꿀벌 반야외시험법을 활용한 carbaryl 수화제 독성평가

터널 및 시험 디자인

9동의 망사터널을 국립농업과학원(NAS)(35°49'40.7 "N, 127°02'44.9"E) 야외 포장에 설치하였다. 각 터널은 길이 14m, 폭 5 m, 높이 3 m이었고 너비가 3 mm 이하인 망사로 씌었다. 시험작물은 꿀벌 화분활동에 적합하며 국내에서 흔히 볼 수 있는 유채꽃으로 선정하였다. 유채꽃 씨앗은 2016년 10월에 파종하였으며 시험 농약 처리 시점에 만개하였고 약 1 m의 높이로 자랐다. 터널은 총 9동으로 배치하였고 각 처리군마다 3반복을 수행하도록 하였다. 각 처리군은 무처리군, 양성대조군, 시험물질 처리군으로 구성되었다. 죽은 벌의 수집이 용이하게 땅을 고르게 하고 터널의 앞, 뒤, 중간에 길을 만들어 흰 부직포로 덮어주었다. 꿀벌에게 물을 공급하기 위해 각 터널 안에 수조를 배치하였고 농약 살포 시에는 수조를 터널 밖에 꺼내두었다. 무처리군은 수돗물을, 양성대조군은 diflubenzuron 수화제 25%, 시험물질은 carbaryl 수화제 50%를 사용하였다. 무처리군은 꿀벌 비행활동이 활발한 시간에 수돗물(400 L/ha)을 살포하였다. 양성대조군은 diflubenzuron 수화제 25% (800 g a.i./ha in 400 L tap water/ha)를 살포하였다. 시험물질 처리군은 carbaryl 수화제 50% (250 g a.i./ha in 400 L tap water/ha)를 살포하였다. 살포자는 수동식 압축 농약 분무기를 사용하였고(DIA sprayer 7560, Furupia, Japan) 시험작물에 고르게 농약이 살포되도록 충분한 연습을 하였다. 꿀벌의 치사 개체 수, 비행활동, 봉군 상태, 난 유충 발육도를 28일의 시험기간 동안 평가하였다.

기후 조건

시험기간 동안 시험포장과 1 km 떨어진 국립농업과학원 내의 기상 관측소의 온도, 상대습도, 강우량 데이터를 매일 기록하였다.

봉군 준비

시험에 사용할 봉군은 약 7000~9000마리의 건강하고 상태가 좋은 벌을 양봉농가에서 구입하여 사용하였다. 각 봉군은 3개의 산란판, 1개의 봉판, 1개의 먹이판으로 구성하였다. 각 벌통 입구에 dead bee trap을 설치하였다. 시험 시작 한 달 전부터 약제 및 화학물질 처리를 금지하였고 시험물질 살포 최소 3일 전부터 터널에 입식하여 터널환경에 적응하도록 하였다.

꿀벌 및 번데기 치사 개체 수

죽은 일벌은 벌통 앞, 터널 중간, 앞, 뒤 시트와 dead bee trap에서 수집하였다. 죽은 번데기는 dead bee trap 및 벌통 앞에서 수집하였다. Table 1에 제시된 일정에 따라 시험을 수행하였다.

Table 1.

Evaluation of mortality of honey bees

비행활동

꿀벌 비행활동은 터널 내 3개의 1 m² 구획을 지정하여 관찰하였다. Table 2에 제시된 일정에 따라 화분매개 활동하는 벌과, 꽃 주위를 날아다니는 벌 개체 수를 짧은 시간 동안(예: 10-15초) 측정하였다.

Table 2.

Evaluation of flight activity

봉군 상태

봉군의 상태는 농약 처리 전과 처리한 후 5번(BFD +5, +10, +16, +22, +28)에 걸쳐 평가하였다. 평가항목은 봉군의 세력(각 봉군당 소비판에 붙어있는 벌들의 수), 건강한 여왕벌의 존재, 각 소비판의 산란영역, 화분 및 먹이 영역(각 소비 면적에 대한 비율)이었다(Chon et al., 2017).

