담배거세미나방의 생물적 방제를 위한 곤충병원성 곰팡이 Beauveria bassiana의 선발 및 특성 검정
초록
담배거세미나방(Spodoptera litura)은 광식성 해충으로 많은 살충제들에 대해 저항성 발달로 방제가 힘든 해충이다. 담배거세미나방을 친환경적으로 방제하기 위한 대체 방제수단으로 곤충병원성 곰팡이가 사용될 수 있다. 본 연구에서는 담배거세미나방에 대한 살충활성이 우수한 곤충병원곰팡이를 선발하기 위해 insect-bait법으로 토양으로부터 분리된 곤충병원곰팡이 12균주를 담배거세미나방 3령 유충에 처리하여 생물검정 하였다. 잎 절편을 이용한 생물검정 결과 12균주 모두 100%의 살충율을 나타냈으며 2.38-3.5일의 반수치사시간(LT50)을 나타냈다. 넓은 온도범위에서 우수한 살충효과를 나타내는 균주를 선발하기 위해 15-35oC에서 선발 12균주의 균사생장과 발아율을 조사하였다. 12균주 중 Beauveria bassiana FG317 균주가 15-35oC에서 균사생장과 발아율이 비교적 우수하였다. B. bassiana FG317 균주의 담배거세미나방 3령 유충에 대한 방제효과를 포트 배추에서 검정한 결과 처리 7일 후 84.5 ± 2.1%의 살충율을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 B. bassiana FG317 균주가 담배거세미나방을 효과적으로 방제하는데 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Abstract
The tobacco cutworm, Spodoptera litura is polyphagous sporadic pest and difficult to control using chemical insecticides because of the development of insecticide resistance against almost all the insecticide group. For environmental friendly control of tobacco cutworm, entomopathogenic fungi could be used as alternative. We conducted bioassays to select high virulent isolate to larva of tobacco cutworm with twelve entomopathogenic fungi which were collected from soil samples by insect-bait method. As a result of bioassay using leaf disc, all twelve isolates showed high mortality as 100% and short medial lethal time (LT50) as from 2.38 to 3.5 days against third instar larva of S. litura. To select high virulent isolate at wide temperature range, germination rate and mycelial growth of isolates at different temperature (15, 20, 25, 30, 35oC) were observed. Among the twelve isolates, Beauveria bassiana FG317 showed relatively high germination rate and mycelial growth at between 15oC and 35oC. Mortality of third instar larva of S. litura treated with B. bassiana FG317 (1 × 107 conidia/ml) was 84.5 ± 2.1% for 7days after treatment at potted Chinese cabbage. Based on these results, it is expected that B. bassiana FG317 can be used to control tobacco cutworm effectively.
Keywords:
Entomopathogenic Fungi, Spodoptera litura, Beauveria bassiana키워드:
담배거세미나방, 곤충병원성곰팡이, 백강균서 론
담배거세미나방(Spodoptera litura)은 잡식성 해충으로 열대, 아열대 및 온대에 걸쳐 폭넓게 분포하고 국내에서는 1990년 이후 시설재배지가 많은 남부지방을 중심으로 다발 생하는 것으로 보고되었으며 전국에 걸쳐 년간 4-5회 발생하는 것으로 알려져 있다(Bae et al., 2003; Hollyway, 1989). 담배거세미나방은 120여종 이상의 작물을 기주로 하며 주로 십자화과, 박과, 콩과 작물의 잎, 줄기, 열매 및 꽃 등을 가해하여 25.8-100%의 경제적 손실을 일으킨다(Ramana et al., 1988; Singh et al.; 1998, Malarvanan et al., 2010). 또한 이동성과 번식력이 뛰어나고 고온에 대한 내성이 강하여 하절기 고온이 지속될 경우 충의 발육이 촉진되어 짧은 기간에 밀도가 폭발적으로 증가되는 특징이 있다(Bae and Park, 1999).
