환경생물독성시험에서 사용되는 Reference Chemical의 대체가능성 연구
초록
담수어류 급성독성시험과 꿀벌 급성독성시험에 사용되는 대조물질 중 사용금지 물질로 지정된 PCP-Na와 dimethoate를 대체할 수 있는 물질을 찾고자 국내 7개 시험기관이 참여하여 ring test를 실시하였다. 대체 가능물질로 담수어류 급성독성시험에 copper(II) sulfate와 3,5-dichlorophenol, 꿀벌 급성독성시험에 carbaryl과 phenthoate를 선정하였다. 선정한 물질을 사용하여 잉어, 미꾸리, 송사리에 대한 급성독성시험과 꿀벌에 대한 급성섭식 및 급성접촉 독성시험을 실시하였다. 시험 결과, 잉어에 대한 48시간 LC50값은 3,5-dichlorophenol에서 0.992~3.024 mg/L, Copper(II) sulfate에서 0.10~0.312 mg/L이었고, 미꾸리에 대한 48시간 LC50값은 3,5-dichlorophenol에서 1.659~3.200 mg/L, copper(II) sulfate에서 0.28~1.094 mg/L이었으며, 송사리에 대한 48시간 LC50값은 3,5-dichlorophenol에서 2.04~2.834 mg/L, copper(II) sulfate에서 0.77~1.987 mg/L이었다. 꿀벌섭식에 대한 48시간 LD50값은 carbaryl에서 0.185~0.916 μg a.i./bee, phenthoate에서 0.168~0.915 μg a.i./bee이었고, 꿀벌접촉에 대한 48시간 LD50값은 carbaryl에서 0.141~0.507 μg a.i./bee, phenthoate에서 0.038~0.113 μg a.i./bee로 나타났다. 각 시험기관의 시험결과를 이용하여 독성 수준과 신뢰성을 검토한 결과, 대조물질로 사용 가능한 물질로써 담수어류 급성독성시험에 3,5-dichlorophenol과 copper(II) sulfate, 꿀벌 급성독성시험에 phenthoate가 적합하다고 판단하였다.
Abstract
The ring test was conducted in seven laboratories in order to find a substitute for PCP-Na and dimethoate, which are used a reference chemical in the fish acute toxicity test and honeybee acute toxicity test. Copper(II) sulfate and 3,5-dichlorophenol were selected as substitutes for the acute toxicity test of fish, and carbaryl and phenthoate were selected for the honeybee acute toxicity test. Acute toxicity testing of these chemicals were conducted on carp, ricefish, muddy loach and honeybee. The results showed that 48-h LC50 values for carp were 0.992~3.024 mg/L of 3,5-dichlorophenol and 0.10~0.312 mg/L of copper(II) sulfate, 48-h LC50 values for muddy loach were 0.992~3.024 mg/L of 3,5-dichlorophenol and 0.28~1.094 mg/L of copper(II) sulfate, 48-h LC50 values for ricefish were 2.04~2.834 mg/L of 3,5-dichlorophenol and 0.77~1.987 mg/L of copper(II) sulfate, 48-h LD50 values for honeybee oral test were 0.185~0.916 μg a.i./bee of carbaryl and 0.168~0.915 μg a.i./bee of phenthoate, 48-h LD50 values for honeybee contact test were 0.141~0.507 μg a.i./bee of carbaryl and 0.038~0.113 μg a.i./bee of phenthoate. As a result of examine the toxicity level and the reliability using the test results of each laboratory, 3,5-dichlorophenol and copper(II) sulfate were found to be suitable as a reference chemical for the fish acute toxicity test, and phenthoate was suitable for honeybee acute toxicity test.
Keywords:
reference chemical, acute toxicity, PCP-Na, dimethoate키워드:
대조물질, 급성독성서론
농약 및 화학물질의 안전성을 평가하기 위해 실시하는 환경생물에 대한 독성시험법에서는 시험생물의 민감성과 시험방법의 적합성을 판단하기 위하여 독성값이 알려진 대조물질(reference chemical)을 사용한 양성대조물질시험을 실시하도록 명시되어 있다. 이러한 대조물질은 OECD, 국립환경과학원, 농촌진흥청의 시험법에서 추천하고 있다. 그러나 추천 물질 중 어류급성독성시험에 사용되는 pentachlorophenol sodium salt (PCP-Na)와 꿀벌급성독성시험에 사용되는 dimethoate는 유독물질 및 금지물질로 지정되어 사용과 취급이 제한되었다. 따라서 이러한 물질을 사용하기 위해서는 안전한 취급시설이 필요하며, 지속적으로 독성시험에 사용할 경우에는 실험자의 안전에 문제가 발생할 수 있으므로 대체하여 사용할 수 있는 물질에 대한 검토가 필요하다.
