탈메틸화효소 활성 저해 살균제에 대한 감 탄저병균의 저항성 발현

병반 채집과 병원균의 분리

2015년부터 2016년에 걸쳐서, 감 주산지인 경상북도 상주시, 충청북도 영동군, 경상남도 창원시, 전라남도 나주시, 순천시, 영암군 지역의 과원에서 탄저병의 병징을 보이는 열매, 신초, 가지 등을 채집하여 병원균을 단포자 분리 하였다. 마른 가지의 병반이나 분생포자가 형성되지 않은 병반에서 병원균을 분리하기 위해서, 화염 소독한 전정가위로 채집한 식물 기관을 5~10 cm의 길이로 잘라 1% 차아염소산나트륨과 70% 에탄올에서 표면살균한 뒤 멸균증류수로 세척하고 습실 처리하여 병징 상에서 분생포자를 형성시켰다. 감탄저병균의 분생포자가 형성된 병반에서 화염 소독한 백금이를 이용해 분생포자를 떼어 300 μg/mL의 streptomycin이 첨가된 멸균증류수에 넣고 고르게 섞어 포자현탁액을 준비하였다. 포자 현탁액의 포자 밀도를 1×10⁴~10⁵ 개/mL로 조정하여 PDA (potato dextrose agar; Becton, Dickinson and Company, Difo^TM) 배지에 50 μL씩 도말하고 25^oC의 암조건에서 2일간 배양한 후, 배지에 형성된 단균총을 분리하여 병원균의 순수배양체를 얻었다.

실험에 사용한 병원균 및 균주 보관

실험에 사용한 C. horii 중 일부는 2004~2005년에 단포자분리하여 충북대학교 식물의학과 식물진균병학 실험실에서 보관하던 10개 균주와 2015년에 분리한 17개 균주, 2016년에 분리한 36개 균주, 그리고 경북대학교에서 분양받은 10개 균주 등 총 73개의 균주를 본 실험에 사용하였다(Table 1). 순수 분리된 병원균은 PDA 배지에 접종하여 25^oC의 암조건에서 10일간 배양하였다. 배양된 균사의 선단부에서 직경 3 mm의 균사조각을 떼어내어 300 μg/mL의 streptomycin이 첨가된 멸균증류수가 담긴 cryotube^TM vial (직경; 12 mm, 높이; 48 mm, Nunc Co. Ltd)에 각각 15조각을 넣고 상온에서 장기간 보관하였으며, PDA 사면배지에 배양하여 4^oC에서 보관하며 실험에 사용하였다.

Table 1.

List of isolates used in this study

한천희석법을 이용한 탈메틸화효소 활성 저해 살균제에 대한 병원균의 감수성 조사

탈메틸화 효소 활성 저해 살균제(demethylase inhibiting fungicide, DMI fungicide)에 속하는 tebuconazole (a.i. 20%, SC), difenoconazole (a.i. 10%, SC), prochloraz (a.i. 25%, EC)를 살균증류수에 희석한 후, PDA 배지에 첨가하여 배지에서 살균제 농도를 정해진 농도로 조절하였다. PDA 배지에서 세균의 오염을 방지하기 위해서 streptomycin을 최종 농도가 300 μg/mL가 되도록 첨가하였다. PDA 배지에 접종하여 25^oC 암조건에서 7일간 배양한 병원균의 균사 선단에서 직경 3 mm의 균사 조각을 떼어, 각 살균제가 농도별로 첨가된 PDA 배지에 균사가 자란 면이 밑으로 가도록 뒤집어서 접종하였다. 병원균을 25^oC의 암조건에서 4~6일간 배양한 후, 살균제를 첨가하지 않은 PDA 배지에서 균총의 직경이 30~40 mm 되었을 때 실험에 사용한 모든 병원균의 균총 직경을 조사하였다.