더욱이 담배거세미나방의 유충은 야간에 작물을 가해하고 주간에는 토양 속에 숨어있어 있으며 번데기 기간에도 토양 속에 서식하기 때문에 살충제에 노출될 확률이 낮으며, 20종 이상의 화학살충제에 대해 강한 내성을 나타내어 방제가 힘든 해충이다(Anand et al., 2009). 따라서 담배거세미나방을 효과적으로 방제할 수 있는 방제수단에 대한 연구가 필요한 실정이다.
미생물 살충제는 화학살충제 저항성 발현으로 방제가 힘든 해충을 방제하기 위한 대체수단으로 이용될 수 있다. 난방제 해충의 친환경방제를 위한 수단으로 곤충병원성 곰팡이에 관한 연구가 진행되었다. 곤충병원성 곰팡이 Isaria fumosorosea와 Metarahizium anisopliae 처리로 담배거세미나방 유충의 방제 뿐 아니라 알의 부화가 22-62.5% 저해되었고(Asi et al., 2012; Baskar et al., 2012)의 결과에 의하면 Beauveria bassiana 처리로 68.06%의 담배거세미유충이 방제되었을 뿐 아니라 살아남은 번데기의 무게와 우화율도 감소되었으며 비정상적인 성충의 출현도 증가하는 것으로 나타났다. M. anisopliae var. anisopliae와 Lecanicilliun muscarium 토양처리로 담배거세미나방 번데기의 우화도 81.3%, 72.5% 억제할 수 있었으며(Anand et al., 2009), Nomuraea rileyi 처리로 담배거세미유충을 77-80% 방제할 수 있었다(Vimala Devi et al., 2003). 그러나 이러한 결과는 제한된 처리환경인 실험실 내에서의 잎 절편을 이용한 생물검정 결과로 처리환경이 균일하지 않는 포장에서의 방제효과와 같을 수 없다. 따라서 본 연구에서는 담배거세미나방을 안전하게 방제하기 위해 국내 토양으로부터 분리된 곤충병원성 곰팡이 중 담배거세미나방에 대한 살충활성이 높은 B. bassiana 균주를 선발하고 균주의 특성을 탐색하였으며, 배추 유묘를 이용한 포장 생물검정을 실시하여 선발 균주의 미생물제로서의 개발 가능성에 대해 조사하였다.
재료 및 방법
실험곤충 및 곤충병원성 곰팡이
담배거세미나방 3령 유충(부화 후 5일)은 국립농업과학원 작물보호과 실험실에서 분양 받아 당일 실험에 사용되었다.
담배거세미나방에 대한 고병원성 미생물을 선발하기 위해 국립농업과학원 농업미생물과에서 선행연구를 통해 토양으로부터 insect-bait 방법으로 분리한 곤충병원성 곰팡이 12균주를 이용하여 실험하였다(Han et al., 2013). 곤충병원성 곰팡이는 감자한천배지(PDA 39 g + 멸균수 1 L)에 접종하여 25 ± 1oC, 광주기 16:8의 조건에서 2주간 배양하였다
생물검정
생물검정을 위한 포자현탁액은 PDA배지에 2주간 배양한 포자가 형성된 배지에 5 ml의 멸균된 0.01% Tween 80 용액을 넣고 유리막대로 표면을 긁어 포자를 회수한 후 거즈로 걸러 hemocytometer를 이용하여 계수하고 필요한 농도의 포자현탁액(1 × 107 conidia/ml)을 제조하였다. 생물검정은 배추 잎 절편과 5엽기 배추 유묘를 이용하여 수행하였다. 잎 절편을 이용한 생물검정은 담배거세미나방 3령(부화 후 7일) 유충 10 마리가 투입된 직경 9 cm 배추 잎에 포자현탁액을 살포하여 실시하였다. Plexyglass 스프레이타워(50 × 50 × 50 cm, 100 kPA, 직경 1.5 cm의 polyvinyl acetal cone nozzle 부착 airbrush (TC-620x, Anest Iwata Sparmax Co. Ltd., Taiwan))로 포자현탁액을 담배거세미나방 유충이 처리된 배추 잎 앞, 뒷면에 살포하였다. 살포된 잎은 상온에서 한 시간 동안 건조한 후 500 ul의 멸균수로 적신 필터페이퍼가 깔린 페트리디쉬에 넣고, 습실 처리가 된 플라스틱 용기에 담아 항온기(VS-1203PFC, Vision Scientific Co. Ltd., Korea)에서 25oC, 광조건 16L:8D, 습도 90% 이상으로 유지하여 6일 동안 매일 치사충 수를 관찰하였다. 치사충은 멸균수로 적신 필터페이퍼가 깔린 페트리디쉬에 옮겨 표피에서 곰팡이가 발생하는지 관찰하였다. 대조구에는 0.01% Tween80 용액만을 처리하였다. 균주 선발을 위한 생물검정은 10마리 유충을 한 반복으로 2반복 실시하였다.
