딸기 위황병원균 Fusarium oxysporum f sp. fragariae의 살균제 감수성 평가

서 론

딸기(Fragaria x ananassa Duch.)는 장미과에 속하는 식물로서 독특한 향기, 붉은 색의 과육과 수분이 많으며 단맛을 내는 작물로 알려져 있으며, 전 세계적으로 널리 재배되는 원예작물이다(Folta and Davis, 2006). 딸기는 고유의 맛과 향기, 비타민 C를 풍부하게 함유하고 있으며, 우수한 국산 딸기 품종의 육종, 재배기술의 발전 및 작형의 변화로 딸기 산업은 급속하게 확장되었고, 그 생산액은 12,843억 원에 이르고 있다. 국내에서의 딸기는 전체 채소 생산액의 10.7%을 차지하는 중요한 작물이며, 국내의 딸기 재배면적은 6,324 ha, 생산량은 203,772톤으로 세계 13위를 차지하고 있으며, 널리 재배되고 있는 딸기 품종으로는 설향, 매향, 금향 등이 있다. 이중 설향이 전체 재배 품종 중 51.8%를 차지하고 있다(Nam et al., 2011).

이러한 딸기에서 발생하는 병으로는 Fusairum oxysporum f sp. fragariae (Fof)에 의해 발생하는 위황병, Collectotrichum gloeosporioides에 의해서 발생하는 탄저병, Phytophthora fragariae에 의해서 발생하는 딸기 역병(Kim et al., 2015a; Jacobs et al., 2019), Botrytis cinerea에 의해서 발생하는 잿빛곰팡이병(Mohammad et al., 2015), Xanthomonas fragariae에 의해서 발생하는 세균모무늬병이 대표적이다(Kim et al., 2015b). 그 중 Fof에 의해서 발생하는 위황병은 병원균이 후막포자(Chlamydospore)를 형성하여 토양에서 생존력이 강하며 한국에서 딸기의 생산에 가장 영향을 끼치는 토양 매개 질병 중에 하나이다(Nam et al., 2008). 위황병이 발생 초기에는 새로 발달하는 잎이 황록색이 되거나 작아지며, 감염된 포기의 줄기를 잘라보면 도관이 갈변 되어 있고, 하엽은 시드는 증상을 보이게 된다(Nam et al., 2008). 위황병을 방제하기 위해서는 무병주를 도입하여 정식하거나 토양 훈증과 더불어 살균제를 사용하고 있으며(Matuo et al., 1980), 또 다른 방법으로는 토양 전염성 병을 차단하고 건전한 묘를 확보하기 위해 벤치 위에서 상토를 이용하여 재배하는 방식인 고설 수경재배로 육묘를 진행하고 있는 상황이다(Choi et al., 2016)

살균제로 사용되는 약제는 Dicarboximide계열의 코퍼하이드록사이드 수화제(Nam et al., 2011), Phenol ether계의 프로클로라즈망가니즈 수화제(Korea Crop Protection Association, 2011)과 Triazole계의 테부코나졸 수화제(Wang et al., 2015) 등이 있다. 테부코나졸과 프로클로라즈망가니즈는 딸기 재배지에서 흔히 사용되고 있으며 코퍼하이드록사이드는 딸기 재배지에서 토양 관주처리를 통하여 딸기의 여러 병해 방제에 사용되어지고 있다(Washington et al., 1992; Nam et al., 2011). 각 약제의 작용기작으로서 코퍼하이드록사이드 수화제는 Multi-site contact activity로 세포의 단백질을 파괴하여 살균력을 나타낸다고 알려져 있다(FRAC code list, 2018; Husak., 2015). 그리고 테부코나졸 수화제와 프로클로라즈망가니즈 수화제는 FRAC Group에서 demethylation inhibitor (DMI)에 속하는 살균제로 지질의 생합성을 저해하는 기작을 가지는 것으로 보고되어 있다. 특히 진균의 지질 생합성 중 일부 시토크롬 P450 (cytoP450)을 포함하여 에르고스테롤 생합성에 관련된 생물 전환 효소와 상호작용 하는 것으로 밝혀져 있다(Mateo et al., 2011).

