콩 균핵마름병을 일으키는 Macrophomina phaseolina에 대한 살균제 효과 검정

실험에 사용한 병원균

포장에서 균핵마름 증상을 보이는 콩, 참깨, 팥, 고추 등에서 분리한 M. phaseolina HSW16-141(콩), HSM16-108(참깨), HAB18-048(팥), HCV18-056(고추) 균주를 사용하여 살균제의 균사생장 억제실험과 온실에서 병 방제효과 실험을 진행하였다. 선발한 4개의 균주는 30^oC의 PDA (Potato Dextrose Agar) 사면 배지에서 배양한 후, 4^oC에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실험에 사용한 살균제

실험에 사용한 살균제는 Table 1과 같이 총 30종이었다. 각각의 살균제는 작용기작별로 세포 분열을 억제하는 3종의 살균제(나1군, 나2군), 미토콘드리아에서 세포호흡을 저해하는 11종 살균제(다2군, 다3군, 다4군, 다5군), 삼투압 신호전달을 저해하는 3종 살균제(마2군, 마3군), 에르고스테롤의 생합성을 저해하는 7종 살균제(사1군, 사3군), 그리고 보호살균제 5종(카군)과 혼합제 1종(나1군+사1군)을 선발하여 병원균의 균사생장 억제효과를 검정하였다. 본 실험에서 사용한 살균제 그룹은 농촌진흥청 농사로 사이트에 나와 있는 ‘국내 등록농약의 성분별 작용기작 분류 및 포장제 표시제’의 작용기작별 분류 기준을 따라서 사용하였다(Mode of action, 2020).

Table 1.

List of fungicides used in this study

살균제의 균사생장 억제효과

한천희석법으로 M. phaseolina의 균사생장 억제효과를 조사하였다. 모든 살균제는 PDA 배지에 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0 μg/ml가 되도록 첨가하였으며, 살균제를 첨가하기 전에 세균에 의한 오염을 방지하기 위해서 300 μg/ml의 streptomycin을 첨가하였다. 선발한 M. phaseolina 균주 4개를 30^oC의 PDA배지에서 3일간 배양하여 접종원으로 사용하였다. M. phaseolina의 균총 선단에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 준비한 살균제 배지에 균사 면이 배지 쪽으로 가도록 뒤집어서 접종하고, 30^oC에서 2일간 배양하였다. 살균제의 균사생장 억제효과는 살균제 첨가 및 무첨가 PDA배지에서 균총의 직경을 조사하여 아래 식으로 계산하였다.

처리한 각 살균제 농도의 균사생장 억제효과를 구한 후에 엑셀 프로그램을 이용하여 살균제 농도와 억제효과 간의 회귀직선을 구하였다. 회귀식을 이용하여 병원균의 균사생장을 50% 억제하는 농도를 구하여, 각 살균제의 효과를 비교하였다.

온실 검정에 사용한 병원균, 살균제와 기주식물

온실 검정에는 콩에서 분리한 M. phaseolina HSW16-141 균주를 사용하였다. 한천희석법의 결과를 참고로 하여 총 6종의 살균제를 선발하였는데, 선발한 살균제는 benomyl(a.i. 50%, WP), azoxystrobin (a.i. 21.7%, SC), fluazinam(a.i. 50%, WP), fludioxonil (a.i.20%, SC), tebuconazole(a.i. 20%, SC) 그리고 콩 자주무늬병과 점무늬병에 등록되어 사용되고 있는 thiophanate-methyl과 triflumizole 혼합제(a.i. 45%+15%, WP) 등이었다. 온실 검정에는 연풍콩을 사용하였다. 콩의 재배를 위하여 원예용 상토(부농 원예용 상토 하이 상토2호)를 121^oC에서 60분간씩 2회 멸균하여 플라스틱 폿트(직경; 6 mm, 높이; 5 mm)에 담고, 충분히 관수한 후, 폿트 중앙에 깊이 4 cm 정도의 구멍을 내어 콩 종자를 파종하였다. 콩 종자는 육안으로 건전한 연풍콩을 선별하여 2% NaOCl용액에 2분간 표면소독한 후, 증류수로 다시 3회 세척하여 사용하였다.