발아관 신장 억제효과 조사

감수성 균주 C. horii 15GKYD4와 저항성 균주 C. horii 15GKNJ3을 25^oC 암조건의 PDA 배지에서 5일간 배양한 후, 화염 소독한 칼을 이용하여 균총의 선단부에 상처를 내었다. 근자외선을 12시간 간격으로 조사하며 25^oC에서 3일간 배양하여 감탄저병균의 포자 형성을 유도하였다. 형성된 포자는 멸균증류수를 이용하여 수확한 후, 8겹의 멸균한 거즈에 여과하고 균사 등의 이물질을 제거하여 포자 현탁액을 준비하였다. 준비한 포자 현탁액은 3,000 rpm에서 15분간 2회 원심분리하여 포자를 세척하고, 현탁액의 포자 밀도를 1×10⁵ 개/mL로 조정하였다. 배지에서 tebuconazole의 최종 농도가 0.05 μg/mL이 되도록 첨가한 1% WA 배지 위에 멸균한 셀로판막을 올린 뒤 포자현탁액을 점적하고, 25^oC의 암조건에서 3, 6, 12, 24시간 배양하며 발아관의 길이를 조사하였다. 또한, 감수성 균주 4개와 저항성 균주 6개를 선발하여 tebuconazole, difenoconazole, prochloraz 등 3종의 살균제의 발아관 신장 억제효과를 동일한 방법으로 실시하였다.

Kasugamycin에 대한 병원균의 감수성 조사

실험에 사용한 DMI 살균제의 감수성과 저항성 균주를 대상으로 단백질 생합성 저해 살균제인 kasugamycin에 대한 반응을 조사하였다. 감수성 균주 15GKYD3, 15GKYD9, 15GKOC1 3균주와 저항성 균주인 15GKNJ2, 15GKSC1, 15GKYA1 3균주를 선발하여 한천희석법을 사용한 균사생장 억제효과를 조사하였는데, PDA 배지에서 kasugamycin의 농도는 0, 0.1, 1, 10, 100 μg/mL가 되도록 조정하였다. 실험에 사용한 모든 균주를 대상으로 kasugamycin이 100 μg/mL가 첨가된 PDA 배지에서 균사생장 억제율을 조사하였다.

Kasugamycin과 tebuconazole의 상호 작용 조사

멸균한 여과지(1×7 cm (가로×세로), Advanted 5B, Toyo Roshi Kaisha, Ltd)를 100 μg/mL의 kasugamycin과 0.5 μg/mL의 tebuconazole 용액에 각각 침지하였다가 꺼내어 무균상 안에서 건조시킨 후, 1×10⁵ 개/mL의 포자현탁액을 도말한 PDA 배지에 직각으로 교차하도록 올려주었다. PDA 배지는 25^oC의 암조건에서 7일 간 배양한 후, 살균제를 처리한 여과지 주변에 형성되는 병원균의 clear zone의 형태를 관찰하였다.

DMI 살균제에 대한 병원균의 감수성 정도

DMI 살균제 반응 조사 결과, C. horii 균주는 2가지 집단으로 나누어졌는데, 0.5 μg/mL의 tebuconazole 첨가 배지에서 균사 생장이 100% 억제되는 집단과 억제되지 않는 집단으로 구별되었다(Fig. 1). Difenoconazole과 prochloraz 역시 Fig. 2에서 보는 것과 같이 0.16 μg/mL와 0.032 μg/mL의 농도에서 균사 생장의 차이가 뚜렷하였다. EC₅₀값의 분포를 보여주는 Fig. 3에서도 tebuconazole과 difenoconazole의 저항성과 감수성 그룹은 0.07 μg/mL의 농도에서 뚜렷하게 구분되었다. Tebuconazole, difenoconazole, prochloraz에 대한 감수성 병원균 집단의 평균 EC₅₀ 값은 각각 0.010, 0.006, 0.002 μg/mL이었고, 저항성 병원균 집단의 평균 EC₅₀값은 0.855, 0.608, 0.018 μg/mL로, 저항성 집단이 감수성 집단에 비해 평균 EC₅₀값이 약 100배 높았다(Table 2). 각 살균제에 대해서 실험에 사용한 모든 균주의 저항성 요인값은 tebuconazole에서 592.6, difenoconazole에서 707.9, prochloraz에서 60.9로 나타났는데, 저항성 요인값이 tebuconazole과 difenoconazole에 비해서 prochloraz가 낮은 것은 Fig. 3에서 prochloraz가 나머지 두 살균제보다 감수성과 저항성의 구분이 모호한 결과와 부합한다고 생각한다.

Fig. 1.