본 연구에서는 인체 유해성이 높은 기존의 대조물질을 대신하여 실험자에게 보다 안전하면서 대조물질로써 적합한 물질을 탐색하기 위해 연구를 진행하였다. 시험에 사용된 물질은 국내외 시험가이드라인에서 대조물질로 제시되어 있는 물질과 독성자료를 검색하여 선택하였다. 현재 국내외 시험법에서 제시되어 있는 대조물질은 수서생물을 이용한 독성시험에는 pentachlorophenol sodium salt (PCP-Na), potassium dichromate, 3,5-dichlorophenol, copper(II) sulfate 등이 있고 육상생물인 꿀벌과 지렁이를 이용한 독성시험에는 dimethoate, choroacetamide, cabendazim, benomyl 등이 있다(Table 1). 제시된 물질 중 담수어류 급성독성시험에 적용 가능한 대조물질로 3,5-dichlorophenol (OECD, 2011; NIER, 2015b)과 copper(II) sulfate (MOE-Japan, 2003; MAFF-Japan, 2016)를 선정하였으며, 꿀벌 급성독성시험에는 농약 원제의 독성자료를 검토하여 carbaryl과 phenthoate를 선정하였다. 시험생물은 담수어류종인 잉어(Cyprinus carpio), 송사리(Oryzias latipes), 미꾸리(Misgurinus anguillicaudatus)를 사용하였으며, 꿀벌은 서양종의 꿀벌(Apis mellifera)을 사용하였다.
Reference chemicals in ecotoxicity test
대체가능한 후보물질에 대한 독성시험 결과를 분석하고 수행과정에 대한 객관적인 검토를 위하여 GLP 지정을 받은 국내 7개 시험기관이 동시에 참여하는 ring test 방식으로 진행하였다. 본 연구는 2017년 2월부터 10월까지 진행되었으며, 각 시험기관에서는 OECD 가이드라인과 국내 시험기준과 방법에 따라 동일한 조건에서 수행하였다. 각 시험기관에서 획득한 시험결과에 대해서 통계분석하여 독성값의 수준과 결과의 신뢰성을 검토하였다. 또한 각 시험기관에서 시험수행 중 시험물질에 대한 특성과 문제점 등에 대한 의견을 파악하여 대체물질로써 가능성을 판단하고자 하였다.
재료 및 방법
참여 시험기관
Ring test에 참여한 시험기관은 한국삼공㈜ 농업연구소, 한국화학융합시험연구원, ㈜경농 중앙연구소, ㈜한국생물안전성연구소, ㈜에이비솔루션, ㈜크로엔, 호서대학교 안전성평가센터로 7개 시험기관이며, 모든 시험기관은 환경생물독성분야 또는 환경유해성시험분야의 GLP 시험 지정기관이다.
Ring test를 위한 시험물질
담수어류 급성독성시험에 사용된 시험물질은 3,5-dichlorophenol과copper(II) sulfate를 사용하였으며, 꿀벌 급성독성 시험에는 carbaryl과 phenthoate를 시험에 사용하였다. 담수어류 급성독성시험에 사용된 시험물질들은 OECD 가이드라인, 일본 화심법의 시험법, 국립환경과학원 고시, 농촌진흥청 고시에서 추천된 대조물질 중 선택하였으며, 꿀벌 급성독성시험에 사용된 시험물질은 농약 원제에 대한 꿀벌 독성자료를 검토하여 대체물질로 가능성이 높은 물질을 선택하였다.
시험생물
담수어류 급성독성시험에는 잉어(Cyprinus carpio), 송사리(Oryzias latipes), 미꾸리(Misgurinus anguillicaudatus)를 사용하였고 꿀벌 급성접촉 및 섭식 독성시험에는 서양종의 꿀벌(Apis mellifera)을 사용하였다.