선발 균주의 적정 처리농도를 조사하기 위해 위의 잎 절편을 이용한 생물검정과 같은 방법으로 1 × 104 -107 conidia/ml 농도의 포자현탁액 준비하여 생물검정 하였으며, 배추 유묘를 이용한 생물검정은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.
5엽기 배추 유묘에 담배거세미나방 3령 유충을 10마리씩 처리하고, 포자현탁액을 분무기로 살포하였다. 살포된 배추 유묘를 L60 × W60 × H180 cm의 곤충사육텐트(BugDorm-6630, Mega View science Co. Ltd., Taiwan)에 넣고, 7일간 매일 치사충을 관찰하였다. 생물검정 동안의 환경조건은 온, 습도 관측기(U12-012, HOBO Onset Co. Ltd., USA)를 통하여 조사하였는데 평균온도 21.9oC (최대 26.6oC, 최저 16.9oC), 평균습도 91.6% (최대 95.9%, 최소 24.2%), 평균광량 6.7 lum/ft2 (최대 20.97 lum/ft2, 최소 0.47 lum/ft2)였다. 최적 처리농도와 농도를 위한 생물검정은 각각 2회 수행되었으며, 매 실험마다 3개의 반복을 두었다.
선발 균주의 최적 처리 온도를 탐색하기 위해 포자현탁액(108 conidia/ml)을 배추 잎 절편에 위와 같은 방법으로 처리하고 각각 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC의 온도조건과 16L:8D의 광조건, 90% 이상의 습도를 항온기(VS-1203PFC, Vision Scientific Co. Ltd., Korea)에서 유지하여 6일 동안 매일 치사충 수를 관찰하였다. 생물검정은 3회 수행되었으며, 매 실험마다 3개의 반복을 두었다.
형태학적 관찰
분리 균주의 형태학적 관찰을 위하여 slide grass culture 방법을 이용하였다(Humber, 2012). PDA에서 3-4일간 배양된 균체를 2% water agar위에 놓인 두 장의 멸균 커버슬라이드(지름 22 × 30 mm) 사이에 놓고 25oC에서 7일간 배양한 후 위상차 현미경(DE/MZ-12, LEICA Co. Ltd., Germany) (400×)을 이용하여 균사 및 포자의 형태를 관찰하였다.
분리된 곤충병원성 곰팡이의 적정 생육 온도 검정
선발된 B. bassiana FG317를 PDA배지에 접종하여 25 ± 1oC에서 14일간 배양하였다. 배양된 B. bassiana FG317균총을 직경 7 mm의 코르크보러로 떼어내어 PDA배지의 중앙에 치상하고 항온기(VS-1203PFC, Vision Scientific Co. Ltd., Korea)에서 15, 20, 25, 30, 35oC에서 7일간 배양하였다. 실험은 3반복 하였으며 배양 7일 후 균사의 성장을 자(Digimatic Caliper, Mitutoyo Co. Ltd., Japan)를 이용하여 측정하였다.
선발 FG317균주의 최적 발아온도를 검정하기 위하여 1.5% Water agar (Agar 15 g + 멸균수 1 L)에 FG317균주 현탁액(1 × 106 conidia/ml)을 100 ul 접종한 뒤 15, 20, 25, 30, 35oC에서 24시간 배양한 후 Cotton blue 용액을 떨어뜨려 포자를 고정, 커버글라스를 덮어 포자의 발아유무를 측정하였다. 포자의 발아여부는 균사의 길이가 포자의 직경보다 2배 긴 것을 발아한 것으로 간주하고 조사하였다.