본 실험에서는 국내 주요 딸기 재배 지역과 품종 그리고 병원균의 분리 위치에 따라 확보된 다양한 위황병원균 93개를 대상으로 코퍼하이드록사이드 수화제, 테부코나졸 수화제 그리고 프로클로라즈망가니즈 수화제의 EC₅₀ 값을 측정하였다. 이를 바탕으로 3가지 살균제에서 측정된 EC₅₀ 값과 생물학적 변수간의 상호관계 및 영향 정도를 분석하고 각 살균제 별로 어떠한 환경요인이 F. oxysporum f sp. fragariae의 농약에 대한 감수성에 영향을 미치는지 밝혀내고자 하였다.

재료 및 방법

딸기 위황병원균 배양 조건 및 EC₅₀ 산출

위황병원균 균주의 배양 조건으로는 9-cm Petri dish(SPL, Pocheon)에 1/5 감자한천배지(PDA, 24 g of potato dextrose broth, 20 g of agar/L)를 사용하여 계대배양 하였으며, 정체배양기에서 27^oC, 암 조건으로 5일간 배양하였다. 약제 저항성 실험은 6-well plate (SPL, Korea)에 감자한천배지와 살균제를 희석하여 분주하였으며, 각 플레이트에는 대조구(감자한천배지,살균제 무처리)와, 살균제 별 기준 농도 처리구를 포함하였다(Fig. 1A-C). 기준값 농도에 각각 100배, 10배 희석 농돠와 기준 농도의 10배, 100배로 농축된 살균제를 배지와 혼합 후 5 mL을 분주하였다(Fig. 1A-C). 코퍼하이드록사이드 수화제는 0 μg/mL, 0.0005 μg/mL, 0.005 μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.5 μg/mL, 5.0 μg/mL의 농도로 각각 5 mL씩 분주하였으며, 프로클로라즈망가니즈 수화제은 0 μg/mL, 0.00005 μg/mL, 0.0005 μg/mL, 0.005 μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.5 μg/mL의 농도로 5 mL씩 분주하였다. 테부코나졸 수화제 은 각각 0 μg/mL, 0.002340 μg/mL, 0.02340 μg/mL, 0.2340 μg/mL, 2.340 μg/mL, 23.40 μg/mL 의 농도로 5 mL 분주하였다. 이 후 Petri dish에 배양된 93개의 균주를 살균된 cork borer (diam. 0.4 mm)와 needle을 사용하여 절단하고 agar 조각을 배지에 접종한 뒤 27^oC 정체배양기에서 암조건으로 배양하였다. 6-well plate에서 대조구가 완전히 자라는 시점인 7일을 기준으로 하여 처리구의 지름을 4반복으로 측정하였다. 6-well plate의 지름이 3.5 cm이므로 지름의 절반인 1.75 cm를 EC₅₀의 기준으로 정하였다. 일반적인 직선 회귀분석식인 y = ax + b를 사용하여 y의 값을 1.75로 설정하였다. 이 후 EC₅₀값을 산출하였고 직선 회귀 분석은 R (version 3.6.1)을 이용하여 ggplot2의 stats package를 사용하여 실시하였다(Seber and Lee, 2003).

Fig. 1.

Fungicides resistance test and linear regression analyses of EC50 value (A ~ C). A strain was cultured on 6-well plate for7 days (n = 4, independent replication) (D ~ F). Linear regression with ggplot2 package of R (3.6.1) (G ~ H). All strains were cultured at 27oC in 1/5 PDA medium, and linear regression analysis was calculated with ggplot2 package of the R (3.6.1) program.

결과 및 고찰

딸기 산업이 급속하게 확장됨에 따라 딸기 재배 면적이 증가하고 있으며 약제를 이용한 병해 방제의 경우 초기 발병 시 농약을 살포하는 방식을 고수하고 있다(Kim et al., 2016). 이에 따라 화학적 방제의 오남용이 지속되어 살균제에 대한 저항성이 증가하고 있는 추세이다(Pincot et al., 2018). 딸기 위황병 방제에 사용 되어온 약제 중 테부코나졸과 프로클로라즈는 2016년 보고된 논문에 따르면 감 탄저병균에서(Collectotrichum horii) 저항성이 나타났다는 보고가 있었다(Kim et al., 2016). 2005년 채집된 균주에 비해 2015년 채집된 균주 중 절반 이상이 저항성 반응을 보였으며, 10년 전보다 살균제에 대한 병원균의 저항성 정도가 증가했다(Kim et al., 2016). 또한 테부코나졸의 살균제 저항성 기작으로는 살균제의 작용점인 CYP51유전자의 돌연변이와 CYP51유전자의 과발현, ABC transporter에 의한 약제 유출 등이 알려져 있다. 그 외에도 2007년 보고된 논문에서 dicarboximide fungicides에 속하는 코퍼하이드록사이드 에 대한 살균제 저항성이 보고 되었다(Kim et al., 2016).