Inhibition ratio (%) of Colletotrichum horii isolates to 3 DMI fungicides as tebuconazole (A), difenoconazole (B) and prochloraz (C). Inhibition ratio was calculated by comparing the colony diameter of each isolate, which was measured on PDA without a fungicide and with a fungicide by each indicated concentration. Blue line is sensitive isolates, and red line is resistant isolates.

Fig. 2.

The colonies of Colletotrichum horri 15GKYD3 and 15GKYA1 on PDA with and without each fungicide as 0.5 μg/mL of tebuconazole, 0.16 μg/mL of difenoconazole and 0.032 μg/mL of prochloraz. C. horii 15GKYD3 was sensitive to all DMI fungicides used in this study, whereas C. horii 15GKYA1 was resistant. They were incubated on those PDA media at 25oC with a dark condition for 4~5 days.

Fig. 3.

Cumulative frequency of EC50 values for tebuconazole, difenoconazole, and prochloraz. Tebuconazole and difenoconazole are divided into two subgroups based on 0.07 μg/mL.

Table 2.

EC50 values and RF values of Colletotrichum horii isolates against DMI fungicides

병원균을 분리한 지역 간의 살균제에 대한 감수성 차이

DMI 살균제에 대한 감수성 정도는 지역 간에 뚜렷한 차이가 나타났다(Fig. 4). 저항성 집단은 주로 단감을 재배하는 경상남도 창원시, 전라남도 영암군, 나주시, 순천시에서 분리한 균주들이었으며, 감수성 균주는 중부 지역에 속하는 경상북도 상주시, 충청북도 영동군과 남부 지역에 속하는 경상남도 산청군에서 분리한 균주들이었는데, 이 지역은 모두 곶감을 생산하기 위하여 떫은 감을 재배하는 곳이었다.

Fig. 4.

Collection regions of Colletotrichum horii from infected persimmon tree. Isolates of C. horii collected in gray area was sensitive to DMI fungicides, whereas those in black area was resistant.

상주지역에서 분리 시기가 다른 병원균 집단의 DMI 살균제에 대한 감수성 변화

2004~2005년과 2015년에 경북 상주시에서 채집한 감 탄저병균의 DMI계 살균제에 대한 감수성을 비교하였다(Table 3). Tebucoazole, difenoconazole, prochloraz에 대한 2004~2005년에 채집한 균주들의 평균 EC₅₀값은 각각 0.012, 0.005, 0.001 μg/mL이었으며, 2015년에 채집한 균주들의 평균 EC₅₀값은 0.008, 0.005, 0.002 μg/mL이었다. 이처럼 약 10여년의 기간을 두고 상주 지역에서 채집한 감 탄저병균의 집단 간에는 미미한 차이가 있었지만, 상주 지역 전체 균주와 남부지방에서 채집한 균주와 비교할 경우 3종의 DMI 살균제에 대해서 보이는 살균제 반응의 뚜렷한 변화는 찾아볼 수 없었다.

Table 3.

EC50 values of Colletotrichum horii against DMI fungicides according to the isolation year in Sangju

지역에 따라 분리된 감탄저병균은 실험에 사용한 3종의 DMI 살균제에 대한 감수성 정도가 확연히 달랐다. Kim et al. (2006)의 보고처럼 작물에서 탄저병을 일으키는 Colletotrichum 속의 병원균은 병원균의 종(species)에 따라서 benzimidazole계 살균제에 대한 감수성 반응이 다르게 나타난다. 고추 탄저병의 주된 병원균인 C. acutatum은 benzimidazole계 살균제에 대해서 비감수성인데 비해서, 주된 병원균은 아니지만 과거부터 고추 탄저병의 원인균 중의 하나로 알려져 있는 C. gloeosporioides는 감수성 또는 질적인 저항성 반응을 보인다. 따라서 본 연구에서도 실험에 사용한 73개의 균주를 정확하게 동정하기 위해서 ITS 영역 유전자의 염기서열 분석을 실시하였지만, 모든 균주가 C. horii로 동정되었다(결과 미발표). 결국 감탄저병균의 DMI 살균제에 대한 감수성 차이는 Colletotrichum 종이 달라서 나타나는 차이라고 볼 수 없었다. 그런데 저항성 균주는 모두 남부지역의 단감 과원에서만 분리되고, 감수성 균주는 떫은 감을 재배하는 지역의 과원에서만 분리되어, DMI 살균제에 대한 반응의 차이가 지역 간에 뚜렷하게 나뉘어졌다. 떫은 감과 단감은 재배 방법이나 병해충 관리가 상이한 부분이 많다. 주로 떫은 감의 과원에서는 연평균 3~5회 정도 약제살포가 이루어지지만(Lim et al., 2008; Yu et al., 2017), 단감 과원에는 연 8~9회 정도 약제 살포가 이루어진다(Lee et al., 2001). 결국 단감 과원에서만 DMI 살균제에 대한 저항성 병원균이 출현한 것은 단감 재배 지역의 과원에서 떫은 감 과원보다 많은 약제 살포가 이루어졌기 때문이라고 생각되었다. 실제로 살균제에 대한 탄저병균의 저항성 발생은, 실제 방제효율이 높은 약제 선호에 따른 포장에서 사용횟수 증가와 밀접한 관계가 있다(Hirooka and Ishii, 2013).