통계처리
각 처리간의 차이를 비교하기 위하여 PROC GLM (SAS Institute, version 9.2)을 이용하여 분석하였다. 분석은 각 반복을 종합하여 분석하였으며, 처리간의 차이는 Duncan의 다중비교와 Tukey’s studentized range (HSD)를 이용하여 분석하였다. 반수치사시간(median lethal time; LT50)은 probit 법(SAS Institute, version 9.2)을 이용하여 산출되었다.
결과 및 고찰
담배거세미나방 고병원성 균주 선발
담배거세미나방을 효과적으로 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위해 토양으로부터 분리한 곤충병원성 곰팡이 12균주를 담배거세미나방 3령 유충에 처리한 결과 12균주 모두 95% 이상의 높은 살충율을 나타냈다. 처리 균주에 의한 반수치사시간은 B. bassiana FG319균주의 경우 2.38일, I. fumosorosea FG260균주는 2.71일, B. bassiana FG317균주는 2.76일로 짧았으며 Isaria sp. FT240균주의 반수치사시간이 3.5일로 가장 긴 것으로 조사되었다(Table 1).
LT50 value of 3rd instar larvae of Spodoptera litura with entomopathogenic fungi isolates collected from soil by insect-bait method
담배거세미나방을 넓은 온도범위에서 신속하게 방제하기 위해 12균주 중 반수치사시간이 짧은 I. fumosorosea FG260, B. bassiana FG317, B. bassiana FG319 균주를 선발하여 처리 온도별 균사생장과 발아율을 조사하였다.
선발 I. fumosorosea FG260 (F = 13.03, df = 4, 26, P < 0.001)균주와 B. bassiana FG317 (F = 12.8, df = 4, 26, P < 0.001), B. bassiana FG319 (F = 14.64, df = 4, 26, P < 0.001) 균주의 균사생장은 25oC에서 27.7 ± 2.9 mm, 23.4 ± 4.7 mm, 23.0 ± 1.6 mm로 가장 활발하였으며 30oC에서는 18.1 ± 1.3 mm, 20.3 ± 1.5 mm, 17.4 ± 1.3 mm로 다소 감소하였으며 35oC에서는 FG319균주만이 8.4 ± 0.5 mm의 균사생장을 하는 것으로 나타났다(Fig. 1, (A)). 선발 균주의 발아율은 대체로 20-30oC에서 활발하였으나 I. fumosorosea FG260균주(F = 139.66, df = 4, 29, P < 0.0001)는 30oC에서의 발아율이 45.7 ± 7.5%로 낮아졌으며 B. bassiana FG317 균주(F = 73.92, df = 4, 29, P < 0.001)는 35oC에서 19.7 ± 3.2%의 발아율을 나타내었다(Fig. 1, (B)).
Mycelial growth (A) of entomopathogenic fungi isolates at different temperatures 14 days after cultivation on PDA media and germination (B) rate of isolates at different temperatures after 24 hours. Means on the column followed by the same letter are not significantly different by Duncan’s multiple range test.
일반적으로 온도, 건조 등의 비생물학적 조건에 대한 저항성을 가진 미생물은 미생물제형 제작과 보관과정에 큰 장점으로 작용한다. 뿐만 아니라 곤충병원성 곰팡이는 해충의 표면에 부착, 발아하여 침투하기 때문에 담배거세미나방과 같은 고온성 해충을 효과적으로 방제하기 위해서는 높은 온도에서도 급격한 발아율(<10%) 저하가 나타나지 않는 균주를 선발하는 것이 효과적이다(St. Leger and Screen, 2001). 담배거세미나방의 생육 적온은 23-30oC이며 33-39oC에서는 생육과 생식 기능이 감소되고 그 이후에는 생육이 완전히 억제된다(Hasmat and Khan, 1977). Bae (1999)의 결과에 따르면 24oC, 28oC 및 32oC에서 온도가 높아질수록 용화율과 우화율이 각각 23-88%, 21-89% 증가하였다. 따라서 본 연구에서는 담배거세미나방을 방제하기 위한 고활성 곤충병원성 곰팡이 선발을 위해 높은 온도에서 비교적 발아와 생장이 우수한 B. bassiana FG317균주를 선발하였다.