이처럼 저항성 병원균의 지속적인 발생이 나타나고 있으므로 딸기 위황병원균 93개의 분리균주에서 약제 저항성 정도를 확인하기 위해 코퍼하이드록사이드 수화제(77%), 프로클로라즈망가니즈 수화제(50%), 테부코나졸 수화제(25%)를 대상으로 위황병원균의 생장을 확인하였다. 균사가 자라난 형태를 관찰 하였으며 그 중 코퍼하이드록사이드 수화제 함량이 높아질수록 균사의 생장이 부정형으로 자라는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 기존의 보고에 따르면 코퍼하이드록사이드 의 작용 기작으로 알려져 있는 세포 단백질의 비특이적 변성을 유발시킬 수 있다(Husak, 2015). 이에 근거하여 위황병원균의 세포막 단백질 형성 과정에 영향을 미쳐서 정상적인 생장이 이루어 지지 않았을 것으로 판단 된다.

이 후 살균제의 농도 별로 균주 생장을 직선 회귀분석을 사용하여 EC₅₀을 산출한 결과(Table 1), 코퍼하이드록사이드 수화제는 최소값으로 0.2188 μg/mL 농도로 확인되었고 최고값으로 0.3717 μg/mL, 프로클로라즈망가니즈 수화제는 0.2111 μg/mL이 최소값, 0.3292 μg/mL이 최고값으로 확인되었다(Table 1). 테부코나졸 수화제의 EC₅₀ 최소는 0.1926 μg/mL, 최대는 1.7301 μg/mL 농도가 나타났다(Table 1). 테부코나졸 수화제의 경우 다른 두 가지 약제에 비교하여 EC₅₀ 값의 범위가 넓게 나타난 것으로 보아 위황병원균 균주에 따른 약제에 대한 감수성의 차이가 큰 것으로 실험을 통해 확인되었다(Fig. 2). 각 약제에 따라 EC₅₀의 분포를 확인 하여본 결과 테부코나졸 수화제의 경우 좁은 정규분포가 확인되었으며, 다른 약제인 코퍼하이드록사이드 수화제와 프로클로라즈망가니즈 수화제는 넓은 정규분포 모양을 띄고 있었다(Fig. 2). 각각의 중앙값으로는 코퍼하이드록사이드 수화제는 0.2830 μg/mL, 프로클로라즈망가니즈 수화제는 0.2721 μg/mL, 테부코나졸 수화제는 1.184 μg/mL으로 나타났다(Fig. 2).

Table 1.

EC50 values for three fungicides of Fusairum oxysporum f sp. fragariae strains

Fig. 2.

Histogram of EC50 values for each fungicide. (A) Copper hydroxide WP, (B) Prochloraz Mn WP, (C) Tebuconazole WP. The gridExtra package of R (3.6.1) was used, and the red arrow line is the median of the EC50 value.

3가지 약제에 대한 93개 균주의 EC₅₀값을 환경 변수(분리 지역, 품종, 식물체에서의 병원균 분리 조직)와 ANOVA 분석을 실시하였다. 결과로 코퍼하이드록사이드 수화제는 Pr(>F)의 값이 0.0499로 99.9% 신뢰할 수 있다는 결과가 나왔으며, 프로클로라즈망가니즈 수화제의 경우는 환경 변수에 대해서 유의차를 확인할 수 없었다(Table 2). 테부코나졸 수화제의 Pr (>F) 값은 1.61e-0.3으로 매우 높은 신뢰 결과가 확인되었다(Table 2). 코퍼하이드록사이드 수화제와 테부코나졸 수화제는 유의차가 확인된 분리 지역에 대하여 지역간의 차이를 확인하기 위해 Duncan’s multiple range test(DMRT) 진행하였다. 코퍼하이드록사이드 수화제는 경남 하동, 충남 논산과 경남 수곡이 하나의 그룹으로 나타났으며 충북 부여와 경남 산청이 각각 다른 그룹으로 확인되었다(Fig. 3A). 테부코나졸 수화제에서 분리 지역간에 DMRT를 진행한 결과 하동, 산청과 수곡이 동일 그룹으로 확인되었고 부여와 논산이 다른 그룹으로 확인되었다(Fig. 3B). 병원균의 분리 지역, 딸기의 품종, 병원균이 분리된 식물체 조직에서 [지역]의 요소가 병원균의 약제 감수성 차이와 통계적으로 나타났다. 이러한 이유는, 지배 지역별로 사용된 농약의 종류와 사용량의 차이에 의해 나타난 결과로 사료된다.