산란 평가(Brood assessment)

시험기간 동안 각 봉군당 지정된 200개의 알(egg)을 포토박스를 이용하여 관찰하였다. 난 유충 발육도를 평가하기 위해 처음 지정한 구역을 BFD 0으로 지정하였다. 하나의 표시된 셀의 난 유충 발육단계를 평가하기 위해 0에서 5의 점수를 부여하였다. 지정된 소비판 촬영은 BFD +5, +10, +16, +22일에 수행하였다. 평가일 별 예상 산란 단계는 Table 3에 나타내었다.

Table 3.

Expected brood stage at each assessment day for eggs at BFD 0

포토박스(Photobox)

포토박스는 선행연구에 제시한 방법(Jeker et al., 2012)을 참고하여 제작하였으며 상세한 사항은 Chon et al. (2017)에 묘사하였다. 포토박스 크기는 1.2 × 0.6 × 1.5 m (L ×W× H)이고 소비판 홀더가 있어서 소비판을 고정할 수 있다. AF-S NIKKOR 18-105 mm 1:3.5-5.6G ED 렌즈가 있는 NIKON D300S 카메라를 이용하여 소비판을 촬영하였다. 카메라는 exposure time 1/6s, F-number F/4.8, aperture 4.5, ISO 200, focal length 52 mm로 설정하였다. 소비판 이미지는 컴퓨터로 옮겨 Microsoft PowerPoint 2010로 분석하였다. BFD 0일에 200개의 알을 원모양의 셀로 지정하였다. 처음 촬영한 사진(BFD 0)에서 지정된 200개의 셀을 그룹으로 설정한 후 다음 지정 관측일 날에 촬영한 소비판 이미지 위에 겹쳐놓아 셀 분석을 수행하였다.

Brood termination rate (BTR)

BTR은 다음과 같이 계산하였다

BTR = (관측일자에 예상 난 유충 발달단계에 도달하지 못한 셀의 수/관찰한 셀의 총 수) × 100

Brood index (BI) and compensation index (CI)

BI는 난 유충 발달의 지표이며 봉군마다 각 BFD 평가일에 계산을 하였다. 평가 일정에 예상되는 발달 단계에 도달한 셀은 1부터 5점까지 점수를 부여하였다. 난 유충 셀이 정상 발달 단계에 도달하지 못했거나 BFD +5일에서 +16일동안 먹이가 셀(BFD 0일에 알인 경우)에 저장되어 있다면, 다시 셀이 산란에 이용되는 여부와 상관없이, 평가일과 평가일 이후에도 0점 처리하였다. 봉군의 BI는 BFD 일자 별로 평가된 셀의 값을 모두 합한 후 관찰된 셀의 수로 나누어 구하였다.

CI는 봉군 회복의 지표이며 각 BFD 평가일에 계산하였다. 셀은 평가일에 확인된 성장단계만을 토대로 1부터 5점까지 점수를 부여하였다. BI와 달리 셀이 정상 발달단계에 도달하지 못해도 셀 안에 산란이 있으면 점수를 부여하였다. 봉군의 CI는 같은 BFD 일자에 평가된 셀의 값을 모두 합한 후 관찰된 셀의 수로 나누어 구하였다.

통계

통계분석은 IBM SPSS을 사용하였다. 데이터는 Shapiro-Wilk’s test을 사용하여 정규분포를, Levene’s test을 사용하여 등분산 검정을 하였다. Dunnett’s t-test을 사용하여 치사율(>control), 비행활동(<control), BTR (>control), BI (<control) 그리고 CI (<control)을 비교하기 위해 다중비교(α = 0.05)를 수행하였다.

기후 조건

시험기간 동안 온도, 상대습도, 강수량을 Table 4에 나타내었다. 농약 살포일로부터 7일간 터널 내 농약 노출기간 동안 평균 기온은 12.1℃~16.9℃ 였고 낮에는 20℃가 넘는 따뜻한 날씨를 유지하여 꿀벌의 비행활동이 활발하였다. 시험기간 동안 총 8회의 비가 내렸고 농약 살포 후 3일에 소량(0.5 mm)의 비가 내렸다. 터널 밖 시험기간인 농약 살포 후 8일부터 26일까지는 3회의 비가 내렸고 비가 내린 5월 9일, 10일을 제외하고는 낮 기온은 20℃가 넘었고 최고 28℃ 까지 따뜻한 날씨를 유지하였다.