선발 균주의 형태학적 조사
B. bassiana FG317 균주의 형태학적 동정을 위해 포자의 모양을 현미경으로 관찰한 결과, 지름 3.5 µm 이하의 구형 포자가 군집을 이루고 있는 포도송이 모양의 전형적인 B. bassiana 형태(Humber, 2012)를 나타내었으며, B. bassiana FG317 균주를 1 × 108 포자 수/ml 농도로 담배거세미나방 유충에 처리하였을 때 처리 5일차에 유충의 사체가 균사로 뒤덮였으며 처리 7일째가 되면 유백색의 포자가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
Morpholgy of Beauveria bassiana FT317 observed under phase contrast microscope (A). The S. exigua 3rd instar larvae treated with Beauveria bassiana FT317 (1 × 108 conidia/ml) 5 and 7 days after treatment (B). Control treated with 0.01% Tween80.
선발 균주의 최적 처리농도 규명
선발 균주의 최적 처리 농도를 조사하기 위해 배추의 잎 절편에 담배거세미나방 3령 유충을 처리한 뒤 B. bassiana FG317균주의 포자현탁액(1 × 105 -108 conidia/ml with 0.01% Tween 80)을 분무살포 하였다(Fig. 3). 처리 7일 후 포자현탁액 1 × 105 conidia/ml 처리구에서는 33.0%의 낮은 방제효과를 보였지만 1 × 106, 107, 108 conidia/ml 처리구에서는 각각 65.0, 100, 100% (F = 74.71, df = 3, 27, P < 0.0001)의 살충율을 나타내어 포자현탁액의 농도가 높을수록 살충율도 증가하는 경향을 나타냈다. 특히, 일반적인 포자처리 농도인 1 × 108 conidia/ml의 처리구에서는 살포 후 4일 후 98.0%, 처리 5일 후 100% (F = 116.48, df = 3, 27, P < 0.0001)의 높은 살충율을 나타냈다.
Corrected mortality of Spodoptera litura larvae by B. bassiana FT317 after treatment with different conidia concentration (1 × 105, 106, 107 and 108 or 1 × 104, 105, 106 and 107 conidia/ml) at leaf disc (A) and potted Chinese cabbage (B). Control treated with 0.01% Tween80. Means above the line followed by the same letter are not significantly different using Duncan’s multiple range test (A) and Tukey’s studentized range (HSD) test (B) (P>0.05).
Corrected mortality of Spodoptera litura larvae by B. bassiana FT317 after treatment with conidia (1 × 107 conidia/ml) at different temperatures 15oC, 20oC, 25oC and 30oC. Control treated with 0.01% Tween80. Means above the line followed by the same letter are not significantly different using Duncan’s multiple range test (P>0.05).
B. bassiana FG317균주의 포장에서의 최적 처리농도를 조사하기 위해 배추 유묘를 이용하여 생물검정 하였다. 처리 7일 후 포자현탁액 1 × 104, 105, 106, 107 conidia/ml 처리구 각각의 살충율은 35.0, 47.0, 64.6, 84.5%로 잎 절편을 이용한 생물검정과는 다소 차이가 있었지만 107 conidia/ml 이상의 농도로 처리했을 때 담배거세미나방을 효과적으로 방제하는 것으로 조사되었으며, 포자현탁액의 농도 증가에 따른 살충률의 증가는 통계적으로 유의차가 있는 것으로 나타났다(F = 34.57, df = 3, 23, P < 0.0001). Asi et al. (2013)의 결과에 따르면 B. bassiana 25, I. fumosorosus 32, M. anisopliae L6균주의 담배거세미나방 3령 유충에 대한 방제효과는 107 conidia/ml 처리구의 경우 처리 10일 후 각각 56.32, 52.63, 36.21% 였으며 108 conidia/ml 처리구의 경우 63.26, 57.82, 43.03%로 조사되었다. 또한 담배거세미나방 사충으로부터 분리된 곤충병원성곰팡이 N. rileyi 6균주(2 × 108 conidia/ml)의 처리 6일차 살충율은 43.3~100%로 왕담배나방에서 분리된 균주(0-41.7%)보다 높은 살충율을 나타냈다(Vimala Devi et al., 2003). 이러한 연구결과가 처리 조건이 균일한 잎 절편을 이용한 실험결과임을 감안하였을 때 본 실험에서 선발한 B. bassiana FG317균주의 방제효과가 더욱 우수한 것을 알 수 있었으며 처리환경에 많은 영향을 받는 곤충병원성 곰팡이의 특징에도 불구하고 처리 조건이 일정하지 않는 배추 유묘에서의 B. bassiana FG317 균주의 방제효과가 84.5 ± 2.1%로 매우 우수한 것을 확인할수 있었다.