병원균 접종 및 병 발생

셀로판지를 121^oC에서 15분간 멸균한 후 PDA 배지에 올려놓고, 30^oC의 PDA 배지에서 3일간 배양한 M. phaseolina HSW 16-141 균사 선단에서 직경 7 mm의 균사 조각을 떼어내어 균사 면이 아래로 가도록 뒤집어서 셀로판지를 올려놓은 PDA 배지 중앙에 접종하였다. 병원균은 30^oC의 암조건에서 2일간 배양한 후, 균핵 형성을 촉진하기 위해서 25^oC로 옮겨서, 다시 7일간 암조건에서 배양하였다. 배지 위에 형성된 소립균핵을 멸균한 붓을 사용하여 조심스럽게 수확하고 멸균수를 부어 배지 위의 남은 소립균핵을 수거하였다. 수확한 균핵은 페트리 접시에 담은 후, 30^oC에서 4일간 건조시켰다. 수확한 소립균핵은 무게를 잰 후 4^oC에서 보관하면서 접종원으로 사용하였다. 준비한 병원균의 전염원은 콩 종자에 분의 처리하여 접종하였다. 종자 분의 접종을 위해서 연풍콩을 멸균수에 1시간 동안 침지한 후 꺼내어 표면의 수분을 제거하고, 종자 1개 당 접종원으로 준비한 소립균핵을 6.25 mg씩 분의 접종하였다. 접종한 콩은 준비한 폿트에 파종하고, 온실로 옮겨서 2일 후부터 관수하며 병 발생을 유도하였다.

발병도 조사

병원균을 접종하고 14일(제1본엽 출현기) 후에 발병 정도를 Table 2와 같은 발병지수로 조사한 후에 발병도를 계산하였다. 온실에서 M. phaseolina에 의한 균핵마름병의 발생은 Fig. 1에서 보는 것과 같이 병 발생 초기에는 콩의 떡잎에 갈변된 반점이 나타나기 시작하고, 시간이 지남에 따라서 병징이 나타난 떡잎이 탈락하였다. 병이 진전되면서 떡잎 부위 밑으로 줄기를 타고 수침상의 병징이 발생하다가 갈변하며 마르기 시작하였다. 심한 경우 유묘기에 잘록 증상을 보이며 고사하였다. 이 후 줄기의 마른 부위에 소립균핵이 형성되었다. 이런 일련의 발병 과정을 가지고 Table 2와 같은 발병지수를 만들어 병 조사를 실시하였고, 아래식으로 발병도를 계산하였다.

Table 2.

Disease index to assess charcoal rot caused by Macrophomina phaseolina

Fig. 1.

Disease index of charcoal rot caused by Macrophomina phaseolina. The numbers indicate the disease index do charcoal rot. The criteria for the incidence index are described in Table 2.

살균제 처리

선발한 6종의 살균제를 예방과 치료 처리하여 병 방제 효과를 검정하였다. 살균제의 예방처리를 위해서 파종 전에 콩 종자를 정해진 농도의 살균제 용액에 각각 1시간씩 침지하였다. 침지한 종자는 종이타월로 물기를 가볍게 제거하고 병원균의 소립균핵을 종자에 묻혀서 접종한 후, 파종하였다. 살균제 치료 처리는 파종 후 토양 관주처리로 진행하였는데, 콩 종자를 멸균수에 1시간 먼저 침지한 후 병원균을 분의 접종하고, 플라스틱 폿트에 파종하였다. 파종 후 접종원으로 사용한 소립균핵의 발아 등을 고려하여 2일간은 관수를 금지하면서 관리하였다. 파종 1일 후에 정해진 농도로 조제한 살균제 용액을 폿트 당 10 ml씩 관주 처리하였다.

M. phaseolina의 살균제에 대한 저항성 모니터링

모니터링에 사용한 살균제는 benomyl, fluazinam, metconazole을 사용하여 한천희석법으로 모니터링을 실시하였다. 실험에는 병든 콩, 참깨, 팥, 고추에서 분리한 총 65개의 M. phaseolina 균주를 사용하였다.