시험방법
담수어류 급성독성시험은 OECD 가이드라인(OECD, 1992), 국립환경과학원 고시(NIER, 2015a), 농촌진흥청 고시(RDA, 2016a)의 시험기준과 방법에 따라 실시하였으며, 꿀벌 급성(접촉, 섭식)독성시험은 OECD 가이드라인(OECD, 1998a; 1998b) 및 농촌진흥청 고시(RDA, 2016b; 2016c)의 시험기준과 방법에 따라 실시하였다. Ring test는 2017년 2월부터 10월까지 각 시험기관의 SOP에 따라 수행하였다.
Participating institutes & testing scopes for ring test
결과 및 고찰
담수어류 급성독성시험의 ring test 결과
본 연구에 참여한 7개 시험기관의 시험결과를 각 시험물질에 대하여 시험생물별로 수집하여 통계처리하였다. 각 시험기관에서 수집된 결과값의 극단점의 영향을 배제하고 정성적인 평가를 위해 전체 LC50값 중 최소값과 최대값을 제외한 후 평균(Mean)과 표준편차(SD)를 계산하였다.
3,5-dichlorophenol에 대한 담수어류인 잉어에 대한 급성독성시험 결과, 48시간 LC50값이 0.992~3.024 mg/L, 96시간 LC50값이 0.992~2.654 mg/L 수준으로 나타났다(Table 3).
Acute toxicity of 3,5-dichlorophenol to Cyprinus carpio
Table 3에서 3,5-dichlorophenol에 대한 잉어의 48시간 LC50값의 평균과 표준편차는 1.841 ± 0.394이었으며, 96시간 LC50값의 평균과 표준편차는 1.762 ± 0.368이었다. 전체 LC50값의 71.4% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 1).
Distribution of LC50 values of 3,5-dichlorophenol to Cyprinus carpio in 7 testing institutes (A: 48h-LC50, B: 96h-LC50).
3,5-dichlorophenol에 대한 담수어류인 송사리에 대한 급성독성시험 결과, 48시간 LC50값이 2.04~2.834 mg/L, 96시간 LC50값이 2.00~2.570 mg/L 수준으로 나타났다(Table 4).
Acute toxicity of 3,5-dichlorophenol to Oryzias latipes
Table 4에서 3,5-dichlorophenol에 대한 송사리의 48시간 LC50값의 평균과 표준편차는 2.352 ± 0.087이었으며, 96시간 LC50값의 평균과 표준편차는 2.114 ± 0.058이었다. 전체 LC50값의 80.0% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD (95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 2). 그리고 EPA ECOTOX database의 독성 자료에서 3,5-dichlorophenol에 대한 송사리의 96시간 LC50값이 2.3 mg/L로 조사되었으며, ring test 결과와 유사하였다.
Distribution of LC50 values of 3,5-dichlorophenol to Oryzias latipes in 3 testing institutes (A: 48h-LC50, B: 96h-LC50).
3,5-dichlorophenol에 대한 담수어류인 미꾸리에 대한 급성독성시험 결과, 48시간 LC50값이 1.659~3.200 mg/L, 96시간 LC50값이 1.641~3.200 mg/L 수준으로 나타났다(Table 5).
Acute toxicity of 3,5-dichlorophenol to Misgurnus anguillicaudatus
Table 5에서 3,5-dichlorophenol에 대한 미꾸리의 48시간 LC50값의 평균과 표준편차는 2.086 ± 0.138이었으며, 96시간 LC50값의 평균과 표준편차는 2.034 ± 0.143이었다. 전체 LC50값의 83.3% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 3).
Distribution of LC50 values of 3,5-dichlorophenol to Misgurnus anguillicaudatus in 6 testing institutes (A: 48h-LC50, B: 96h-LC50).
Copper(II) sulfate에 대한 담수어류인 잉어에 대한 급성독성시험 결과, 48시간 LC50값이 0.10~0.312 mg/L, 96시간 LC50값이 0.08~0.189 mg/L 수준으로 나타났다(Table 6).