DMI계 살균제 간의 교차 저항성

실험에 사용한 C. horii 73균주를 대상으로 DMI계 살균제인 tebuconazole, difenoconazole, prochloraz의 교차 저항성 여부를 조사하였다. 각 살균제에 대한 상관관계는 실험에 사용한 모든 73개 균주를 대상으로, 그리고 감수성인 36균주를 대상으로, 그리고 저항성인 37균주를 대상으로 나누어 분석하였다. 실험에 사용한 모든 균주를 대상으로 상관계수 값은 Table 4에서 보는 것과 같이 tebuconazole과 difenoconzaole에 대해서 0.92, tebuconazole과 prochloraz에 대해서 0.81, difenoconazole과 prochlorazr에 대해서 0.86으로 모든 살균제 서로 간에 매우 높은 상관관계를 보였다. 이는 실험에 사용한 감탄저병균은 DMI계 살균제에 대해서 서로 교차저항성 관계가 있음을 보여주고 있다. 실험에 사용한 73개의 감 탄저병균 균주는 DMI계 살균제에 대해서 감수성과 저항성 반응이 전혀 다른 2개 그룹으로 구분된다. 두 그룹간의 저항성 차이가 매우 커서, 전체 집단을 다시 감수성과 저항성 집단으로 나누어 상관 분석을 실시하였다(Table 4). Tebuconazole과 difenoconzaole, tebuconazole과 prochloraz, 그리고 difenoconazole과 prochlorazr에 대한 상관계수 값은 감수성 집단의 경우 각각 0.38, 0.45, 0.68이었으며, 저항성 집단의 경우에는 0.84, 0.65, 0.75으로 모두 0.05 수준에서 유의한 값으로 나타났는데, 각각의 두 집단내에서도 서로 다른 DMI계 살균제에 대한 감 탄저병균의 반응은 매우 높은 상관관계가 있음을 알 수 있었다.

Table 4.

Correlation between DMI fungicides of each group with different sensitivity

병원균 포자의 발아관 신장에 대한 DMI 살균제의 억제 효과

Tebuconazole에 대한 감수성과 저항성 균주인 15GKYD4와 15GKNJ1 균주의 포자현탁액(1×10⁵ 개/mL)에 tebuconazole을 0.05 μg/mL가 되도록 처리하고 배양하면서 정해진 배양시간이 지난 후, 발아관의 길이를 조사하였다. 포자를 25^oC에서 6, 12, 24시간 배양한 후에 포자의 발아관 길이를 조사한 결과, 감수성 균주 15GKYD4의 무처리구와 살균제 처리구의 발아관 길이는 6시간 후에 51.1과 52.0 μm, 12시간 후에 139.1과 113.0 μm, 24시간 후에 477.0과 137.0 μm이었으며, 저항성 균주 15GKNJ1은 6시간 후에 69.2와 65.48 μm, 12시간 후에 185.8과 152.9 μm, 24시간 후에 595.2과 473.1 μm이었다(Fig. 5). 감수성 15GKYD4와 저항성 15GKNJ1에 대한 tebuconazole의 포자 발아관 신장 억제효과는 6시간 후에 0.0%, 5.3%, 12시간 후엔 18.8%와 17.7%이었지만, 24시간 후에는 71.9%와 20.5%로, 24시간 배양 후부터 저항성 균주와 감수성 균주 사이에 뚜렷한 억제효과의 차이가 나타났다. Tebuconazole의 발아관 신장 억제효과를 조사한 결과, 0.05 μg/mL의 tebuconazole 처리구에서 억제효과가 70% 이상이 되는 감수성 집단과 10% 이하가 되는 저항성 집단의 두 집단으로 구분되었다(Fig. 6). Difenoconazole과 prochloraz에 대해서도 실험에 사용한 10개의 탄저병균 균주는 감수성과 저항성 집단으로 뚜렷하게 나누어졌다. 각 살균제에 대해 감수성과 저항성 균주에 대한 tebuconazole의 평균 EC₅₀값을 조사한 결과 0.002와 0.846 μg/mL로 나타나, 저항성 균주의 평균 EC₅₀ 값이 감수성 균주에 비해 423.0배 높은 것으로 나타났으며, difenoconazole은 141.3배, prochloraz는 25배가 높았다(Table 5).