Table 2.

ANOVA analyses of 93 strains EC50 values for three fungicides

Fig. 3.

Duncan's test results of Copper hydroxide and Tebuconazole for the location. (A) Copper hydroxide, (B) Tebuconazole. Duncan’s test with agricolae package from R (3.6.1) and different letters were show statistical significance by p<0.0001.

Fusairum oxysporum f sp. fragariae는 딸기에서 특이적으로 위황병을 야기 시키는 병원균으로 잘 알려져 있다(Kim et al., 2015a). 위황병 외에도 진균병 방제를 위해 화학적 방제가 과거부터 사용되어 왔으나 최근 약제의 오남용으로 인해 저항성 개체가 증가된다는 보고가 지속적으로 이루어 졌다(Pincot et al., 2018). 이에 외국의 경우 저항성이 보고된 약제들이 많지만 국내에서는 동일한 병원균에 대해 지속적으로 사용이 이루어져 왔으며 살균제 저항성에 관한 연구 결과는 부족한 실정이다(Kim, 2000). 본 연구에서는 국내에서 분리 된 93개의 위황병원균 균주를 이용하여 약제 저항성의 발달 정도와 다양한 환경 조건들 간의 상관관계를 분석 하고자 하였다. 이번 실험을 통하여 국내의 위황병 방제에 사용 되고 있는 3가지 살균제 중 테부코나졸 수화제 살균제에 대해서 병원균들의 저항성 정도가 가장 다양하게 확인되었으며 코퍼하이드록사이드 수화제와 테부코나졸 수화제는 분리 지역에 따라 병원균의 저항성 정도가 차이를 나타내는 것을 밝혀냈다. 이번 연구를 결과를 바탕으로 국내에서 딸기 위황병원균의 약제 저항성 발달 정도를 최초로 보고하는 바이며 병원균 개체들이 분리 지역에 의해서 유의차를 보였으므로 더 다양한 분리 지역을 추가하여 지역 간의 저항성 차이를 확인해 보는 실험이 필요하다고 판단된다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 차세대바이오그린21(PJ013250)과 농림수산식품기술기획평가원 농업생명산업기술개발사업(과제번호315004-5)의 지원에 의해서 이루어진 것임.