Table 4.

Data on the climatic conditions during the experimental period

꿀벌 및 번데기 치사 개체 수

Table 5는 무처리군, 양성대조군, carbaryl 수화제 처리군에서 꿀벌 치사 개체 수를 나타낸다. 농약 살포 전 3일 동안 꿀벌 치사 개체 수는 세 처리군 모두 통계적으로 유의한 차이가 없어서 처리 전 조건이 비슷했음을 알 수 있었다. Carbaryl 수화제 처리군에서 약제 살포 후 3일 동안은 무처리군에 비해 많은 수의 치사 개체 수가 발생하였지만 살포 후 4일부터는 무처리군과 치사 개체수가 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이는 carbaryl 수화제의 안전방사기간이 5일인 것과 비교했을 때 예측 가능한 결과라고 할 수 있다. 반면 양성대조군의 꿀벌 치사 개체 수는 무처리군과 비교할 때 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 이는 2016년 수행한 반야외시험 양성대조군 diflubenzuron 처리군과 비슷한 결과이다(Chon et al., 2017). 터널 밖 관찰기간 +8일부터 +25일까지는 세 처리군 모두 꿀벌 치사 개체 수에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.

Table 5.

Mortality of worker bees during the experimental phase

Table 6은 시험기간 동안 번데기 치사 개체 수 변화를 나타낸다. 농약 처리 전 3일 동안에는 세 처리군 모두 통계적으로 유의한 차이가 없어 비슷한 봉군이 유지되고 있는 것을 알 수 있었다. 하지만 농약 처리 후에는 양성대조군의 번데기 치사개체수가 무처리군 및 carbaryl 수화제 처리군보다 통계적으로 유의하게 많았다. 이는 diflubenzuron이 IGR계 농약으로서 꿀벌의 유충에 영향을 미치므로 예측 가능한 결과였다(Emmett and Archer, 1980). 터널 밖 관찰 기간 동안에도 diflubenzuron 처리 군의 번데기 치사 개체수가 무처리군과 carbaryl 수화제 처리군에 비해 통계적으로 유의하게 많았다. Carbaryl 수화제 처리군은 무처리군에 비해 꿀벌 치사 개체 수는 영향을 받았지만 번데기 치사 개체 수에서는 영향을 받지 않았음을 알 수 있었다.

Table 6.

Mortality of pupae during the experimental phase

비행활동

농약 살포 전 3일 동안 평균 꿀벌 비행활동 수는 세 처리군 모두 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 무처리군, 양성대조군, carbaryl 수화제 처리군의 평균 비행활동은 각각 19.4, 13.5, 12.1 bees/m²이었다. 농약 살포일 하루 전에는 비가 내려 꿀벌 비행활동 개체 수가 3마리 미만이었다. 살포일 당일에는 무처리군과 양성대조군의 꿀벌 비행활동이 통계적으로 유의한 차이가 없었지만 carbaryl 수화제 처리군은농약 살포일 날과 다음날은 비행활동 개체 수가 2마리 미만이었고 점점 회복되기 시작하여 약제 노출 5일 후 비행활동 개체 수가 10마리 이상으로 증가하였다. 약제 살포 후 7일 동안의 무처리군, 양성대조군, carbaryl 수화제 처리군의 평균 비행활동 수가 각각 19.2, 17.7, 8.0 bees/m² 이었고 시험물질 처리군의 비행활동 수가 통계적으로 유의하게 작았다. 이는 꿀벌 치사 개체 수와 일치하는 결과로서 carbaryl 수화제 처리시 꿀벌 성체의 개체 수 및 비행활동이 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다.

Table 7.