Acute toxicity of copper(II) sulfate to Cyprinus carpio
Table 6에서 잉어에 대한 48시간 LC50값의 평균과 표준편차는 0.159 ± 0.047이었으며, 96시간 LC50값의 평균과 표준편차는 0.129 ± 0.039이었다. 전체 LC50값의 73.3% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 96.7%가 해당되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 4). 그리고 EPA ECOTOX database의 독성 자료에서 copper(II) sulfate에 대한 잉어의 48시간 LC50값이 0.110~0.312 mg/L, 96시간 LC50값이 0.09~0.237 mg/L로 조사되었으며, ring test 결과와 유사하였다.
Distribution of LC50 values of copper(II) sulfate to Cyprinus carpio in 7 testing institutes (A: 48h-LC50, B: 96h-LC50).
Copper(II) sulfate에 대한 담수어류인 송사리에 대한 급성독성시험 결과, 48시간 LC50값이 0.77~1.987 mg/L, 96시간 LC50값이 0.50~1.422 mg/L 수준으로 나타났다(Table 7).
Acute toxicity of copper(II) sulfate to Oryzias latipes
Table 7에서 송사리에 대한 48시간 LC50값의 평균과 표준편차는 1.030 ± 0.317이었으며, 96시간 LC50값의 평균과 표준편차는 0.564 ± 0.051이었다. 전체 LC50값의 80.0% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 5). 그리고 EPA ECOTOX database의 독성 자료에서 copper(II) sulfate에 대한 송사리의 48시간 LC50이 0.80~1.987 mg/L, 96시간 LC50값이 0.50~1.167 mg/L로 조사되었으며, 일본 화심법(MOE-Japan, 2003)에 제시된 송사리 96시간 LC50값은 0.45~0.93 mg/L로 ring test 결과와 유사하였다.
Distribution of LC50 values of copper(II) sulfate to Oryzias latipes in 3 testing institutes (A: 48h-LC50, B: 96h-LC50).
Copper(II) sulfate에 대한 담수어류인 미꾸리에 대한 급성독성시험 결과, 48시간 LC50값이 0.28~1.094 mg/L, 96시간 LC50값이 0.11~0.478 mg/L 수준으로 나타났다(Table 7).
Table 8에서 잉어의 48시간 LC50값의 평균과 표준편차는 0.415 ± 0.084이었으며, 96시간 LC50값의 평균과 표준편차는 0.133 ± 0.060이었다. 전체 LC50값의 75.0% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 95.8%가 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 6).
Acute toxicity of copper(II) sulfate to Misgurnus anguillicaudatus
Distribution of LC50 values of copper(II) sulfate to Misgurnus anguillicaudatus in 7 testing institutes (A: 48h-LC50, B: 96h-LC50).
Table 6, 7, 8에서 copper(II) sulfate에 대한 어류(잉어, 송사리, 미꾸리)의 LC50값은 노출 시간이 지남에 따라 어류에 대한 독성이 점차 증가하는 경향으로 나타났다. 이러한 경향으로 48시간과 96시간의 독성값의 차이를 보였으나, 실험반복간의 편차는 크지 않았다.
꿀벌 급성독성시험의 ring test 결과
꿀벌 급성독성시험은 본 연구에 참여한 7개 시험기관 중 3개 시험기관에서 수행하였으며, 시험결과를 시험물질별로 수집하여 통계처리하였다. 각 시험기관에서 산출된 LD50값 중 최소값과 최대값을 제외한 후 평균과 표준편차를 계산하였다.
Carbaryl에 대한 꿀벌 급성섭식독성시험 결과, 24시간 LD50값이 0.197~0.971 μg a.i./bee, 48시간 LD50값이 0.185~0.916 μg a.i./bee 수준으로 나타났다(Table 9). 시험과정에서 꿀벌에 공급하기 위한 시험용액 조제과정에서 자당용액에 완전히 용해가 안되어 유기용매를 사용하였으며, 섭식 처리 과정에서 꿀벌의 섭식 거부현상이 나타나는 문제점이 발생하였다. 이러한 문제점으로 인해 시험결과의 실험오차가 비교적 크게 나타난 것으로 판단된다.
Acute oral toxicity of carbaryl to Apis mellifera
Table 9에서 carbaryl에 대한 꿀벌섭식의 24시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.345 ± 0.214이었으며, 48시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.297 ± 0.138이었다. 전체 LD50값의 87.5% 정도가 2SD (95% 신뢰도) 범위에 포함되어 신뢰수준은 비교적 낮게 나타났다(Fig. 7).