References

• Amini J, Dzhalilov FS, 2010. The effects of fungicides on Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici associated with Fusarium wilt of tomato. J. Plant Prot. Res. 50(2):172-178. [https://doi.org/10.2478/v10045-010-0029-x]
• Choi JM, Park JY, Latigui A, 2011. Impact of physicochemical properties of root substrates on growth of mother plants and occurrence of daughter plants in ‘Seolhyang’ strawberry propagation through bag culture. Korean J. Hortic. Sci. 29(2):95-101.
• Folta KM, Davis TM, 2006. Strawberry genes and genomics. Crit. Rev. Plant Sci. 25(5):399-415. [https://doi.org/10.1080/07352680600824831]
• FRAC code List, 2018. Fungicides sorted by mode of action (Including FRAC code numbering). Fungicide Resistance Action Committee. http://www.phi-base.org/images/fracCodeList.pdf, . accessed February 2018.
• Girden ER, 1992. ANOVA: Repeated measures (quantitative applications in the social sciences, Book 84), SAGE Publications. London, UK
• Husak V, 2015. Copper and copper-containing pesticides: metabolism, toxicity and oxidative stress. J. Va. Ste. Pre. 2(1):38-50. [https://doi.org/10.15330/jpnu.2.1.38-50]
• Jacobs RL, Adhikari TB, Pattison J, Yencho GC, Fernandez GE, et al., 2019. Inheritance of resistance to Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum in strawberry. Phytopathology 109(3):428-435. [https://doi.org/10.1094/PHYTO-08-18-0283-R]
• Kim CH, 2000. Current status and prospect of domestic fungicide resistance problems. Korean J. Pestic. Sci. 4(2):1-10.
• Kim DR, Gang GH, Cho HJ, Yoon HS, Kwak YS, 2015a. Evaluation of antimicrobial activity and disease control efficacy of sodium dichloroisocyanurate (NaDCC) against major strawberry disease. Korean. J. Pestic. Sci. 19(1):47-53. [https://doi.org/10.7585/kjps.2015.19.1.47]
• Kim DR, Gang GH, Cho HJ, Myung IS, Yoon HS, et al., 2015b. Development of control method for strawberry bacterial angular spot disease (Xanthomonas fragariae). Korean J. Pestic. Sci. 19(3):287-294. [https://doi.org/10.7585/kjps.2015.19.3.287]
• Kim JS, Kang NJ, Kwak YS, Lee C, 2017. Investigation of genetic diversity of Fusairum oxysporum f. sp. fragariae using PCR-RFLP. Plant Pathol. J. 33(2):140-147. [https://doi.org/10.5423/PPJ.FT.01.2017.0011]
• Kim SH, Baek DM, Min JY, Kim KY, Kim HT, 2016. Fungicide resistance of Colletotrichum horii against DMI family fungicides. Korean J. Pestic. Sci. proceeding p86.
• Korea Crop Protection Association, 2011. Guideline of Crop Protection Products, http://www.koreacpa.org, .
• Mateo EM, Valee-algarra FM, Mateo R, Jimenez M, Magan N, 2011. Effect of fenpropimorph, prochloraz and tebuconazole on growth and production of T-2 and HT-2 toxins by Fusarium langsethiae in oat-based medium. Int. J. Food Microbiol. 151(3):289-298. [https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.09.017]
• Matuo T, Komada H, Matsuda A, 1980. Fusarium disease of cultivated plants. (in Japanese). Zenkoku Noson Kyoiku Kyokai, Tokyo.
• Mirkovic B, Tanovic B, Hrustic J, Mihajlovic M, Stevic M, et al., 2015. Toxicity of copper hydroxide, dithianon, fluazinam, tebuconazole and pyraclostrobin to Didymella applanata isolates from Serbia. J. Environ. Sci. Health 50(3):175-183. [https://doi.org/10.1080/03601234.2015.982414]
• Mohammad IAM, Sharawi SM, Radwan MB, 2015. Effect of Clammy Inula (Inula viscosa) plant extract in combination with a low dose of the fungicides Iprodione on Botrytis cinerea in vitro and in vivo. Am. J. Plant Sci. 6(9):1519-1526. [https://doi.org/10.4236/ajps.2015.69151]
• Nam MH, Kim HS, Lee WK, Gleason ML, Kim HG, 2011. Control efficacy of gray mold on strawberry fruits by timing of chemical and microbial fungicide applications. Korean J. Hortci. Sci. 29(2):151-155.
• Nam MH, Park MS, Kim HG, Yoo SJ, 2008. Biological control of strawberry Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. fragariae using Bacillus velezensis BS87 and RK1 formulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 19(5):520-524. [https://doi.org/10.4014/jmb.0805.333]
• Pincot DA, Poorten TJ, Hardigan MA, Harshman JM, Acharya CB, et al., 2018. Genome-wide association mapping uncovers Fw1, a dominant gene conferring resistance to Fusairum wilt in strawberry. J. Gen. Soci. Am. 8(5):1817-1828. [https://doi.org/10.1534/g3.118.200129]
• Seber G, Lee AJ, 2003. Linear regression analysis second edition. Wiley series in probability and statistics. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, USA. [https://doi.org/10.1002/9780471722199]
• Wang Z, Cang T, Qi P, Zhao X, Xu H, et al., 2015. Dissipation of four fungicides on greenhouse strawberries and an assessment of their risk. Food Control 55:215-220. [https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.02.050]
• Washington WS, Shanmuganathan N, Forbes C, 1992. Fungicide control of strawberry fruit rots, and the field occurrence of resistance of Botrytis cinerea to iprodione, benomyl and dichlofluanid. J Crop Prot. 11(4):355-360. [https://doi.org/10.1016/0261-2194(92)90063-B]
• Yang H, Wang K, Kun F, Caihua L, Haiming D, et al., 2008. Biological characteristics of strawberry Fusarium wilt and inhibitory effects of seven fungicides. Act. Phys. Sci. 2008-02.