%의 낮은 회수율을 보였으나, citrate buffer 대신 acetate buffer를 사용하여 추출하였을 때 73.9~91.0%의 높은 회수율을 보였다. Pymetrozine은 QuEChERS 전처리 방법을 사용할 때 pH에 따라 회수율이 달라지는 농약으로 citrate buffer를 사용했을 때 회수율이 70% 미만이어서 주로 AOAC 2007.01법을 이용하고 있다(EURL-SRM, 2016). Pymetrozine은 pH 5를 초과할 때 회수율이 70% 이상을 보이므로 pH를 높이기 위하여 citrate buffer를 acetate가 함유된 NaOAC나 MgOAC로 대체하여 추출을 한 결과 회수율이 개선되었다(EURL-SRM, 2016). 이는 pymetrozine의 회수율 시험시 acetic acid가 1% 함유된 acetonitrile을 사용해야 하는 AOAC 2007.01법으로 하지 않아도 추출단계에서 acetate buffer만 이용하면 70% 이상의 양호한 회수율을 얻을 수 있다고 판단되었다.

2016년 7월 1일에 고시된「사료 등의 기준 및 규격」에서 볏짚의 잔류허용기준을 조사한 결과 carbaryl, diazinon 및 phorate은 잔류허용기준이 0.05였으나, 본 실험의 첨가농도는 가장 낮은 농도가 0.17 μg/g으로써 잔류허용기준보다 높았다. 그러나 세 성분 모두 회수율이 확보되었으므로 본 실험에서 사용된 기기보다 고감도의 기기를 사용한다면 분석이 가능할 것으로 보인다.