Distribution of oral LD50 values of carbaryl to Apis mellifera in 3 testing institutes (A: 24h-LD50, B: 48h-LD50).
Carbaryl에 대한 꿀벌 급성접촉독성시험 결과, 24시간 LD50값이 0.141~0.327 μg a.i./bee, 48시간 LD50값이 0.141~0.507 μg a.i./bee 수준으로 나타났다(Table 10).
Acute contact toxicity of carbaryl to Apis mellifera
Table 10에서 carbaryl에 대한 꿀벌접촉의 24시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.250 ± 0.055이었으며, 48시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.242 ± 0.055이었다. 전체 LD50값의 75% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 8). 그리고 The pesticide manual (2012)의 꿀벌독성 정보에서 carbaryl에 대한 꿀벌섭식독성은 48시간 LD50값이 0.21 μg a.i./bee로 ring test 결과와 편차범위내에서 유사하였으며, 접촉독성의 48시간 LD50값은 0.14 μg a.i./bee로 실제 ring test 결과에서 높은 수준으로 나타났다.
Distribution of contact LD50 values of carbaryl to Apis melifefa in 4 testing institutes (A: 24h-LD50, B: 48h-LD50).
Phenthoate에 대한 꿀벌 급성섭식독성시험 결과, 24시간 LD50값이 0.206~1.163 μg a.i./bee, 48시간 LD50값이 0.168~0.915 μg a.i./bee 수준으로 나타났다(Table 11).
Acute oral toxicity of phenthoate to Apis mellifera
Table 11에서 phenthoate에 대한 꿀벌섭식의 24시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.326 ± 0.137이었으며, 48시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.267 ± 0.057이었다. 전체 LC50값의 75% 이상이 1SD에 포함되었으며, 2SD (95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 9).
Distribution of oral LD50 values of phenthoate to Apis mellifera in 3 testing institutes (A: 24h-LD50, B: 48h-LD50).
Phenthoate에 대한 꿀벌 급성접촉독성시험 결과, 24시간 LD50값이 0.045~0.116 μg a.i./bee, 48시간 LD50값이 0.038~0.113 μg a.i./bee 수준으로 나타났다(Table 12).
Acute contact toxicity of phenthoate to Apis mellifera
Table 12에서 phenthoate에 대한 꿀벌접촉의 24시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.081 ± 0.012이었으며, 48시간 LD50값의 평균과 표준편차는 0.075 ± 0.015이었다. 전체 LC50값의 85.7%가 1SD에 포함되었으며, 2SD(95% 신뢰도) 범위에는 모든 LC50값이 포함되어 신뢰수준이 95% 이상으로 나타났다(Fig. 10). 그리고 The pesticide manual(2012)의 꿀벌독성 정보에서 phenthoate에 대한 꿀벌섭식독성은 48시간 LD50값이 0.115 μg a.i./bee로 ring test 결과에서 높게 나타났으며, 꿀벌접촉독성의 48시간 LD50값은 0.069 μg a.i./bee로 편차범위내에서 유사하였다.
Distribution of contact LD50 values of phenthoate to Apis mellifera in 4 testing institutes (A: 24h-LD50, B: 48h-LD50).
본 연구에서 각 시험기관의 시험결과를 비교하여 대체물질 가능성을 검토한 결과, 담수어류 급성독성시험의 대조물질로는 3,5-dichlorophenol과 copper(II) sulfate에서 시험어종인 송사리. 잉어. 미꾸리에 대한 독성값(LC50)의 재현성이 있고 시험과정에서도 오차 발생 가능성이 낮아 대체물질로 적합하다고 판단하였다. 꿀벌 급성독성시험의 대조물질로는 phenthoate에서 꿀벌 접촉 및 섭식 독성값(LD50)의 재현성 높고 물질 조제 및 처리 과정에서도 실험오차의 발생 가능성이 낮아 대체물질로 적합하다고 판단하였다. 그리고 시험기관에 따라 일부 생물종에 대한 결과값 중 편차가 큰 경우가 있었다. 이러한 결과값의 편차는 주기적이고 반복적인 실험을 통하여 줄일 수 있으며, 지속적으로 독성자료를 축적한다면 신뢰성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.
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