Flight activity of honey bees during the exposure phase in the treatments

봉군 세력

Table 8은 BFD 0일부터 +28일까지의 꿀벌 개체 수 변화를 나타낸다. BFD 0일의 무처리군, 양성대조군, carbaryl 수화제 처리군의 평균 꿀벌 개체 수는 각각 6905, 6417, 8396마리로 봉군 전체 크기는 약 7000~8000 마리 되는 규모였다. 무처리군은 꿀벌 개체 수가 꾸준히 증가하여 BFD +28일에 약 37% 이상 증가하였지만 양성대조군 diflubenzuron 처리군은 BFD +22일에 꿀벌 개체 수가 약 15% 이상 감소하였다가 BFD +28일에 98.7%로 증가하였다. Carbaryl 수화제 처리군은 살포 후 치사 개체가 발생하여 그 개체 수가 줄었지만 터널 밖 시험기간인 BFD +10일 이후 봉군 쏠림현상이 나타나 세 번째 봉군에서 꿀벌 개체 수가 급격히 증가하였다. BFD +28일에 전체 봉군의 10%가 증가하여 꿀벌 전체 개체 수에 대한 약제 영향이 없는 것으로 판단되었다. 하지만 봉군 쏠림 현상으로 인한 개체 수 증가 영향이 있기 때문에 약제의 영향이 어느 정도였는지 정확히 말할 수 없는 한계가 있다. 꿀벌 반야외시험법은 BFD +10일 이후에 터널 밖에서 봉군을 밖으로 꺼내어 관찰을 하도록 되어있다. 국내에서 이 시험법을 적용시 터널 밖에 아까시 꽃등이 만발하여 농약에 영향을 받은 봉군일지라도 회복할 가능성이 있어 이 부분에 대한 향후 추가 연구가 필요하다고 생각된다.

Table 8.

Number of bees per assessment per colony

Brood termination rate (BTR)

BFD 0을 알(egg)로 기준했을 때 무처리군, 양성대조군, carbaryl 수화제 처리군의 BTR은 각각 29.3% 77.3%, 68.8%이었다. 무처리군에 비해 양성대조군과 carbaryl 수화제 처리군의 BTR은 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이는 carbaryl 수화제가 꿀벌 난 유충 발육에 영향을 미쳤다는 것을 의미한다. 또한 양성대조군 BTR 값은 선행 연구에서 70% 이상 되어야 한다는 조건과 부합한 결과이다(Becker et al., 2015).

Brood index (BI) and compensation index (CI)

BTR 결과에서 예측할 수 있듯이 BFD +22일에서 음성대조군의 BI는 3.52였고 양성대조군 및 carbaryl 수화제 처리군은 BI가 각각 1.13, 1.56으로서 알(egg)이 발달단계에 따라 제대로 성장하지 못했다는 것을 알 수 있었다. 양성대조군과 carbaryl 수화제의 BI 값은 BFD +5일부터 +22일까지 2 미만을 유지하였다. CI 값은 BFD +5에서 +22일까지 무처리군은 2.60에서 4.26으로 양성대조군은 1.75에서 3.38로, carbaryl 수화제는 2.11에서 3.25로 변하였다. CI 값도 BI 값과 비슷한 패턴으로 무처리군에 비해 양성대조군 및 carbaryl 수화제 처리군은 낮은 값을 나타내었다. 이는 carbaryl 수화제 처리군의 봉군 내 난 유충이 농약의 영향을 받았다는 것을 의미한다.

국내 구축된 꿀벌 반야외시험법을 활용하여 carbaryl 수화제의 독성평가를 수행한 결과 carbaryl 수화제가 꿀벌 치사개체 수 및 비행활동에서 살포 후 4일정도 영향을 미쳤고 그 이후에는 이에 대한 영향이 없었다. Carbaryl 수화제 살포 후에 봉군의 난 유충 발육에는 분명한 영향을 미쳤지만 터널 밖 시험에서 봉군 쏠림 현상으로 전체 봉군의 개체 수에 대한 영향은 단정지을 수 없는 결과를 나타내었다. 향후 터널 밖 시험에서 봉군 배치에 대한 추후 연구가 필요할 것으로 보이며 본 시험법을 활용하여 꿀벌에 위해성이 있는 농약에 대한 심층연구가 가능할 것으로 생각된다.

Table 9.

Brood termination rates of the marked cells in the case of eggs at BFD 0

Fig. 1.

Mean brood indices and compensation indices of eggs, * = statistically significant compared to the control.