Fig. 5.

The length of germ tube (A) of Colletotrichum horii 15GKYD4 (susceptible isolate) and 15GKNJ1 (resistant isolate) and the inhibition rate of germ tube growth (B) of tebuconazole by lapse of incubation time. Tebuconazole was applied into spore suspention of each isolate at the starting time of incubation, which was adjusted to 1×105 spores/mL. NT; no treatment, T; treatment with 0.05 μg/mL of tebuconazole.

Fig. 6.

Inhibition ratio of germ tube growth by DMI fungicides. The gray line is sensitive isolates, and the black line is resistant isolates. At 0.05 μg/ml of tebuconazole, sensitive isolates were inhibited over 60%, and resistant isolates were inhibited to less than 10%. A; tebuconazole, B; difenocoazole, C; prochloraz.

Table 5.

EC50 values and RF values of germ tube growth of Colletotrichum horii for DMI fungicides

감수성인 C. horii 균주와 저항성 균주는 tebuconazole을 처리하였음에도 불구하고 포자 발아에 전혀 영향이 없었으며, 24시간이 지나기 전까지 발아관이 일정 기간 신장하는 데도 전혀 영향이 없었다. 뉴질랜드 사과 재배지에서 bull's eye rot병을 일으키는 Phlyctema vagabunda에 대해서 difenoconazole의 포자발아와 균사생장 억제효과를 조사한 결과에서도, 10 μg/mL의 difenoconazole 처리구에서 포자발아를 16% 억제한 반면에, 균사 생장은 81.7%를 억제하였다(Wood and Fisher, 2017) 이처럼 DMI 살균제는 병원균의 균사생장 억제효과는 탁월한 반면에 포자발아 억제효과는 매우 저조하기 때문에, 포자발아를 억제하는 효과를 측정할 경우 각 살균제의 효과를 정확하게 판단할 수 없다. 또한 Fig. 7에서 보는 것과 같이 발아한 후 발아관이 24시간 정도 신장한 후에 측정하는 것이 DMI 살균제의 효과를 얻을 수 있음을 보여준다.

Fig. 7.

Germination and germ tube of Colletotrichum horii 15GKYD4 (A) sensitive to tebuconazole and 15GKNJ1 (B) resistant to the fungicide. Tebuconazole was applied into the spore suspension of each isolate at the starting time of incubation, which was adjusted to 1×105 spores/mL. Germinating spore of each isolate was observed under a light microscope after incubation for 3, 6, 12 and 24 hrs, respectively.

병원균에 대한 Kasugamycin의 균사생장 억제효과

Fig. 8에서 보는 것과 같이 C. horii 15GKYD3, 15GKYD9, 15GKOC1의 균사생장은 kasugamycin의 농도가 높아짐에 따라서 억제효과도 상승하는 반면에, C. horii 15GKNJ2, 15GKSC1, 15GKYA1의 균사생장은 kasugamycin의 농도가 높아짐에도 불구하고 억제효과가 저조하였다. 실험에 사용한 균주들 중에서 53균주를 선발하여 100 μg/mL의 kasugamycin이 첨가된 PDA 배지에 접종하여 배양한 결과, kasugamycin의 억제효과가 60% 이상이 되는 균주와 30% 미만이 되는 균주들로 구분할 수 있었다(Fig. 9). 이처럼 kasugamycin과 DMI 살균제의 C. horii의 균사생장 억제효과 간에는 높은 상관관계가 인정되었는데, 작용기작이 다르지만 DMI 살균제에 대해서 저항성인 균주는 kasugamycin에 대해서도 저항성 반응을 보여 교차 저항성 관계에 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 8.