선발 균주의 온도별 살충율
선발 B. bassiana FG317균주의 최적 처리 온도를 조사하기 위해 담배거세미나방 유충이 접종된 배추 잎 절편에 균주 현탁액(108 conidia/ml)을 살포하여 15, 20, 25, 30, 35oC에서 생물검정한 결과 처리 7일 후 담배거세미나방의 살충율은 각각 96.7, 98.1, 80.0, 75.7, 20.6% (F = 38.55, df = 4, 29, P < 0.0001)로 15, 20oC에서 살충활성이 우수하였으며 20oC 이상의 온도에서는 온도가 높아질수록 살충효과가 감소하는 것으로 조사되었다.
B. bassiana FG317균주의 발아와 균사생장을 위한 최적온도(20-30oC)와 담배거세미나방을 방제하기 위한 최적 처리온도가 일치하지 않았다.
해충 표면에 처리된 곤충병원성 곰팡이는 온도뿐 아니라 습도, 큐티클에 존재하는 성분에 영향을 받는다. 해충의 표면에는 실험실에서 사용하는 배지와 달리 곰팡이의 발아, 성장, 발달에 영향을 미칠 수 있는 많은 다른 물질 등이 존재한다. 탄소원과 질소원 등의 영양성분이 B. bassiana 균주의 발아와 germ tube 형성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 곤충의 큐티클에 존재하는 protease inhibitor를 비롯한 여러 단백질 또한 곰팡이의 발아를 억제 또는 촉진시킬 수 있다(Vega and Kaya, 2012). 본 연구에서 조사된 B. bassiana FG317균주의 기내 배양에서 발아와 생장은 해충의 표면에서 영향을 받을 수 있는 여러 환경의 차이는 배제된 결과이므로 균주의 생육 적온과 살충활성을 위한 적온에 차이가 나는 것으로 생각된다.
B. bassiana FG317 균주를 이용한 포트 생물검정의 경우 107 conidia/ml의 농도로 처리했을 때 84.5 ± 2.1%의 우수한 방제효과를 나타냈으나 처리 평균온도가 21.9oC (최대 26.6oC, 최저 16.9oC)로 담배거세미나방이 다발생하는 포장 환경을 대표하기에는 부족하므로 B. bassiana FG317 균주의 담배 거세미나방 살충효과를 알아보기 위한 추가 실험이 필요할 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서 적용한 엽채류가 아닌 과실류에서는 3령 이후의 담배거세미나방 유충이 과실 안으로 침입하여 피해를 주기 때문에 약제에 노출되는 확률이 떨어져 방제가 힘든 실정이다. 과실류에서의 담배거세미나방 방제는 섭식에 의해 독성을 나타내는 곤충병원세균과 달리 해충의 표피에 부착, 발아하여 큐티클층을 뚫고 들어가 해충을 죽이는 곤충병원성 곰팡이의 반복처리로 담배거세미나방 유충의 표피에 부착할 기회를 높여 준다면 과실 안으로 침입한 해충을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 기대된다.
Acknowledgments
본 연구는 국립농업과학원의 기관고유사업(PJ01259504)의 지원에 의해 수행되었습니다.
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