통계 처리

살균제 효과를 조사하기 위한 실험실과 온실 검정의 모든 처리는 3반복으로 진행하였으며, 각 처리별 평균간 차이를 분산분석하였고, 각 처리간의 차이는 Duncan’s multiple range test로 분석하였다(IBM SPSS Statistics 24).

살균제의 균사생장 억제효과

작용기작이 다른 30종의 살균제를 선발하여 PDA에서 균사생장 억제효과를 조사하였다(Table 3). Benzimidazole계 살균제가 속하는 나군의 균사생장 억제효과는 우수하였다. 세포호흡을 저해하는 다군의 살균제는 살균제의 작용점과 화학 구조에 따라서 효과에 차이가 있었다. 다군 살균제 중에서는 다5군인 fluazinam의 효과가 가장 우수하였는데, 실험에 사용한 4종의 M. phaseolina 균주에 대한 EC₅₀값이 모두 0.01 μg/ml 이하였다. 가장 낮은 처리 농도인 0.01 μg/ml에서 조차 콩에서 분리한 M. phaseolina HSW16-141의 균사생장을 73.3% 억제하였으며, 참깨에서 분리한 HSM16-108, 팥에서 분리한 HAB18-048, 고추에서 분리한 HCV18-056 균주에 대한 억제율도 82.1, 66.6, 82.5%이었다. 다2군과 다3군에 속하는 isopyrazam과 pyraclostrobin의 효과도 우수하였다. 동일하게 다2군과 다3군에 속하는 다른 살균제들의 EC₅₀값은 isopyrazam과 pyraclostrobin에 비하며 매우 높게 나타나 균사생장에 대한 억제효과가 낮음을 알 수 있었다. 하지만, Kumar et al. (2016)은 trifloxystrobin을 tebuconazole과 혼합하여 만든 혼합제(a.i. 25%+ 50%, WG)를 M. phaseolina에 25 μg/ml을 처리하였을 때, 균사생장 억제효과가 76.3%이었으며, 15 μg/ml에서는 60.4%에 지나지 않았지만, 입자의 직경이 1.3-3.0 μm이었던 혼합제의 입경을 108-130 nm의 나노 입자 크기로 만들어 M. phaseolina에 처리하였을 경우, 균사생장 억제효과가 상승하여 25 μg/ml와 15 μg/ml에서 억제효과가 100%와 99.6%까지 상승하였다고 보고한 바 있고, 이러한 결과는 살균제의 입자 크기를 나노 입자 크기로 제조하여 병원균에 처리하게 되면, 기존의 살균제와는 다르게 M. phaseolina의 균사와 소립균핵에 미세한 입자가 부착하여 형태적인 이상이 초래되면서 살균제의 효과가 상승한 것이라고 해석하였다. 이 결과는 살균제의 제형이 병원균 억제에 효과를 미칠 수 있다는 결과이기 때문에 다양한 제형에서의 연구가 필요할 것으로 본다. 다군 중에서 다4군 살균제인 cyazofamid와 amisulbrom의 효과는 매우 저조하였다. 신호전달체계에 작용하는 마군 살균제인 fludioxonil, iprodione, procymidone의 효과는 우수하였으며, 특히 마2군인 fludioxonil의 효과가 우수하였다. 사군 살균제는 사3군인 fenhexamid와 사1군에 속하는 fluquinconazole을 제외한 나머지 살균제의 균사생장 억제효과는 우수하였다. 카군인 보호살균제 중에서 iminoctadine tris-albesilate와 chlorothalonil의 균사생장 억제효과는 우수하였지만, 나머지 다른 살균제의 균사생장 억제효과는 저조하였다. 한천희석법을 이용한 본 연구를 통해서 다양한 기작의 살균제가 M. phaseolina의 생장을 억제하는 것을 알 수 있었다. 실내 검정의 결과가 포장에서 효과와 부합하지 않는 경우도 있지만, 새롭게 문제가 되는 병원균에 대한 우수한 방제제를 개발하기 위해서는 좋은 정보가 될 것이라고 생각한다.

Table 3.