Inhibition rate of kasugamycin inhibiting protein synthesis against Colletotrichum horii causing persimmon anthracnose. The blue lines are sensitive isolates, and the red line are resistant isolates.

Fig. 9.

Inhibition ratio (%) of mycelial growth at 100 μg/mL of kasugamycin. The gray is sensitive isolates, and the black is resistant isolates. The resistant isolates to DMI fungicides have a resistance reaction in kasugamycin. A; distribution of inhibition rate of myceilal growth, B; Mycelial colony grown on PDA with or without kasugamycin.

전혀 다른 작용기작을 지닌 살균제 간에 교차 저항성이 인정되는 것을 보면, DMI 살균제에 대한 C. horii의 저항성 기작이 단백질 합성을 저해하는 kasugamycin과 관련이 있을 것으로 생각된다. DMI 살균제에 대한 식물병원곰팡이의 저항성 기작으로는 작용점인 CYP51 유전자 상에서 점 돌연변이가 발생하여 일어나는 아미노산 치환, CYP51 유전자의 과발현, ABC transporter에 의한 독성물질 배출 등이 알려져 있다(Sanglard et al., 1998; Parker et al., 2014). 아직 C. horii의 DMI 살균제에 대한 저항성 기작이 규명되어 있지는 않기 때문에, 여기에 대한 연구는 계속적으로 진행되어야 한다. 하지만 단백질 합성 저해 살균제인 kasugamycin과 교차 저항성이 인정되는 결과를 보면, 감수성과 저항성 균주간에 단백질 형성 과정에 차이가 있고, 이런 차이가 단백질 합성을 저해하는 kasugamycin에 대한 감수성에 차이를 보일 것으로 예상한다. 하지만 C. horii의 저항성 기작이 규명되어야, 작용기작이 다른 살균제 간의 교차 저항성을 설명할 수 있을 것으로 본다.

Kasugamycin과 tebuconazole의 혼합처리 효과

Tebuconazole과 kasugamycin에 대해서 감수성인 C. horii 15GKYD4를 사용하여 두 살균제를 혼합 처리하였을 때 효과를 조사하였다. Fig. 10에서 보는 것과 같이 tebuconazole과 kasugamycin을 처리한 여과지가 직각으로 교차되는 부분에서, 두 살균제를 혼합 처리하였을 때 단독으로 처리하는 것보다 높은 효과가 나타나는 첨가 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 이런 첨가효과는 저항성균인 C. horii 15GKNJ1의 경우에도 두 살균제를 각각 처리한 여과지의 교차 부분에서 약간의 clear zone을 확인할 수 있는 것을 보면 tebuconazole에 kasugamycin을 혼합할 경우 두 살균제가 독립적으로 병원균에 작용하기 보다는 첨가되는 효과가 나타날 것으로 생각할 수 있다.

Fig. 10.

Relationship between tebuconazole and kasugamycin on PDA. The horizontal filter paper was treated with 100 μg/mL of kasugamycin and the vertical filter paper with 0.5 μg/mL of tebuconazole. A; Colletotrichum horii 15GKNJ1 resistant to tebuconazole, B; C. horii 15GKYD4 sensitive to the fungicide, NT; no treatment with fungicides, T; treatment of kasugamycin and tebuconazole.

본 연구를 통해서 국내 감탄저병균인 C. horii의 DMI 살균제에 대한 저항성 발현이 처음 보고된다. DMI 살균제 저항성은 지역 간에 큰 차이가 있었는데, 이는 DMI 살균제처리 횟수와 관련이 있을 것으로 생각한다. 결국 현장에서 DMI 살균제 저항성을 관리하기 위해서는 단감 재배 지역에서 제한된 살균제 처리 체계가 확립되어야 하며, C. horii의 DMI 살균제 저항성 기작도 명확하게 규명되어야 할 것으로 보인다.