EC50 values (μg/ml)a of fungicides against Macrophomina phaseolinab isolated from several crop plants

온실 실험을 통한 살균제 효과 검정

온실 검정에서는 병든 콩에서 분리한 M. phaseolina HSW16-141을 사용하여 종자 분의 접종 하였으며, 모든 살균제는 병원균을 접종하기 전과 후에 종자 침지와 토양 관주를 통하여 각각 예방 및 치료 처리하였다. 병원균을 종자분의 접종한 경우 무처리구의 발병도는 42%이었다. 병원균을 접종하기 직전에 살균제 용액에 종자를 침지 처리한 경우, fludioxonil을 제외한 모든 살균제는 가장 낮은 처리농도였던 1.0 μg/ml에서도 80% 이상의 병 방제 효과를 보였다(Fig. 2). 병원균을 종자에 분의 접종하여 파종한 후, 살균제를 토양에 관주처리한 경우에는 종자를 살균제 용액에 침지 처리하였을 때보다 방제효과가 감소하였다. 100 μg/ml의 benomyl, fluazinam, fludioxonil의 효과는 60% 미만으로 감소하였지만, 100 μg/ml의 azoxystrobin, tebuconazole, thiophanate-methyl과 triflumizole 혼합제의 병 방제 효과는 78, 84, 73%이었다.

Fig. 2.

Control activity of 6 fungicides against the charcoal rot caused by Macrophomina phaseolina. Fungicides were treated by soaking soybean seeds for 1 hour in the fungicide solution one day before the inoculation of the pathogen, or they were poured into the soil by 10 ml/pot one day after sowing soybean seed inoculated with the pathogen. The investigation of disease incidence was conducted 14 days after inoculation. All treatment values were marked with standard deviation. The bar with the same letter on it is not significantly different P < 0.01 by Duncan’s multiple range test.

콩 균핵마름병균인 M. phaseolina는 토양 병원균이다. 일차 전염원은 토양 중이나 오염된 종자, 또는 병든 식물체에 생존하는 소립균핵으로, 28-35^oC의 온도에서 발아하며 식물체 뿌리의 표피를 침입한다(Kaur et al., 2012). 포장에서 균핵마름병이 발생하는 양상을 고려한다면, 병원균을 종자 분의 접종하는 방법이 포장 발병 양상과 유사할 것이기 때문에, 살균제의 효과를 검정할 때에도 종자 분의 접종법이 적합할 것으로 생각한다. 종자 분의 접종법을 이용한 살균제 검정에서 azoxystrobin과 tebuconazole은 종자 침지와 토양 관주 처리에서 모두 우수한 효과를 보였다. 하지만 tebuconazole의 경우에는 모든 처리구에서 콩의 생장이 심하게 저해되는 약해 증상을 보여 병 방제를 위해서 종자 처리나 유묘에 토양 관주 처리용으로 사용하는데 한계가 있었다. 하지만 azoxystrobin과 같이 strobilurin계에 속하는 살균제는 종자 처리 및 토양 관주 처리에 사용이 가능할 것으로 생각한다. Bradley (2008)도 2003년과 2004년에 걸쳐서 11개소의 실험 포장에서 strobilurin계 살균제인 azoxystrobin과 metalaxyl 혼합제를 콩에 종자 처리한 결과, 5개소 이상의 포장에서 뿌리에서 병반 형성이 억제되었고, 콩 생산량이 증가하였다. 또한 trifloxystrobin과 metalaxyl, azoxystrobin과 mefenoxan, fludioxonil 혼합제를 콩에 종자 처리하였을 때, Pythium sp, Rhizoctonia solani 등과 같은 종자와 토양 전반하는 병원균의 방제가 가능하였다(Urrea et al., 2013). Strobilurin계 살균제는 종자 처리뿐만 아니라 토양 관주 처리에서도 사용하는 경우가 있다. Azoxystrobin을 토양에 관주 처리한 결과, 딸기 leather rot과 감자 검은무늬썩음병(black scurf)에 대한 방제 효과가 우수하였다(Rebollar-Alviter et al., 2005; Rahman et al., 2016). 하지만 azoxystrobin을 토양에 처리할 경우 토양 중에 서식하는 진균의 다양성을 파괴할 수 있는 가능성이 있기 때문에 토양에 직접 처리하는 것은 여러 실험을 통해서 결정하는 것이 타당할 것으로 본다(Adetutu et al., 2008; Vuyyuru et al., 2018). 하지만 종자 침지 처리의 효과를 검정하기 위한 처리 시간, 처리 후 병원균 접종 시간과 방법 등에 대해서는 많은 연구를 진행한다면 더 효율적인 처리 방법을 제공할 수 있을 것으로 생각한다.

M. phaseolina의 살균제에 대한 저항성 발현

나군, 다군, 사군에 속하는 benomyl, fluazinam, metconazole 등 3종의 살균제를 선발하여 여러 기주식물에서 분리한 병원균 중에서 저항성균의 존재 여부를 조사하였다.

Fig. 3에서 보는 것과 같이 benomyl, fluazinam, metconazole에 대한 평균 EC₅₀값은 0.202 μg/ml (0.131-0.290 μg/ml), 0.030 μg/ml (0.027-0.048 μg/ml), 0.229 μg/ml (0.193-0.415 μg/ml)였으며, 모든 살균제에서 저항성균의 출현은 없었다. 기존에 benomyl은 다양한 식물병원균에서 저항성균의 발현이 보고되어 있어, 만약 benomyl에 대해서 저항성균인 M. phaseolina가 발견된다면, 콩 균핵마름병 방제를 위해서 benomyl을 토양 관주 처리용 살균제로 사용하기 어렵게 된다. 하지만 화성, 연천, 정읍, 당진, 김제, 부안, 남해 등에서 채집한 병든 콩, 참깨, 팥, 고추로부터 분리한 64개 균주에 대한 저항성 검정을 실시한 결과를 보면, benomyl에 대한 저항성균이 발견되지 않았고, Fig. 2에서 보는 것과 같이 100 μg/ml의 benomyl을 병원균을 접종한 후에 토양 관주처리하여, 우수한 치료 효과를 얻을 수 있었기 때문에, benomyl을 토양 관주용 살균제로 사용할 수 있을 것으로 생각한다.

Fig. 3.

Distribution of EC50 values of Macrophomina phaseolina against a fungicide as benomyl, fluazinam and metconazole. X marks mean EC50 values of all isolates of M. phaseolina tested for each fungicide.

콩 균핵마름병은 최근 기후 변화와 관련되어 새롭게 문제병으로 떠오를 가능성이 많다. 이미 미국 남부 지역에서는 2010년부터 2012년까지 연 3년간 M. phaseolina가 일으키는 charcoal rot에 의한 콩 생산량 감소 피해가 가장 컸다는 보고가 있으며(Allen et al., 2017), 국내의 기후도 점점 고온건조해지면서 M. phaseolina처럼 고온 건조한 조건에서 새로운 병을 유발할 수 있는 병원균의 밀도가 높아질 것으로 판단한다. 따라서 새롭게 문제 병으로 발전할 가능성이 높은 병에 대한 포장 조사와 새로운 방제의 방법, 적용 가능한 살균제의 선발과 효과 검정 등에 대한 현장의 연구가 필요해지고 있다. 본 연구는 이런 점에서 새롭게 보고한 고온성 식물병인 콩 균핵마름병에 대한 방제 살균제를 선발하여 실험실과 온실에서 실험하였고 선발하여 실험하였고, 병 방제를 위해서는 종자 침지 처리와 토양 관주 처리가 중요하며, 총 30개 살균제 중에서 azoxystrobin의 효과가 우수하다는 결과를 얻었다. Azoxystrobin은 다3군에 속하는 살균제인데, Table 3에서 보면 동일한 다3군의 살균제 중에서 pyraclostrobin과 trifloxystrobin의 균사생장 억제효과가 azoxystrobin보다 우수하였다. 따라서 더 우수한 살균제를 선발하기 위해 다3군의 다른 살균제를 이용하여 온실과 포장에서의 병 방제 효과를 검정해야 할 것으로 생각한다.